Name: Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 28 s
Description: Öğrenin yoğunluk gradyanlı santrifüjasyon ile sperm kalitesini ayrıştırma yöntemini. Bu teknik yüksek, orta ve düşük kaliteli sperm katmanlarını ayırarak fertilite araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Gürcistan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. yıkama geleneksel Santrifüjü kullanarak
<ol><li>Fosfat tampon çözüm (PBS) hazırlayın. NaCl, 8.0 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 ve KH2PO4 800 ml distile su (dH2O) 0,24 g 0.2 g ekleyin. PH 7.4 0.1 N HCl kullanarak için ayarlamak ve çözüm getirmek için 1 dH2O. kullanarak L</li>
	<li>Motilite arabellek hazırlayın. NaCl, 6.5 g glikoz, 0,444 g CaCl2 ve n - tris-[hydroxymethyl] 11,5 g 4,5 g ekleyin dH2O. 800 ml metil-2-amino-ethanesulfonic asit (TES) pH 7.4 1 M NaOH kullanarak için ayarlamak ve çözüm getirmek için 1 dH2O. kullanarak L</li>
	<li>0.5 mL sperm Polipropilen microcentrifuge tüpüne pipet. PBS 1.0 mL ekleyin ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>1.500 x g (RT) Oda sıcaklığında 10 dakika, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. PBS ile sperm Pelet resuspend 1,5 mL.</li>
	<li>Sperm hareketliliği ile cips dik Resuspend, 10 min için 1.500 x g, santrifüj tampon 0.5 mL.</li>
</ol>2. PDGC teknik gerçekleştirme
Not: oda sıcaklığında PDGC tüm süreci gerçekleştirmek.
<ol><li>1.08 g/mL ve 1.07 g/mL Percoll çözümleri 3,0 mL iki ayrı tüplerde olun.<ol>
<li>Temiz bir test tüpü içinde 1.13 g/mL 1,712 mL ekleyin 0.3 mL 1,5 M NaCl çözeltisi için orijinal Percoll. DH2O 0.988 mL ve nazik INVERSION tarafından yoğunluk çözüm olarak 1.08 g/mL 3,0 mL yapmak karıştırın.</li>
		<li>Temiz bir test tüpü içinde 1.13 g/mL 1.482 mL ekleyin 0.3 mL 1,5 M NaCl çözeltisi için orijinal Percoll. DH2O 1.218 mL ve nazik INVERSION tarafından yoğunluk çözüm olarak 1.07 g/mL 3,0 mL yapmak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temiz bir test tüpü içinde PBS 2.0 mL ile 1.0 mL sperm örnek 1:2 oranında seyreltin. Pipetting tarafından karışımı yavaşça.</li>
	<li>Damlalıklı 3,0 mL steril 15 mL konik tüp içine 1.07 g/mL yoğunluğu çözeltisi. Dikkatle 1.08 g/mL yoğunluğu çözüm 1.07 g/mL yoğunluğu çözüm altında 3,0 mL damlalıklı. İki kat değil mix emin olun. Bir uzun formlu (9 inç) Pasteur pipet Bu adım daha kolay yapabilirsiniz.</li>
	<li>Seyreltilmiş meni örneği 3,0 mL damlalıklı PDG katmayın. Meni örnek PDG ile karıştırmak değil emin olmak için yavaşça 45 ° açıyla PDG içeren konik tüp eğ. Damlalıklı tüp duvar boyunca örnek ve tüp aşağı ve PDG üzerinden akışı sağlar.</li>
	<li>PDG ile overlaid örnek kütlesinin eşleştirmek için boş bir tüp hazırlayın. 1500 x g de her iki tüpler santrifüj kapasitesi 20 dk. denge ve sonra santrifüj kürsüye tüpler aktarma sırasında kesintili degrade korumak için dikkatli olmak için. Not: fren Santrifüjü sonunda kullanmayın.
</li>
	<li>Sonuçları gözlemlemek. Üç ayrı meni katmanları tüp içinde oluşmuş Şekil 1' de görüldüğü gibi olun.</li>
	<li>Bir pipet katmanlarla izole sperm Aspire edin. Meni üst tabakası ilk toplamak, Orta ikinci katman ve tüpün dibinde zor Pelet son. Her bir temiz ve steril polipropilen için transfermicrocentrifuge tüp.
</li>
	<li>Her örnek için PBS ile 1,5 mL seyreltik. 1500 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant dökün. Sperm Pelet hareketliliği arabelleği ile nazik pipetting tarafından yeniden oluşturma. Not: Alternatif yoğunlukları araştırmacı gereksinimlerinize uyacak şekilde kullanılabilir. V0 stok yoğunluğu çözüm hacmi nerede Aşağıdaki denklemle kullanılan maddeler miktarda kullanıldığında, istenen, çözüm p son hacim istenen son yoğunluk çözüm yoğunluğudur ve hisse senedi yoğunluk yoğunluğu p0 v belirlemek Çözüm: <img alt="Hız düzeltme denklemi, \(v_0 = v \times \frac{p - 1.0058}{p_0 - 1}\), bilimsel formül." src="/files/ftp_upload/58833/58833eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> Her zaman 1.5 M NaCl 0.3 mL NaCl konsantrasyon fizyolojik serum eşleştirmek için yoğunluk çözümleri hazırlanmasında kullanın.</li>
</ol>3. Sperm kalitesini belirleme
<ol><li>Sperm konsantrasyonu daha önce22açıklandığı gibi hesaplayın.</li>
	<li>Eozin-nigrosin aşağıdaki değişiklikler ile yukarıda açıklanan12 olarak boyama hayati gerçekleştirin:<ol>
<li>Sperm çözüm konsantrasyonu 1 x 108 hücre/mL, 100 µL hazırlayın.</li>
		<li>Damlalıklı 50 µL sperm çözüm eozin-nigrosin leke eşit bir birimi içeren bir polipropilen microcentrifuge tüp. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>20 µL lekeli sperm örneği bir cam slayt bir ucundaki bırakma ve düzgün bir şekilde kan için kullanılan benzer smear yer smear. 3-5 dakika oda sıcaklığında lekeli slaytlar kuruması.</li>
		<li>Mikroskop altında karalama gözlemlemek. Canlı sperm (hiçbir leke) ve (pembe lekeli) ölü sperm sayısını ve canlı sperm yüzdesi hesaplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha önce aşağıdaki değişiklikler ile sperm hareketliliği8 objektif değerlendirmek için tavuk sperm için doğrulanmış Accudenz tahlil gerçekleştirin:<ol>
