Name: Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, iletişim balonu lipid çift katmanı yöntemiyle tek kanal akım kayıtları için biyofiziksel elektrofizyoloji tekniklerini. Bu yöntem, membran dinamikleri ve kanal-membran etkileşimlerini yüksek sinyal-gürültü oranıyla incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Mariko Yamatake ve Masako Takashima teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenmiştir kısmen KAKENHI tarafından grant 16 H 00759 ve 17 H 04017 (SO) numaraları.

1. lipozomlar hazırlayın
<ol><li>Fosfolipitler (Örneğin, 10 mg toz) (Örneğin, 10 mg/mL) istenen bir konsantrasyon, kloroform dağıtmak.</li>
	<li>Kloroform buharlaşır.<ol>
<li>Rotary Evaporatör üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek) N2 gaz silindir bağlı bir yuvarlak alt şişesi ve fosfolipid çözümde bir yer. Bir ince fosfolipid film (~ 30 dakika sonra) görünene kadar şişesi N2 akışı oda sıcaklığında altında döndürün.</li>
		<li>Bir vakum pompası bağlı bir desiccator içine açık şişeye koyun. Vakum Pompası kullanarak, iyice kloroform kaldırmak için desiccator birkaç saat içine Aspire edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrolit çözümünü uygun bir hacmi için balonun ekleyin ve 2 mg/mL fosfolipid süspansiyon elde etmek için fosfolipid askıya alma.</li>
	<li>Süspansiyon saniye bir banyo sonicator kullanarak birkaç on için solüsyon içeren temizleyicide (çok katmanlı vezikül (MLV) süspansiyon elde etmek için Malzemeler tablobkz:).</li>
	<li>İyon kanal protein içeren proteoliposomes hazırlanması için bir protein çözüm eklemek (uygun deterjanlar; kullanarak çözündürüldükten proteinler ile % 2 maksimum birimdir) MLV süspansiyon için ve banyo sonicator kullanarak birkaç saniye için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
</ol>2. büyük delik Cam pipetler hazırlayın
<ol><li>Bir cam bir pipet çektirmenin kapiller ayarla ve Mikropipetler iki aşamalı çekerek ile iyi bir konik uç ile imal.</li>
	<li>Micropipette bir microforge ayarla ve konik kısmında bir platin filaman için micropipette ucu çapı 30-50 µm ile bağlantı kurun.</li>
	<li>Filaman kısaca ısı (5 s) ve hemen kapatmak. Not: Bu manipülasyon formlar bir çatlak Isıtma, Gelin, micropipette ucu kesilir, geniş bir delik çapı 30-50 µm ile bırakarak sayede.</li>
</ol>3. tedavi cam kaymak ile sığ bir içbükey kuyu (su itici bitirmek için Siliconization) yüzeyine
<ol><li>Distile su ve etanol ile sığ kuyu ile cam slayt yüzeyini temizlemek.</li>
	<li>Bir uygun birimi (Örneğin, 100 µL) delik slayt cam üzerine bir siliconizing reaktifi (su itici) uygulanır.</li>
	<li>Reaktif havadaki tamamen kuru.</li>
	<li>Cam slayt ters bir mikroskop sahnesinde yerini.</li>
</ol>4. form CBB ve elektrofizyolojik ölçüm yapmak
<ol><li>Hexadecane 100 µL silikonlu delik slayt cam sığ kuyunun içine ekleyin. Not: lipid-out yöntemi için fosfolipitler hexadecane (20 mg/mL) önceden dağılmış.</li>
	<li>Elektrolit çözüm tüberkülin şırınga kullanarak micropipette, yarı uzunluk için doldur.</li>
	<li>Pipet elektrolit çözüm içine emmek için Ag/AgCl tel elektrot izin micropipette tutucu bir bağlantı noktasıyla basınç, üzerine micropipette ayarlayın.</li>
	<li>Micropipette sahipleri birini bir yama-kelepçe amplifikatör ve diğeri elektrik yere baş aşaması bağlayın.</li>
	<li>Bir microinjector micropipette sahibi basınç bağlantı noktasına bağlayın.</li>
	<li>Micropipette micromanipulator işleyerek ters bir mikroskop sahne alanı üzerinde uygun bir konuma ayarlayın.</li>
	<li>Elektrot uzaklığını potansiyel ayarlama.<ol>
<li>Yer 1 µL düz yüzeye bir elektrolit kubbe oluşturma delik slayt cam sığ kuyu etrafında micropipette doldurmak için kullanılan aynı elektrolit çözüm.</li>
