Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak
30 Ocak 2019
Endotoxins mühendislik Nanomalzemeler içinde tespiti nanomedicine alanında büyük zorluklardan biri temsil eder. Burada, nano tanecikleri potansiyel endotoksin kirlenme tahmin etmek için üç farklı biçimlerinin LAL oluşan çerçeve açıklar bir örnek çalışma mevcut.
Bu yöntem nano ilaçların güvenliği hakkında tıbbi alanda cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajları standart olmasıdır, ve ürünlerin değerlendirilmesi için dünya çapında kullanılan, nano ilaçlar için. Prosedürün tanıtımı, Barry Neun, Nano Teknoloji Karakterizasyon Laboratuvarı'nda olacak.
Kalibrasyon standardı nahazırlık için 900 mikrolitre limulus amebocyte lysate veya LAL sınıfı su kullanın. Ve kontrol standart endotoksin 100 mikrolitre, gerektiği kadar ara seyreltme hazırlamak için, mililitre başına bir endotoksin birimi konsantrasyonu ile bir kalibrasyon standardı hazırlanmasını sağlamak için. Sonra 900 lal sınıf su mikrolitre kullanarak, ve mililitre kalibrasyon standardı başına bir endotoksin birim 100 mikrolitre, mililitre başına 0.1 endotoksin birimi konsantrasyonu ile ikinci bir kalibrasyon standardı hazırlamak.
Daha sonra iki daha düşük kalibrasyon standardı hazırlamak için seri on kat seyreltme tekrarlayın. Mililitre başına 0001 ile bir endotoksin ünitesi arasında değişen toplam dört kalibrasyon standardı elde etmek için. Mililitre kalite kontrolü başına 05 endotoksin birimi hazırlamak için, kontrol standart endotoksin çözeltisinin mililitre başına bir endotoksin ünitesinin 50 mikrolitresini, 950 mikrolitre LAL sınıfı su ile birleştirir.
Yazılımda sonraki araç ayarlarını seçin ve şablonu oluşturun. Veri topla'yı seçin ve genel sekmeye test kimliği ve veri grubunu girin. Donanım sekmesinin altında, enstrüman türünü ve LAL yöntemini seçin ve ekranda bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgilerinin göründüğünü doğrulayın.
Cihaz seçimini ve cihazla iletişimi onaylamak için iki kez tamam'ı tıklatın ve örnek kimliği örneklerin test edeceği sırayla girin. Ardından negatif denetim standart eğrisini girmek ve örnekleri test etmek için varsayılan düğmeleri kullanın. Yinelenen önceden etiketlenmiş cam tüplere uygun negatif kontrol kalibrasyon standartlarını ve kalite kontrolünü ekleyin.
Ve ilk test aşağılık IÇIN LAL uygun hacmi ekleyin. Kısa bir süre aşağılık girdap ve alet atlıkarınca uygun test yuvaları içine şişe yerleştirin. Numuneleri yüklemeden önce, test nano malzemenin gösterildiği gibi maksimum geçerli seyreltme içinde birkaç seyreltme gerçekleştirin.
İnhibisyon geliştirme kontrolü mililitre başına 05 endotoksin birimi hazırlamak için, kontrol standart endotoksin çözeltisinin mililitre başına bir endotoksin biriminin 25 mikrolitrebirleştirmek, belirli bir seyreltme test nano malzemenin 475 mikrolitre ile. Girdap tan sonra, uygun yenilik geliştirme kontrollerini ve çivilenmemiş çalışma örneklerini cihaza yükleyin. Sonra aliquot unspiked ve önceden etiketli tüpler içine belirli bir seyreltme çivili nano malzemeler.
Girdap önce, ve alet atlıkarınca içine yükleme. Bir Jel-Pıhtı LAL gerçekleştirmek için, dört lambda son konsantrasyoniçin kontrol standart endotoksin hazırlamak, ve standart 100 mikrolitre birleştirmek, su 100 mikrolitre ile, ya da test örneği kontrol standart endotoksin iki lambda nihai konsantrasyon elde etmek için. Her lambda seyreltme için Lizin 100 mikrolitre ekleyin.