<li>Damlalıklı 1.0 mL % 6 Şekil 2' de gösterildiği gibi çözüm polistren cuvettes tahlil. 41 ° C'ye kuluçkaya Not: 41 ° C tavuk iç sıcaklık eşleştirmek için kullanılır. İnkübasyon sıcaklığı bu kadın üreme sistemi soruşturuluyor türlerinin eşleşmesi gerekir.</li>
		<li>Meni örneği konsantrasyonu 5 x 108 hücre/mL, 100 µL önceden ısıtılmış tahlil çözümle yerleşimi.</li>
		<li>Küvet içeren yer spektrofotometre sperm örneği overlaid. 550, absorbans değeri kayıt nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPVL-penetrasyon tahlil aşağıdaki değişiklikler ile yukarıda açıklanan11 olarak gerçekleştirin:<ol>
<li>Bir parça (0.5 cm x 0.5 cm) olduğu gibi IPVL germinal disk bölgesinin kes.</li>
		<li>4 x 106 hücre/ml sperm konsantrasyonu ayarlamak</li>
		<li>Sperm hareketliliği arabelleği IPVL küçük cam şişe 37 ° C'de 15 dakika içinde Şekil 3' te gösterildiği gibi kuluçkaya.</li>
		<li>IPVL parça halinde % 3 bırakın NaCl IPVL ve sperm arasındaki etkileşimi durdurmak için.</li>
		<li>Schiff'ın reaktif 10 dk 10 formalin ile fiksasyon takip ile leke ve mikroskop slayt üzerinde IPVL parça monte s.</li>
		<li>IPVL başarılı sperm için mikroskop altında penetrasyon delik gözlemlemek ve tüm görünür delik başına 0,25 mm2 , 40 X büyütme saymak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li>
<li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl%2C+Gallus+gallus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li>
<li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li>
<li>Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReddy%2C+RP+%22Proceedings+of+1st+International+Symposium+on+Artificial+Insemination+of+Poultry.+Poultry+Science+Association%22">Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association</a>. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).</li>
<li>Howarth, B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li>
<li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+significance+of+sperm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li>
<li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+viability%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li>
<li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li>
<li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosome+reaction+of+fowl+sperm%3A+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+motility%2C+acrosomal+proteolytic+activity%2C+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm%2C+during+their+passage+through+the+male+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li>
<li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li>
<li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li>
<li>Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMortimer%2C+D+%22Spermatogenesis.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%22">Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols</a>. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927(2013).</li>
<li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li>
<li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics%2C+more+hyperactivation%2C+and+longer+survival+than+direct+swim-up%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li>
<li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li>
<li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhammad%2C+MU+%22World%27s+Poultry+Science+Association+Proceedings%22">World's Poultry Science Association Proceedings</a>. , Cambridge University Press. (2010).</li>
<li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li>
<li>Henkel, R. Sperm Processing for IVF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenkel%2C+R+%22Clinical+Embryology%3A+A+Practical+Guide%22">Clinical Embryology: A Practical Guide</a>. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).</li>
<li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li>
<li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li>
<li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviducal+sperm+selection%2C+transport+and+storage+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science+Review%22%5BJournal%5D)">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li>
<li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li>
<li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders%5BTitle%5D)+AND+%22Asian-Australasian+Journal+of+Animal+Sciences%22%5BJournal%5D)">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li>
<li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Doğurganlık sadece hayvansal üretim karlılığını belirler ama aynı zamanda, bunun doğal seleksiyonun türlerin varlığı için bir araç olarak görür. Bir sperm hücresi nihai bir yumurta döllemek için fonksiyonudur. Bir erkek ovidukt fittest o sperm yumurta23,24fertilizasyon sağlamak için seçer. Vitro çalışmalar da nitel sperm özellikleri ve döllenme başarı4,11,23<sup...

