Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için
January 16th, 2019
Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.
Temas Kabarcık Bilayer yöntemi geleneksel Lipid Bilayers için alternatif bir tekniktir. ve bu yöntem membran üzerinden daha çok yönlü titreşim sağlar. CBB yöntemi Düzlemsel Lipid Bilayer ve yama kelepçe yönteminin faydalarını entegre eder.
Bir lipid çift katmanlı teknik olarak rasgele lipid bileşimi ile bir CBB oluşturulabilir. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip tek kanallı akım kayıtları için bir CBB geliştirdik. Bu yöntem membran titreşim çeşitleri sağlar ve kanal membran arayüzü için geniş bir tip platform sunuyor.
Herkes sabun köpüğü üfleme yi yatmıştır. Benzer manevralar ağızdan üfleme yerine uygulanan basıncı manuel olarak ince ayarlayarak CBB oluşumu için alınır. Pratik ve CBB keyfini çıkarın.
Bu işlem olmak için yuvarlak bir alt şişede istenilen konsantrasyonda kloroform fosfolipidler dağıtmak. Fosfolipid çözeltisini bir azot gazı silindirine bağlı bir döner evaporatörüzerine yerleştirin. İnce bir fosfolipid film görünene kadar oda sıcaklığında azot akışı altında şişedöndürün.
Sonraki yerde bir vakum pompası bağlı bir kurutucu içine açık şişe. Vakum pompası kullanarak iyice kloroform kaldırmak için birkaç saat için kurutucu iç aspire. Daha sonra şişeye uygun miktarda elektrolit çözeltisi ekleyin ve mililitre fosfolipid süspansiyon başına iki miligrmas elde etmek için fosfolipid askıya alın.
Çok katmanlı vezikül süspansiyon elde etmek için bir banyo sonicator kullanarak 20 ila 30 saniye için süspansiyon sonciate. Iyon kanal proteinleri içeren proteolipozomların hazırlanması için, çok katmanlı vezikül süspansiyon bir protein çözeltisi ekleyin. Ve banyo sonicator kullanarak birkaç saniye sonicate.
Büyük delikli cam pipetler hazırlamak için, bir pipet çekmecebir cam kılcal yerleştirin ve iki adım çekerek ince konik ucu ile mikro pipet imal. Daha sonra mikro pipeti mikro bir forge üzerine ayarlayın ve mikropipetin ucunu 30 ila 50 mikrometre çapında konik kısımdaki platin iplikle tulaşın. Filamenti kısa bir süre ısıtın ve hemen kapatın.
Distile su ve etanol kullanarak sığ bir kuyu ile cam slayt yüzeyini temizleyin. Daha sonra cam kaydırak üzerine silikonlaştırıcı reaktif uygulayın ve reaktif tamamen havada kurumasını bekleyin. Sonra ters bir mikroskop sahnesine cam slayt yerleştirin.
Silikonlu cam slayt sığ kuyuiçine heksadecane 100 mikrolitre ekleyin. Bir tüberkülin şırınga kullanarak mikropipetin yarısına kadar elektrolit çözeltisi doldurun. Daha sonra mikropipeti basınç portlu mikropipet tutucuya ayarlayın ve gümüş/gümüş klorür telelektrotun pipet elektrolit çözeltisine batırMasını sağlar.
Mikropipet tutuculardan birini yama kelepçesi amplifikatörünün baş aşamasına, diğerini de elektrik zeminine bağlayın. Daha sonra mikropipet tutucunun basınç portuna bir mikroenjektör bağlayın. Mikropipeti, mikromanipülörü kullanarak ters bir mikroskop un sahnesinin üzerinde uygun bir konuma ayarlayın.
Elektrot ofset potansiyelini ayarlamak için, bir elektrolit kubbe oluşturmak için cam slayt sığ kuyu etrafında düz yüzeyüzerinde mikropipet doldurmak için kullanılan aynı elektrolit çözeltisinin bir mikrolitre yerleştirin. Her iki mikropipetin ucunu elektrolit kubbesinde ıslatın. Daha sonra yama kelepçesi amplifikatörünün elektrot ofset potansiyelini ayarlayın.
Ucundan lipozom çözeltisi çizmek için, slayt cam sığ kuyu etrafında düz yüzeye lipozom çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Sonraki yer lipozom kubbe içeren mikropipet ucu. Mikroenjektör kullanarak lipozom içeren çözeltiyi aspire edin.
Kanal yeniden lipozomlar yeniden spirating için diğer mircopipette için prosedürü tekrarlayın. Şimdi sığ kuyuda heksadecane içinde mikropipet yerleştirin. Kabarcık istenilen boyuta ulaşana kadar basıncı artırarak yavaş yavaş bir su kabarcığı darbe ve bundan sonra aynı basıncı korumak.