Girdap tüpler kısaca, ve bir saat için 37 derece santigrat su banyosu içine tüplerin raf yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüpleri düzgün bir hareketle ters çevirin ve sonuçları sıkı bir pıhtı için artı kullanarak elle kaydedin ve pıhtı veya gevşek pıhtı için eksi. Bu temsili analizde, PEGylated lipozomal doksorubisin seyreltme beş kromojenik LAL ile müdahale, ancak bu girişim yüksek seyreltme üstesinden gelindi.
Formülasyon bulanıklık ve kromojenik LAL'de 50 ve 500 seyreltmelerde test edildiğinde ve seyreltme beşinde, bulanıklalalırken %50 ile %200 arasındaydı. Seyreltme faktörüne göre ayarlandığında, sonuçlar her iki denemede de sanrılar arasında tutarlıydı. Ayrıca, sonuçlar üç kompozisyon biçimleri arasında tutarlı idi.
Her numunenin kendi seyreltme aralığına sahip olduğunu, her LAL biçiminin doksin ve lysate'de kendi kontrol standardını kullandığını ve seyreltmeleri hazırlamak için kullanılan tüplerin her LAL denemesi için farklı bir reaksiyon gerçekleştirdiğini unutmayın. Bu işlem için malzeme ile ilgili ek soruları cevaplamak için can gibi diğer yöntemler geliştirildikten sonra, bu teknik dikişler ve nano tıp alanında, nano teknoloji insanlarda formüle edilen ilaçların tıbbi uygulamaları keşfetmek için önünü açtı ve dahil ancak insan olmayan primatlar, tavşanlar, köpekler ve sıçanlar ile sınırlı olmamak üzere klinik modeller. Doksin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman takmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, nanotıpta kritik bir konu olan mühendislik ürünü nanomalzemelerde endotoksinlerin tespit edilmesi zorluğunu ele almaktadır. Nanopartiküllerdeki potansiyel endotoksin kontaminasyonunu değerlendirmek için üç farklı LAL formatının kullanıldığı bir çerçeve sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nanotıp
- Endotoksin tespiti
- Nanopartikül güvenlik değerlendirmesi
Arka Plan
- Endotoksinler, nanomalzemelerin tıbbi uygulamalarında önemli riskler oluşturabilir.
- Endotoksin saptama yöntemleri, nanoiçlerin güvenliğinin sağlanması açısından kritik öneme sahiptir.
- Limulus amebosit lizatı (LAL), endotoksin testlerinde yaygın olarak kullanılan bir reaktiftir.
- Nanopartiküllerdeki kontaminasyon seviyelerinin anlaşılması, mevzuat uyumluluğu için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Mühendislik ürünü nanomalzemelerdeki endotoksin kontaminasyonunu tahmin etmek için güvenilir bir çerçeve geliştirmek.
- Nanoparçacık güvenliğini değerlendirmede LAL formatlarının uygulanmasını göstermek.
- Alandaki araştırmacılar için standartlaştırılmış bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- LAL ve kontrol standart endotoksin kullanılarak kalibrasyon standartlarının hazırlanması.
- İstenen konsantrasyonlara ulaşmak için ara seyreltmelerin oluşturulması.
- Prosedürün yetkin bir araştırmacı tarafından gösterilmesi.
- Hassas testler için LAL kalite suyunun kullanılması.
Temel Sonuçlar
- Geliştirilen çerçeve, nanopartiküllerdeki endotoksin seviyelerinin etkili bir şekilde tahmin edilmesine olanak tanır.
- Standartlaştırılmış yöntemler, güvenlik değerlendirmelerinin güvenilirliğini artırır.
- Prosedürün gösterimi, gerçek dünya senaryolarındaki uygulanabilirliğini doğrulamaktadır.
- Sonuçlar, nanotıpta titiz testlerin önemini göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nanomalzemelerde endotoksin tespiti için değerli bir yaklaşım sunmaktadır.
- Standartlaştırılmış test yöntemleri, nanotıbbın güvenliğini ilerletmek için esastır.