Omurgalılar, Erkek gamet yoğun seçici basınç geçmesi; Bu nedenle bir erkek üreme fitness başarılı fertilizasyon ulaşmak için çok önemli. Herhangi bir belirli omurgalı türün erkek fertilizasyon ihtiyaçlarını karşılamak için sperm hücrelerinin büyük miktarlarda ve yeterli kalitede üretmek gerekir. Sperm hücresi sperm baş ve bir kamçı sahip, vücuttaki en polarize hücrelerdir. Onlar da çok sperm kalitesinde heterojen vardır (canlı ve ölü, morfolojik normal ve anormal ve hareketsiz, düşük mobil ve yüksek mobil), hangi geniş varyasyon erkeklerin üreme verimliliği saptandı. Yüksek kaliteli sperm, daha az sayıda başarıyla ovum döllemek için gerekli matings büyük oranda. Ancak, doğurganlık elde etmek için morfolojik normal sperm hücresi İtici güçlerini gübreleme de zona pelusida1 nüfuz olarak sitesine ulaşmak için onların kamçı tarafından oluşturulan dayanır (ZP; memeliler durumunda) veya iç perivitelline katman2 (IPVL; durumunda kuşlar ve sürüngenler) doğal çiftleşme veya suni tohumlama (AI) aşağıdaki ovum. Sperm belirleme kalite yardımlı üreme teknikleri3 (sanat) kullanmak için gerekli ve AI kullanılmak üzere damızlık erkek yelpazesi4programları. Öte yandan, sanat başarısı sadece sperm kalitesi doğru değerlendirilmesi dayanır. Laboratuvar testleri bir dizi sperm fonksiyonel özelliklerini belirlemek için geliştirilmiştir. En önemli parametreleridir sperm morfolojisi, canlılık, hareketlilik, capacitation (kuş sperm gerektirir değil capacitation5), acrosome reaksiyon (AR; ekzositozu ve proteolitik enzim sürümünden sperm kafa acrosome), sperm penetrasyon ZP veya IPVL ve döllenme6,7,8,9,10,11. Önlemler doğurganlık yalnız bir sperm nüfus11gübreden yeteneği doğru bir değerlendirme sağlar. Önlemler çeşitli olayların bir yumurta döllenme için çıkılan bireysel spermatocytes7performansını uygun bir gösterimi için izin.
Sperm fonksiyonu ölçmek için geliştirilen metodoloji öncelikle species-specific. Örneğin, kuş sperm, sperm kalitesi8,11,12değerlendirmek için kullanılan en yaygın parametreleri canlılık, hareketlilik ve IPVL penetrasyonu vardır. Varlığı çok sayıda ölü sperm meni, sperm kalitesini etkilediğinden boşalmak canlı sperm sayısı sperm hayatta kalmak için önemli bir rol oynar. Bu reaktif oksijen türleri içinde sperm üretimini artırır ve canlı sperm13oksidatif hasara neden olur. Sperm hareketliliği, vücut sıcaklığında direnç karşı kuş sperm kamçı hareket için kapasite fertilizasyon8hakkında getirerek doğrudan bir rol oynamak için bilinir. İyi hareket eden olumlu doğurganlık ile ilişkili ve olduğunu, bu nedenle, birincil belirleyicisi doğurganlık8kuruldu. Ancak, bir mobil sperm de bir AR geçmesi ve IPVL11nüfuz yeteneği olması gerekir. IPVL penetrasyon deneyleri fertilizasyon11sürecinde yer alan her bir sperm için dikkate alacak.