		<li>Her iki Mikropipetler ucu micromanipulator işleyerek elektrolit kubbe emmek.</li>
		<li>Yama-kelepçe amplifikatör elektrot mahsup potansiyelini ayarlayın.</li>
		<li>Deney sonunda doğru ofset CBB kırarak onaylamak kullanma yüksek membran potansiyel yolu ile (elektriksel delinme; Zap üzerinde amplifikatör kullanarak), bir (kabarcık füzyon) içine erimiş için iki neden kabarcıklar.</li>
		<li>Öyle ki potansiyel gerçek membran için potansiyel uygulanan membran hesaplanan değer eklenir asimetrik elektrolit çözümleri kullanıldığı durumlarda sıvı kavşak potansiyel54 düzeltin. Not: Sıvı kavşak potansiyel JPCalc55programı kullanılarak hesaplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipozom çözüm ucundan çizin. Not: suda çözünen kanalları lipid-out yöntemi kullanılarak incelendiğinde, lipozom çözümü emme gerekli değildir.<ol>
<li>Lipozom çözüm 1 µL delik slayt cam (kubbe lipozom içeren) sığ kuyu etrafında düz bir yüzeye yerleştirin.</li>
		<li>Micromanipulator işlemek ve micropipette ucu lipozom içeren kubbe yerleştirin.</li>
		<li>Lipozom içeren çözüm microinjector kullanarak micropipette tutucu içinde basıncı düşürerek Aspire edin.</li>
		<li>Diğer pipet için yordamı yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Micromanipulator işlemek ve sığ kuyu içinde hexadecane içine micropipette ucu daldırma.</li>
	<li>Su balonu yavaşça kabarcık (Örneğin, çapı 50 µm) istediğiniz boyuta ulaşıncaya kadar basıncı artırarak darbe ve bundan sonra aynı basınç korumak.</li>
	<li>Baloncuklar baloncuklar boyutunu sabit tutmak zor ise yağ-hava arabirimi aracılığıyla ucu geçirerek atmak.</li>
	<li>İstikrarlı kabarcıklar oluşur 4,8-4,9 tamamlayana dek.</li>
	<li>Onları (Şekil 5) arasında temas izin için ve baloncuklar işlemek. Not: Bazen, baloncuklar birbirlerine kendiliğinden CBB oluşturmak için yaklaşım. Aksi durumda, baloncuklar yakındır ama her diğer iletişim kurabilirim. Bu durumda, baloncuklar birbirlerine mekanik olarak itin.</li>
	<li>Boyut yavaş yavaş bile sürekli Intra-balon basınçta değiştirmek için basınç kabarcık boyutu korumak için ince ayar yapın.</li>
	<li>Membran potansiyeli yama-kelepçe amplifikatör kullanarak uygun değere ayarlayın ve (Şekil 6) ortaya geçerli kanal için bekleyin.</li>
</ol>5. ölçü Bilayer kapasite
<ol><li>Bilayer elektrik kapasite (Cel) bir rampa potansiyel uygulayarak ölçmek. Not: rampa Komuttaki gerilim değişim oranı 10 mV/10 ms (veya 1 V/s)-10 mV/10 ms tarafından takip olduğunda, geçerli atlamayı yamaç değişimler üzerine genliğini (Örneğin membrane'scapacitance değer okumak için karşılık gelen 100 pA → 100 pF).</li>
	<li>Bilayer alan iki değerlendirmek baloncuklar bir diğer yığılmış ve mikroskop bilayer (Şekil 6) kenarına görüntülemek üzere bilayer düzeyinde odaklanmak. Not: Bilayer şekil çoğunlukla yuvarlaktır ve alan RADIUS hesaplanır.</li>
	<li>Bilayer alanına göre elektrik kapasite bölerek belirli membran kapasite (Csp) hesaplamak (Csp Cel/A =).</li>
	<li>Bilayer kalınlığı (hidrofobik çekirdeğin kalınlığı) hesaplamak Dc kullanarak (nerede εr ve ε0 temsil bilayer hidrofobik bölgesinin geçirgenlik ve geçirgenlik (εrε0) /Csp = bir vakum, sırasıyla).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

CBB yöntemi lipid bilayer oluşumu monolayer20ile kaplı bir petrol su damlacığı prensibi temel alır. Teknik olarak, CBBs şekillendirme için kolay, özellikle yama-kelepçe araştırmacılar, cam Mikropipetler manipüle yetkin olan işlemlerdir. İki pipet manipülatörler microinjectors ile kullanılabilir olduğunda yama kelepçe için elektrofizyolojik Kurulumu kolayca CBB içinde kullanılır. CBB geleneksel PLB halefi olduğundan, öte yandan, fizikokimyasal bilgi büyük miktarda birikmiş8,...