- Bu yöntemleri geliştirmek ve kapsamlı güvenlik değerlendirmelerini sağlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Endotoksin tespiti, nano-formülasyonların standart analizleri etkileyebildiği ve ürün güvenliğini tehlikeye atabildiği nanotıp geliştirmede kritik bir kalite kontrol adımıdır. LAL analizi, nanopartikül tabanlı ilaç ürünlerinde, aşılarda ve adjuvanlarda endotoksin kontaminasyonunu nicelendirmek için standartlaştırılmış ve küresel olarak kabul görmüş bir yöntem sunar. Güvenilir endotoksin testleri, keşif sürecinin erken aşamalarında inflamatuar risklerin belirlenmesini sağlayarak düzenleyici uyumluluğu destekler ve preklinik ilerlemedeki riskleri azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulama çalışmalarını karıştırabilecek endotoksin kaynaklı inflamatuar artefaktların tespit edilerek nanomalzeme güvenlik profillerinin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Erken taramalarda, gerçek farmakolojik etkilerin endotoksin kaynaklı yanlış pozitiflerden ayırt edilmesi için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Nano-formüle edilmiş bileşik kütüphanelerinde düşük endotoksin seviyelerini onaylayarak, sonraki taramalar için nitelikli biyolojik sistemlerin hazırlanmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Analiz standardizasyonunu ve platformlar arası karşılaştırılabilirliği sağlamak için türbidimetrik, kromojenik ve jel-pıhtı LAL formatlarında kantitatif ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilgili sistemlerin endotoksin kaynaklı inflamasyonla bozulmamasını sağlayarak, translasyonel modellerde mekanistik risk azaltımını korur.
- Operasyonel Değer: Keşif, preklinik ve klinik materyal partileri genelinde tutarlı endotoksin kantifikasyonu sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
LAL analizi, erken nanomalzeme sentezini takip eden ve hastalık modellerindeki biyolojik değerlendirmeden önce gelen bir güvenlik kontrol noktası olarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Hedef doğrulama analizlerinde gözlemlenen biyolojik aktivitenin endotoksin kontaminasyonuna bağlı olmadığını teyit ederek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Nano-formüle edilmiş kütüphanelerde güvenilir bileşik değerlendirmesi ve hit seçimine olanak tanıyan standartlaştırılmış endotoksin ölçümleri sunar.
- Analitik: Üç farklı LAL formatından kantitatif endotoksin birimi/mL okumaları üreterek, ekiplerin formülasyonlar ve dilüsyon serileri arasındaki kontaminasyon seviyelerini karşılaştırmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Test maddelerinin in vivo çalışmalardan önce endotoksin eşik değerlerini karşılamasını sağlayarak, nanomalzeme güvenlik değerlendirmesini preklinik süreklilikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Nanotıp projeleri, aşılar ve adjuvan geliştirme programları genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir endotoksin test platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Farmakolojik ve immünolojik analizlerde endotoksinin karıştırıcı bir değişken olarak ortadan kaldırılmasıyla mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Birden fazla LAL formatı ve nanomalzeme türünde endotoksin tespitinin standartlaşmasını, tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Erken güvenlik verileri sağlayarak "devam/durdur" kararlarını iyileştirir, geç aşama biyolojik kayıpları ve sermaye verimsizliğini azaltır.
- Portföy Etkisi: Niceleştirilmiş endotoksin profilleri ve spike geri kazanım performansına dayalı olarak nano-formülasyonların risk temelli önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Endotoksin analiz prensipleri, nanomalzeme kullanımı ve girişim azaltma stratejileri konusunda uzmanlık gerektirir.
- LAL reaktiflerine, kalibre edilmiş cihazlara (örneğin, mikroplaka okuyucular, inkübatörler) ve endotoksin içermeyen suya ve laboratuvar malzemelerine erişime bağlıdır.
- Seyreltme protokollerinin, kontrol eklemelerinin (negatif, pozitif, inhibisyon/artırım) ve bulanıklık, kromojenik ve jel-pıhtı formatlarındaki sonuç yorumlamalarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- LAL reaktivitesini etkileyebilecek ve özelleştirilmiş seyreltme aralıkları gerektirebilecek çeşitli nanomalzeme özelliklerine (örneğin, yük, boyut, yüzey kimyası) yönelik adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Nanopartikül kaynaklı analiz girişimleri (artırım veya inhibisyon) gibi, çalışmada gösterildiği üzere seyreltme optimizasyonu ve spike geri kazanım kontrolleri ile giderilmesi gereken pratik kısıtlamaları kapsar.
