Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler
20 Ocak 2019
Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.
Bu yöntem, yaşlanma ve kronik hastalıkların gelişimi sırasında serebral kan akımı regülasyonu ile ilgili olarak serebral vasküler fizyoloji alanında anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, fizyolojik koşullar altında doğal formda serebral arteriyel endotel hücre içi kalsiyum ve membran potansiyelinin eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlamasıdır. Fare beyin izole etmek için, mikroskop altında kafatası üzerinde deri ve saç kaldırın.
Ve soğuk kalsiyumiçermeyen PSS ile aşırı kan çıkarın. Daha sonra, standart diseksiyon makas sadece ipuçlarını kullanarak bir kesi olun. Oksipital kemikten başlayıp kafatasının burun kemiğine kadar uzanıyor.
Sonra kesi boyunca kafatasını dikkatlice açın, kaba uçlu çalgılar kullanarak ve beyni ortaya çıkarmak için bağ dokusunu ayırın. Yavaşça kan kaldırmak için bir kabın soğuk kalsiyumsuz PSS ile izole beyin yıkayın. Beyin ventral tarafı kadar serebral arterlerin izolasyonu için soğuk diseksiyon solüsyonu içeren bir odaya yerleştirin.
Serebral arterleri izole etmek için, soğuk diseksiyonu çözeltisi içinde iki paslanmaz çelik pim leri içine yerleştirerek izole beyni cam petri kabının altına kömürle aşılanmış silikon polimer kaplamaya yerleştirin. Daha sonra, cerrahi posterior iletişim ve baziler arterler yaklaşık 0.3 0.5 santimetre segmentleri posterior serebral arterler izole. Petri kabındaki diseksiyon çözeltisinde izole arka serebral arterleri güvence altına almak için paslanmaz çelik pimleri kullanın.
Sonra keskinleştirilmiş ince uçlu forceps kullanarak bağ dokusu kaldırarak dikkatle izole posterior serebral arterler temizleyin. Enzimatik sindirim için bir ila iki milimetrelik segmentlere bozulmamış arterler kesin. Bu işlemde, bir mikroskop, bir kamera ve bir oda ve mikromanipülörler tutan bir alüminyum sahne kullanarak triturasyon cihazı hazırlamak.
Sahneye ve numuneye bitişik bir pompa denetleyicisi ile bir mikroşiniş sabitlayın. Sonraki tamamen mineral yağ ile bir titrasyon pipet backfill ve microsyringe piston üzerinde sabit. Daha sonra pompa denetleyicisi ile mikroşiniş kullanarak hava kabarcıkları olmamasını sağlarken pipet içine dissociation çözeltisi yaklaşık 130 nanolitre çekin.
Daha sonra, 10 mililitrelik cam tüp enzimlerin gerekli konsantrasyonları ile ayrışma çözeltisi bir mililitre içine bozulmamış arteriyel segmentleri yerleştirin. Kısmi sindirim için 10 ila 12 dakika boyunca 34 santigrat derecede kuluçka. Sindirimden sonra, enzim çözeltisini beş mililitre taze dissosiasyon çözeltisi ile değiştirin.
Bir mililitrelik pipet kullanarak, oda sıcaklığında dissosilasyon çözeltisi içeren odaya bir segment aktarın. Daha sonra pipeti bölmedeki dissociation çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş kabın bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Hafif triturasyon için pompa denetleyicisinde saniyede iki ila beş nanolitre aralığında bir hız ayarlayın.
100 kez ilerlerken 200 kez büyütme geri çekilme ve bir endotel tüpü üretirken düz kas hücrelerini ayırmak için arteriyel segmenti çıkarmak. Gerekirse, endotel tüpünden ayrı ayrı adventitia ve iç elastik lamina ayırmak için ince uçlu forceps dikkatle kullanın. Tüm düz kas hücrelerinin ayrıştırılmış olduğunu ve sadece endotel hücrelerinin sağlam tüp olarak kaldığını doğrulayın.
Mikromanipülatörler kullanarak, borosilikat cam sabitleme pipetleri kullanarak süperfüzyon odasının cam kapak fişinde endotel tüpün her iki ucunu sabitlayın. Ayrık adventitia ve düz kas hücrelerini odadan temizle. Ve iki azı daha kalsiyum klorür PSS ile dissosyation çözeltisi değiştirin.
Güvenli endotel tüpü ile mobil platformu süperfüzyon ve deneysel teçhizatın mikroskobuna aktarın. Daha sonra deney sırasında PSS ve ilgili ilaç çözümlerinin sürekli teslimatı için altı temiz 50 mililitrelik rezervuar kullanın. Akış beslemesini vakum emmeyle eşleştirirken akış hızını laminer akışı kadar tutarlı olarak manuel olarak ayarlamak için sıra içi akış kontrol valfini kullanın.