İyon kanalları, hücre zarının sadece destekleyici bir malzeme ama bir ortak iyon akı üretmek için değildir. İşlevsel olarak, membran hangi iyon kanalları katıştırılmış bir elektrik yalıtkan ve tüm hücre zarlarında istirahat membran potansiyeli ile öğretilir olmasıdır. Geleneksel olarak, rasgele bir membran potansiyel bir dış devre hangi kanallardan elektrik akımı ölçüldü getirilmedi. İyon akı farklı membran potansiyeli, bu kantitatif değerlendirilmesi iyon-seçici nüfuz ve gating işlevleri1,2gibi bu kanallar moleküler özelliklerini ortaya koymuştur. Membran için iyon kanallarının fonksiyonel çalışmalar hücre zarı veya lipid bilayer membran bir platformdur. Tarihsel olarak, tek kanallı elektrik geçerli kayıtları ilk lipid bilayers3,4' te gerçekleştirilen ve ilgili teknikleri (Şekil 1A yama-kelepçe yöntemi gibi hücre zarı için geliştirilmiştir )5,6. O zamandan beri bu iki teknik ayrı ayrı farklı amaçlar (Şekil 1)7,8için evrim geçirmiş.
Membran lipidler ve bilayer membranlar araştırma yapısı ve fonksiyonu kanal proteinlerin desteklemedeki rollerini için odak noktası şu anda vardır. Bu nedenle, hazır bilayers lipid bileşiminde değişir yöntemlerden yüksek talep olduğunu. Lipid bilayer oluşumu yöntemleri düzlemsel lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, petrol su damlacığı bilayer12ve damlacık arabirimi bilayer (DIB)13, gibi 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikleri (Şekil 1) altında lipit kompozisyonları20farklı kanal işlevi incelenmesi için bir fırsat sağlayan ortak seçeneklerdir. DIB geleneksel PLB üretmek Teknik olarak çok daha kolay olsa da, DIB büyük boy tek kanallı geçerli kayıtları her zamanki ölçekli gürültülerinden ile çalışmak için uygulamak yama-clampers için bir engel oluşturmuştur (< 100 pS).
Arka plan gürültü sorunu çözecek, bilayer alan indirilmelidir. Bu sorun tekrarlar için lipid bilayers (Şekil 1) elektrofizyolojik teknikleri gelişmekte olan tarihin hatırlıyor. İlk günlerde, bir pipet (İpucu daldırma yöntemi; ucunda bir küçük boyutlu bilayer (çapı 1-30 µm) kuruldu Resim 1 C) 21 , 22 , 23kullanmak yerine, bir müstakil bilayer (çapı ~ 100 µm) (resim 1B) bir odasında bir hidrofobik septum üzerinde. Çok alt arka plan gürültü24ile elektriksel ölçümler için izin ucu daldırma yöntemi. Tecrübelerimizi PLB25,26, ucu daldırma22,23,27ve yama-kelepçe28,29,30, 31 yöntemleri bize petrol su bilayer ilkeleri kullanarak lipid bilayers oluşturan bir fikir yol açtı. Bu kişi kabarcık bilayer (CBB) yöntemi20,32atıfta bulunmuşlardır. Bu yöntemde, petrol aşamasında (Şekil 1D), su damlaları asılı yerine su balonu Cam Pipet (ile uç çapı yaklaşık 30 µm) üzerinden petrol faz (Şekil 1E ve 2), nereye attı kabarcık sabit bir basınç uygulayarak korunur. Kabarcık bir monolayer formları kendiliğinden vasıl yüzey su-yağ arayüzey. Sonra iki kabarcıklar iki Cam pipetler manipülasyonu yerleştirilmiş ve iki monolayers, bir denge bilayer alanı verimli yaklaşım olarak bilayer oluşturulur. Kabarcık boyutu (basınç holding) içi-balon basıncı ve bilayer boyutu tarafından aynı şekilde denetlenir. Bir ortalama çapı 50 µm sık sık kullanılır. Kabarcık hacmi küçük olmasına rağmen (< 100 pL), toplu elektrolit faz oluşturan microliter aralığında pipet çözüm hacmin daha büyük bağlı.