Sanat uygulamada, boşalmak genellikle yüksek kaliteli sperm konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak ve düşük kaliteli sperm konsantrasyonu en aza indirmek için işlenir. Meni toplandıktan sonra yüksek kaliteli sperm oranı sperm ayrılık yordamları Sanayi ve araştırma uygulamalarında yaygın olarak kullanılan zenginleştirilmiş. Bu yordamları birçoğu, tüm ilgili faydaları ve sınırlamaları, ile geliştirilmiştir ancak tüm türdeş olmayan doğa sperm ile yüksek gübre yetenek sadece sperm toplamak için kullanmak. Sperm geçiş yöntemleri, bağlılık sütun filtrasyon ve yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC)14,15,16,17,18,19 bu yordamları içerir , 20. kullanılabilir teknikleri arasında çok basit, tekrarlanabilir, maliyet-etkin ve verimli yüksek kaliteli sperm sanat kullanmak için en fazla şans fertilizasyon14 en üst düzeye çıkarma amacı ile izole olmak DGC bulundu , 15. Buna ek olarak, DGC sperm hücre membran için zararlı değildir. Buna ek olarak, sperm geçiş yöntemleri yalnızca kademeli mobil sperm18,19toplamak, ancak toplanan sperm miktarı çok düşük, yapım o verimsiz sperm18, geniş hacimli toplama konusunda 20. bağlılık sütun filtrasyon son derece mobil sperm meni17; filtreleri bölümünde çok etkili Ancak, bu sperm membran20,21' e zararlı olma eğilimindedir.
DGC teknikte yoğunluğu degrade oluşturmak için en sık kullanılan substrat kolloidal silika partikülleri içinde polyvinylpryrolidone kaplı oluşur Percoll olduğunu. Percoll yoğunluğu degrade Santrifüjü (PDGC) ya da sürekli veya süreksiz olabilir ama kesintili bir degrade çoğunlukla son derece mobil sperm13,16,20yüksek verimli yalıtım için kullanılır. İş öğelerinin sürekli olmayan bir gradyan içerisinde daha yüksek yoğunluk ortamı bir konik tüp alt üst yoğunluğu artar bir degrade oluşturma, yukarıda daha düşük yoğunluklu medya yüzer. Bu sınırları farklı yoğunluk iki ortam arasında arayüz oluşturur. PDGC verimliliğini iki faktör elde edilir: 1) tek tek sperm hücresi ve artan bir yoğunluk var 2) eğilimi yüksek yapısal bütünlüğü ile sperm hücrelerinin itici yeteneği. Sperm daha yüksek hareket yeteneği ile daha iyi daha düşük yoğunluklu ortamdan geçmek ve daha yüksek bir yoğunluk medya içine nüfuz edebiliyoruz. Alt mobilite sperm medya farklı yoğunluğu arasındaki arabirimi tarafından oluşturulan sınır, tuzak haline olasılığı daha yüksektir. Sperm hücreleri yüksek yapısal bütünlük ve hareketlilik ölü, anormal veya düşük mobil sperm hücreleri daha yüksek yoğunluklu sahip olma eğilimi. Merkezkaç kuvveti PDGC uygulandığında, bu ilgili yerlerini degradedeki farklı yoğunlukları ile sperm hareketi kolaylaştırır.
Genel uygulamada PDGC gerçekleştirildikten sonra sperm yüksek doğurganlık konik tüp alt kısmında potansiyel ile yumuşak Pelet toplanır ve kalan atılır. Ancak, bu tekniğin atıl bir avantaj sperm hücresi kalite farkı göre çeşitli gruplara ayırmak için onun yetenek var. Gibi fizyolojik, metabolomic ve proteomik farklılıklar ilgilidir araştırma amaçlı, sperm kalitesi çalışma için sperm tarafından PDGC tekniği kullanan kalite derecesini ayırma verir. Burada, biz ne kadar bu teknik yanı sıra sperm kalitesi ile ayrı kalite, bu farklılıkları göstermek için kullanılabilir ayrıntı daha önce kurulan eozin-nigrosin canlılık için hayati boyama, Accudenz tahlil hareket eden ve sperm-IPVL kullanarak amacı etkileşim tahlil penetrability için.