PsS'i arka plan verilerini ve boya yüklemesini kaydetmeden önce en az beş dakika boyunca endotel tüpünün süperfüzyonu için hazneye teslim edin. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile aynı anda membran potansiyelini ölçmek için, keskin bir elektrot çekin ve fura-2 boya yüklü hücrelerden kaydetmek için iki molar potasyum klorür ile geri doldurun. Boya transferi ile hücre içi kaplini incelemek için mikroelektrotı iki molar potasyum klorürde çözünmüş %0.1 propidium iyodür ile doldurun.
Sonraki yer bir mikromanipülatör ile güvenli bir elektrometre baş aşamasına bağlı pipet tutucu klorür ile kaplı gümüş bir tel üzerinde elektrot. Dört kat hedefi incelerken elektrotun ucunu odadaki akan PSS'ye kısa bir süre konumlandırmak için mikromanipülörü kullanın. Daha sonra, topraklanmış banyo potansiyeli ile tutarlı olarak sıfıra dinlenme membran potansiyeli ayarlayın.
İstenirse, ses perdesini potansiyel kayıtlarla ilişkilendirmek için elektrometrelere bağlı duyulabilir taban çizgisi monitörleri kullanın. Daha sonra, 40 kat objektif kullanarak büyütme artırmak 400 kez ve endotel tüpü hücre nin hemen üzerinde elektrot ucu konum. Fotometri yazılımını kullanarak fotometrik pencereyi yaklaşık 50 ila 80 endotel hücresine odaklanmak için ayarlayın.
Daha sonra elektrodu mikromanipülatör kullanarak endotel tüpü hücrelerinden birine nazikçe yerleştirin ve istirahat membranı potansiyelinin dengelenmesine en az iki dakika bekleyin. Dinlenme membranı potansiyeli beklenen değerde sabit olduğunda, ışığın yokluğunda floresan arabirimindeki fotoçarpan tüpünü açın ve 510 nanometrede floresan emisyonunu toplarken 340 ve 380 nanometrede heyecan verici Fura-2 ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu elde etmeye başlayın. Membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu eşzamanlı ölçümler ilerler, ilaçların uygulanmasından önce sabit bir laminar akış hızında PSS ile endotel tüpsüperfüzyonu için yaklaşık beş dakika bekleyin.
PSS'de hazırlanan ilacı sabit bir akış hızında süperfüzyon odasına uygulayın. İlaç tedavisi sırasında F340/F380 oranlarındaki membran potansiyeli eş zamanlı olarak ölçülür. Deney yapıldıktan sonra, elektrot hücreden çekilin.
Daha sonra membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile ilgili kayıtları durdurun ve dosyaları veri analizine kaydedin. Bu bir fare serebral arteriyel endotel tüpü bir diferansiyel girişim kontrast görüntü, fotometrik pencerede deney için ayarlanmış 40 kat objektif kullanarak. Keskin bir elektrot, görüntünün üst kısmında gösterildiği gibi bir hücreiçine yerleştirilir.
Burada 100 mikromolar ATP yanıt f340/F380 oranı ve membran potansiyeli eşzamanlı ölçüm için ham iz örnekleridir. Bu işlemin ardından, konfokal floresan mikroskopi gibi diğer yöntemler, örnek olarak endotel kalsiyumunun mikroetki alanı sinyali ve reaktif oksijen türleri ile ilgili ek soruları cevaplamak amacıyla gerçekleştirilebilir. Genel olarak bu teknik, kan ve lenf atik dolaşımda vasküler fonksiyon ve yaşlanmayı keşfetmek için hücresel fizyoloji araştırmaları için önünü açmak için devam edecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, sağlam serebral endotelyal tüplerin izole edilmesi ile endotelyum kaynaklı hiperpolarizasyon sırasında endotelyal kalsiyum ve membran potansiyelinin ölçülmesine yönelik protokolleri detaylandırmaktadır. Kalsiyumu ve elektriksel sinyallemeyi farmakolojik olarak manipüle edebilme yeteneği, özellikle serebral kan akımı regülasyonu bağlamında, serebral vasküler fizyoloji hakkında içgörüler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Serebral vasküler fizyoloji
- Serebral kan akımı regülasyonu
- Endotelyal hücre sinyalizasyonu
Arka Plan
- Bu araştırma, endotelyal kalsiyum sinyalleri ile membran potansiyeli arasındaki etkileşime odaklanmaktadır.
- Bu mekanizmaları anlamak, yaşlanma ve kronik hastalıklarla ilgili sorunların çözümü için kritik öneme sahiptir.
- Geliştirilen yöntemler, fizyolojik koşullar altında gözlem yapılmasına olanak tanır.
Kullanılan Yöntemler
- Serebral arterlerin izolasyonu ve endotel tüplerin hazırlanması
- In vivo deneyler için fare modeli
- Eş zamanlı hücre içi kalsiyum ve membran potansiyeli ölçümü
Ana Sonuçlar
- İşlevselliği koruyarak endotel tüplerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Fizyolojik koşullar altında hücre içi sinyalizasyonun izlenebilme yeteneği.