CBB yöntemi (Tablo 1) kullanmak için birçok faydası vardır. Bir lipid bilayer oluşumu Teknik olarak çeşitli lipit kompozisyonları zarı üretilebilir ve daha geleneksel katlama yöntemi33tarafından asimetrik membran daha kolay kurulan32 vardır. Bilayer mekanik olarak, sadece bir hidrostatik basınç farkı34,35ile bükülebilir geleneksel PLB aksine manipüle edilebilir. Holding basıncı değiştirerek, baloncuklar genişletmek ya da daraltmak, artan veya azalan membran gerginlik-32önde gelen. Bilayer içine monolayers, membran morfolojik çalışmalarda, donma-kırık tekniği36,37 benzer mekanik olarak ayrılabilir ama CBB ile ayırma ve iliştirme döngüleri32 tekrarlanan bir manevra sağlar . Ve kanal kayıtları alma ihtimali çok geleneksel PLB tekniği ile daha yüksek kanal yeniden düzenlendi lipozomlar verimli füzyon bilayer içine küçük hacimli balonu içinde elektrolit çözüm sağlar. Küçük kabarcık birim aynı zamanda hızlı perfüzyon (içinde ~ 20 ms) bir kez başka bir enjeksiyon sağlar. pipet ya baloncuklar eklenir. Yama-kelepçe yöntemi, aksine kırık sonra bir CBB membran hemen ve art arda yeniden oluşturulur ve pipetler günde birkaç kez kullanılabilir. Yarar-in belgili tanımlık yama-kelepçe ve PLB yöntemleri entegre ederek, CBB membran, fizikokimyasal şartları değiştirmek için çok yönlü bir platform kanal-membran etkileşimleri benzeri görülmemiş çalışmaları için izin sağlar.
CBB oluşumu işleminin ayrıntılı bir protokol sunmadan önce bilayer oluşumu fizikokimyasal arka plan membran oluşumu ile ilgili deneysel zorlukları gidermek yama-clampers için yardımcı olacaktır ilk sunulur Bu karşılaşılmaktadır.
CBB deneyler yüzey kimyası bilim38dersleri vermek. CBB sabun köpüğü nerede aynı şekilde, bir su balonu organik bir çözücü attı havaya, pipet havaya benzer. Bir membran lipidler su balonu veya organik çözücü dahil değildir zaman su balonu pek şişirilmiş fark edeceksiniz. Amfipatik lipidler yokluğunda bir su-yağ arabirimi, yüzey gerilimi yüksek ve bir balon üfleme için Intra-balon basıncı yüksek olacaktır. Bu bir Laplace denklemi hayata geçirilmesidir (ΔP 2 γ/nerede ΔP içi-balon basıncı, γ olduğunu yüzey gerilimi ise R kabarcık yarıçapı R, =). Lipidler konsantrasyonu Organik faz veya elektrolit çözüm yüksek olduğunda, lipitler monolayer yoğunluğu, Gibbs adsorpsiyon İzoterm tarafından dikte edildiği gibi artar (-dγ = Γben yüzey aşırı nerede Γben dµben, Ben veben µ bileşiktir bileşen kimyasal potansiyel ben)39önde gelen bir alt yüzey gerilimi ve kabarcık oluşumu kolaylığı,. CBB bilayer bir teğet açı (Şekil 2) gözlenebilir ve ölçülebilir monolayer ve bilayer arasında iletişim açıdır. Bu açıyı monolayer surface tensions ve bilayer arasında bir denge ifade eder (genç denklem: γbı γmo cos(θ), nerede γbı var bilayer gerginlik, γmo monolayer gerilim ise θ temas açısı =). Monolayer gerginlik temas açısı değişikliklerden membran potansiyel bir fonksiyonu olarak değerlendirilir verilen bu değişiklikler bilayer gerginlik temas açısı değişimler gösterir (genç-Lippmann denklem: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), nerede Cm şey zar kapasitans, V potansiyel membran ve θ0 ve θv 0 ve V mV, iletişim açılarla sırasıyla)40,41 ,42. İki kabarcıklar yeterince yakın olduğunda, onlar birbirlerini kendiliğinden yaklaşım. Bu van der Waals kuvvetleri nedeniyle ve görsel olarak CBB oluşumu dinamik bu süreçte gözlemleyebilirsiniz.