Kabarcığın boyutunu sabit tutmak zorsa, yağ-hava arabiriminden ucu geçirerek kabarcığı atın. İki kararlı kabarcık lar oluşana kadar yordamları tekrarlayın. Iki kabarcıklar arasında bir temas kurun.
Boyutu yavaş yavaş sabit kabarcık içi basınç bile değişebilir, çünkü kabarcık boyutunu korumak için basınç ince ayar. Yama talep amplifikatörü kullanarak membran potansiyelini uygun değere ayarlayın ve kanal akımının ortaya çıkmasını bekleyin. Kararlı lipid çift katmanlı oluşumu için lekeleri temizlemek için gereklidir.
Cam kılcal damar veya pipet hazırlama iyice yıkanmalı ve deterjan molekülleri tarafından kontaminasyon önlenmelidir. CBB kanal moleküllerini oluşturduktan sonra ya sulu çözeltide ya da lipozomda birkaç ila düzinelerce dakika içinde çift katmanlı içine kendiliğinden yerleştirildi. Kanalların eklemeleri, uygulanan membran potansiyeli altında mevcut genliğin adım adım artması yla doğrulandı.
CBB yöntemi ile oluşturulan bir çift katmanlı iki tek katmanlı parçalanabilir. PTB kanal akımı iki tek katmanlı taktıktan hemen sonra ortaya çıktı. Ve temas genliği arttıkça akım daha büyük oldu akım CBB'nin detach eklemek manipülasyonu ile senkronize edildi.
Kabarcıkların sayısı patlarsa sulu çözeltideki lipid konsantrasyonu azalır ve monolayer oluşmaz. Sonra lipozom bölümünde baskıyı hafifletmeye çalışın. CBB oluşumu ve kanal reconstitution kurulduktan sonra profüzyon veya hidrofilik veya hidrofobik maddeler enjekte yoluyla sulu çözelti ve membran bileşimlerini değiştirmek için deneyebilirsiniz.
CBB yöntemi kanal membran interplays keşfetmek için çok yönlü yollar açmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, lipid çift katmanlarını oluşturmak için Kontakt Kabarcık Çift Katman (CBB) yöntemini tanıtmakta ve geleneksel tekniklere yenilikçi bir alternatif sunmaktadır. Yöntem, esnek membran titreşimleri ve tek kanal akımlarının yüksek sinyal-gürültü oranı kayıtlarını sağlayarak, kanal-membran etkileşimlerinin çalışmasını geliştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyofizik
- Elektrofizyoloji
- Lipit membran teknolojisi
Arka Plan
- Lipit çift katmanları, membran proteinlerini incelemek için hayati öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemlerin esneklik ve stabilite konusunda sınırlamaları vardır.
- CBB yöntemi, düzlemsel lipid çift katmanlarının ve patch clamp tekniklerinin avantajlarını birleştirir.
- Bu teknik, iyon kanal aktivitelerinin yüksek kaliteli kayıtlarını kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Kontakt kabarcık yaklaşımı kullanarak lipid çift katman oluşturma için sağlam bir yöntem geliştirmek.
- Gelişmiş kalitede tek kanal kayıtlarını sağlamak.
- Membrana dinamiklerini ve kanal-membran etkileşimlerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- CBB yöntemi, bir organik çözücü içindeki su kabarcıklarının kontrollü manipülasyonunu, çift katmanlar oluşturmak için kullanır.
- Fosfolipidler, çok katmanlı veziküller oluşturmak için hazırlanır ve sondaj yapılır, ardından iyon kanal proteinlerinin dahil edilmesi yapılır.
- Bilayer oluşumu sırasında kabarcıkların hassas uygulanması ve stabilize edilmesi için mikropipetler üretilir.
- Deneysel kurulumlar, çift katman oluşumundan sonra iyon kanal akımlarını izlemek için patch clamp amplifikatörlerini içerir.
Ana Sonuçlar
- CBB yöntemi, kanal proteinlerinin çift katmanlara yerleştirilmesini etkili bir şekilde destekler ve akım genliğindeki değişikliklerle doğrulanır.
- Kararlı çift katmanlar oluşturulmuştur, tek kanal akımlarının kaydedilme kabiliyetini göstermiştir.
- Yöntem, kabarcık boyutu ayarlamalarının membran stabilitesi ve akım sürekliliği üzerinde etkisi olabileceğini göstermiştir.
Sonuçlar
- CBB yöntemi, lipid çift katman oluşumunda önemli bir ilerleme sunar ve elektrofizyolojik çalışmalarda çeşitli uygulamaları mümkün kılar.
- Bu yenilikçi yaklaşım, kanal-membran dinamikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
- Bulgular, lipid çift katman teknolojilerinin çeşitli deneysel koşullara uyarlanma potansiyelini vurgulamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