- Farmakolojik ajanlara karşı endotel yanıtlarına dair içgörüler.
Sonuçlar
- Bu çalışma, serebral arterlerde endotel fonksiyonlarını incelemek için yeni bir teknik sunmaktadır.
- Bulgular, yaşlanma ve hastalık süreçleriyle ilişkili olan, serebral kan akışını etkileyen faktörlerin daha derinlemesine anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Bu yöntem, fizyolojik koşullar altında sağlam serebral endotelde hücre içi kalsiyum ve membran potansiyelinin eş zamanlı ölçümüne olanak tanıyarak, endotel kaynaklı hiperpolarizasyon (EDH) sinyalizasyonunun doğrudan okunmasını sağlar. Ca2+ akışları ile vasküler tonus regülasyonu arasındaki gerçek zamanlı etkileşimi yakalayarak, serebral kan akımı kontrolünde rol oynayan hedeflerin mekanistik risk analizini destekler. Bu yaklaşım, nörodejeneratif ve serebrovasküler hastalık modellerinde endotel disfonksiyonunun değerlendirilmesi için öngörücü değer sunar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Endotelyal sinyal yolaklarında hücre içi Ca2+ salınımı ile K+ kanalı aktivasyonu arasındaki fonksiyonel bağlantıyı sorgular.
- Operasyonel Değer: SKCa/IKCa kanallarının farmakolojik modülatörlerinin doğal doku bağlamında doğrulanmasına olanak tanır.
- Bilimsel Değer: EDH bileşenlerinin, nitrik oksitten bağımsız vazodilatasyon medyatörleri olduğuna dair hipotezlerin test edilmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Doz-yanıt profillemesi için kantitatif, ratiometrik Fura-2 Ca2+ ve keskin elektrot Vm okumaları üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir endotelyal tüpler elde etmek için enzimatik sindirim ve tritürasyon yoluyla endotelyal hazırlığı standartlaştırır.
- Bilimsel Değer: EDH'nin gap junctionlar aracılığıyla milimetrik mesafelere kadar olan uzamsal yayılımını ölçerek ağ düzeyindeki sinyalizasyon analizlerine bilgi sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Endotel Ca2+ ve Vm dinamiklerini, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda serebral kan akımı regülasyonu ile ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: Uzatılmış kayıtlar için fizyolojik süperfüzyon (pH 7.4, 37°C) altında endotel bütünlüğünü ve fonksiyonunu korur.
- Bilimsel Değer: Yaşlanma ve kronik hastalık fare modellerinde vasküler reaktivitenin preklinik değerlendirmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamanın önklinik fenotiplemeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, moleküler mekanizmalar ile fizyolojik sonuçlar arasında köprü kuran endotelyal sinyal iletiminin fonksiyonel bir okumasını sunar.
- Keşif Biyolojisi: Ca2+-aktive K+ kanal katkılarının EDH ve vasküler tonus üzerindeki etkilerine ilişkin hipotezleri test eder.
- Tarama: Yerli endotelyumda bileşik etki profillemesi için eş zamanlı, gerçek zamanlı iyon akışı ve elektriksel okumalar sağlar.
- Analitikler: Yolak analizi için korele son noktalar olarak F340/F380 oranı ve membran potansiyeli yörüngeleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hücresel sinyallemeyi doku düzeyindeki vazodilatasyonla ilişkilendirerek, in vivo kan akışı düzenlemesine yönelik ekstrapolasyonu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı vasküler yataklar ve hastalık modelleri genelinde endotelyal fonksiyonel tarama için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Ca2+ spike'larını doğrudan hiperpolarizasyon olaylarıyla eşleştirerek EDH'deki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü fizyolojik koşullar altında standartlaştırılmış izolasyon ve süperfüzyon aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Fizyolojik olarak ilgili bir endotelyal sistemde hedef etkileşimini onaylayarak git/gitme kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel doğrulama temelinde, endotelyal iyon kanallarını hedefleyen bileşiklerin riskten arındırılmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Mikrodissection, enzimatik doku hazırlama ve elektrofizyolojik kayıt konularında uzmanlık.
- Keskin elektrot elektrometrisi, fotomültipliyer tabanlı floresan deteksiyonu ve mikroakışkan süperfüzyon için kullanılan enstrümantasyon.
- Endotel tüp hazırlığının ve montajının operatörler ve laboratuvarlar arasında standartlaştırılması.
- Farklı vasküler yataklardan veya türlerden elde edilen endotel tüpler için adaptasyon hususları.
- Kısıtlamalar arasında, keskin elektrot ve fotometri düzeneğinin eşzamanlı kurulumunun teknik karmaşıklığı ve taze doku izolasyonu gereksinimi yer almaktadır.