<table><tbody><tr><td>Accudenz</td><td>Doğru Kimyasal ve Bilimsel Şirketi, Westbury, NY, ABD</td><td>AN7050</td><td></td></tr><tr><td>Percoll ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, ABD</td><td>P7828</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, ABD</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, ABD</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, ABD</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Nigrosin</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, ABD</td><td>198285</td><td></td></tr><tr><td>ST 40R Santrifüj ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>DU 530 Yaşam Bilimleri UV/Vis Spektrofotometresi</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, ABD</td><td></td><td>Katalog bulunamadı</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 Ters Floresan ve Faz Kontrast Mikroskobu</td><td>Olympus America Inc., PA, ABD</td><td></td><td>Katalog bulunamadı</td></tr></tbody></table>

sperm yoğunluğu degrade santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

Eşeyli üreme ile fertilizasyon hakkında getirmek için kadın bir gamet bir erkek gamet ya da sperm hücresi sigortalar. Ancak, çok sayıda sperm hücresi yetenek gübreleme ile fertilizasyon emin olmak için bir kadın gamet ile etkileşim gerekir. Bu nedenle, tek tek sperm hücresi gübreden yeteneği başarılı üreme için önemlidir. Yoğunluk gradient Santrifüjü için onlarca yıl yardımlı üreme teknolojisi içinde kullanılmak üzere yalnızca yüksek kaliteli sperm toplamak için tekrarlanabilir, hızlı, verimli, etkili ve son derece uyarlanabilir bir yöntem olarak kullanılmıştır. Biz burada açıklanan protokoller üç ayrı nüfus horoz sperm kalitesini tarafından yalıtmak için kesintili Percoll yoğunluğu degrade Santrifüjü (PDGC) tekniği kullanımı odaklanmak. Düşük, orta ve yüksek kaliteli sperm toplamak başardık. Biz de onların canlılık, hareketlilik ve penetrability değerlendirilmesi sperm belirleyici doğurganlık potansiyelini gerektirecektir tekrarlanabilir iletişim kuralları açıklar. Koleksiyon sperm kalitesini PDGC tekniği kullanarak tarafından doğru bir şekilde için yararlı olacağını ve iyice sperm potansiyel fark doğurganlık ile karakterize.

PDGC tekniği sperm sayısı üç ayrı ayrımı arasında tüm parametreleri tarafından kalite derecesi sonuçlandı. Yüksek kaliteli katman daha yüksek yoğunluklu çözüm, Orta kalite arasındaki bir katmanda yüksek ve düşük yoğunluklu çözüm daha düşük yoğunluklu çözüm üzerinde bir düşük kaliteli katman aşağıda içine sperm ayırır. Kalite bu farklılıklar (Şekil 4) canlılık, hareketlilik (Şekil 5) ve penetrability (Şekil 6<...

Bu yazıda, yoğunluk gradient Santrifüjü tekniği ve sperm Fizyoloji araştırma kendi uygulamasında performansını açıklayan hedefliyoruz.

Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Bu yöntem sperm fizyolojisi alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir, sperm kalitesinin kimyasal belirleyicisi gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, büyük miktarlardanumuneyi kaliteye göre ayırmanın yanı sıra alternatif yöntemlere kıyasla adaptasyon yeteneğidir. Bu yöntem sperm kalitesindeki farklılıklara ışık taksa da, farklı yoğunluklara sahip karışık hücre tipleri veya hücre altı bileşenler gibi diğer örneklere de uygulanabilir.Başlamak için, iki ayrı tüpler iki 3 mililitre Percoll seyreltme olun. Temiz bir test tüpünde, 2 mililitre PBS ile 1 mililitre meni numunesini seyreltin. Çözeltiyi karıştırmak için hafifçe borulayın.Steril konik bir tüp için düşük yoğunluklu Percoll sollution 3 mililitre ekleyin. Daha sonra, düşük yoğunluklu Percoll çözeltisi altında yüksek yoğunluklu Percoll çözeltisi dikkatle 3 mililitre. Konik tüpü 45 derecelik bir açıyla yatırırken, pipet 3 mililitre seyreltilmiş meni örneğinin Percoll yoğunluk degradesinin üzerine.Boş bir tüp hazırladıktan sonra, 1500 Gs'de her iki tüpü de 20 dakika santrifüj edin. Santrifüj sonrası küvette üç farklı meni tabakasının oluştuğundan emin olun. Bir pipet kullanarak meni üç tabaka toplamak, üst tabaka ile başlayan, orta tabaka takip, ve tüpün altındaki sert pelet ile biten.Katmanların her birini steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Meni örneklerinin her birini 1,5 mililitre PBS ile seyreltin ve numuneleri 1500 Gs'de on dakika santrifüj edin. Son olarak, supernatant dökün ve motilite tampon ile pelet yeniden.Bu protokolde, Percoll yoğunluk gradyan santrifüj tekniği veya PDGC, bir meni örneğini üç ayrı katmana ayırmak için kullanılmıştır. Sperm, yüksek yoğunluklu çözeltinin altında yüksek kaliteli bir tabaka, yüksek ve düşük yoğunluklu çözeltiler arasında orta kalitede bir tabaka ve düşük yoğunluklu çözeltinin üzerinde düşük kaliteli bir tabaka olarak ayrılır. Sperm kalitesindeki bu farklılıklar canlılık, hareketlilik ve penetrite farklılıkları ile kanıtlanmaktadır.Bu yordamı denerken, numunelerin oda sıcaklığına getirilmesi gerektiğini unutmamak gerekir. PDGC'nin başarısı, yalıtılmış katmanların dikkatli bir şekilde toplanmasının yanı sıra degradenin dikkatli hazırlanmasına bağlıdır. Bu teknik, geliştirildikten sonra, kuş türlerinde doğurganlığın biyo belirteçlerini araştırmak için sperm perdiomics alanındaki araştırmalarımızın önünü açtı.

sperm-collection-differential-quality-using-density-gradient

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile rafine bir hücre disosiasyon protokolü birleştirir fare testis yüksek derecede saflaştırılmış yaşayabilir mayotik kesirler elde etmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, DNA içeriği ve ayrık mayotik kesirler nükleer yoğunluğu farklılıkları yararlanır.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

Bu videoda, kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinin periferik kandan izole edilme tekniği açıklanmaktadır. Bu protokolle, daha sonra nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların verimli bir şekilde üretilmesi için insan hasta kan örneğinden KLL hücrelerini izole edeceğiz.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme: CLL Hücrelerini Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Akış sitometrisi kullanarak fare spermatidleri için bir sıralama stratejisi açıklıyoruz. Spermatidler, yuvarlak (spermiyogenez aşamaları 1-9), erken uzayan (spermiogenez aşamaları 10-12), geç uzayan (spermiyogenez aşamaları 13-14) ve uzun spermatidler (spermiyogenez aşamaları 15-16) dahil olmak üzere oldukça saf dört popülasyona ayrılır. Seçim parametreleri olarak DNA boyama, boyut ve granülozite kullanılır.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Bakteriyel nüfus kapsül üretim temel alarak ayırmak için kesintili yoğunluk gradyanlar kullanımını göstermektedir. Bu yöntem kapsül kültürler arası karşılaştırmak, belirli bir kapsül fenotip mutantlarla yalıtmak veya kapsül düzenleyiciler belirlemek için kullanılır. Burada açıklanan en iyi duruma getirme ve tahlil çalıştırılmasını olduğunu.

Kapsül tutarı kesintili yoğunluk Gradient kullanarak bakterilerin ayıran

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Kullanılarak İnsan Dışkısından Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Bu protokol, sperm motilite özellikleri ve timotaksis kullanılarak düşük DNA parçalanma indeksine sahip yüksek kaliteli spermlerin taranması için bir yöntemi tanımlar. Yöntem, U şeklinde yatay bir yüzme şeridi kullanır ve yüksek kaliteli spermin tampon damlacıklar yoluyla karşı tarafa ulaşmasını sağlarken, ölü sperm, hücre kalıntıları ve safsızlıklar hariç tutulur.

Düşük DNA Parçalanma İndeksine Sahip Yüksek Kaliteli Sperm Hazırlamak İçin U Şeklinde Yatay Yüzme Tekniği

Denatüre Gradient Jel Elektroforezi (DGGE)

Öğrenin yoğunluk gradyanlı santrifüjasyon ile sperm kalitesini ayrıştırma yöntemini. Bu teknik yüksek, orta ve düşük kaliteli sperm katmanlarını ayırarak fertilite araştırmalarına katkı sağlar.

Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

Daha fazla video keşfet