CBB sistem ayrı aşamadan oluşmaktadır: Yani, bir toplu petrol aşamasında, su kabarcıkları bir monolayer ve ekibine ulaşarak bilayer (Şekil 3) ile kaplı. Birden fazla aşama çözücü içeren simit bilayer faz ve bir ince organik faz tarafından iki monolayers43,44sandviç gibi bir PLB gözlenen anımsatan bunlar. CBB monolayer aşamasıdır bilayer broşür ile sürekli ve lipid molekülleri kolayca monolayer ve broşür arasında yaygın. Monolayer faz lipid su deposu olarak hizmet vermektedir büyük aşama oluşturan kabarcık yüzeyinin en kapsar. Çünkü monolayer lipidler hidrofobik kuyruğunun dışa toplu petrol aşamaya uzanır, bilayer iç veya hidrofobik çekirdeğin toplu petrol aşamaya açar. Böylece, bilayer yakın yağ fazına enjekte bir hidrofobik kolayca bilayer iç erişmeye devam edebilirsiniz bir maddedir. Son zamanlarda hangi bilayer lipid bileşiminde hızla (bir saniye içerisinde) tek kanallı geçerli kayıtları sırasında değiştirilir45, gelişen membran perfüzyon tekniğidir. Bilayer kolesterol içeriği geri dönülebilir olarak kolesterol perfüzyon ve45kapalı geçiş yaparak denetlenebilecek olduğunu bulduk. Monolayer ve bilayer ilgili madde konsantrasyonu farklı olay nedeniyle ilgili maddenin konsantrasyon gradyanı hemen Marangoni etkisi46, bilinen difüzyon tasfiye edilir 47. öte yandan, parmak arası terlik monolayers arasında yavaş48,49,50vardır.
CBB yöntemini kullanarak, bilayer 1 düşük bir elektrolit pH gibi çok yönlü fizikokimyasal koşullarda oluşturulur 51, 3 M kadar tuz (K+, Na+, vb) konsantrasyon, bir membran potansiyeli ±400 mV yüksek ve bir sistem ilâ 60 ° c sıcaklık
Orada CBB oluşumu için çeşitli seçenekler ve kanal moleküllerin birleşme orada. Su-yağ arayüzüne monolayer oluşumu için lipitler ya da organik bir çözücü (lipit-out yöntemi; eklenir Şekil 4 A, 4 C) veya bir kabarcık olarak lipozomlar (lipit-Yöntem; Şekil 4 B, 4 D). Özellikle, lipid Yöntem asimetrik membran15,32oluşumu için sağlar. Oysa kanal proteinlerin içine yeniden kanal molekülleri sulu çözüm (Örneğin, kanal oluşturmayan peptidler) çözünür doğrudan kabarcık (Şekil 4A, B)52,53, eklenir lipozomlar, o zaman (Şekil 4C, D) kabarcık eklenir. Burada, CBBs oluşumu için ya bir kanal peptid (polytheonamide B (pTB); lipid yöntemi ile Şekil 4 A) veya bir protein (KcsA Potasyum kanal, Şekil 4C) gösterilir.

<table><tbody><tr><td>Azolektin (L-&alfa; -Fosfatidilkolin, Tip IV-S)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3644</td><td></td></tr><tr><td>A/D Dönüştürücü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata1550A</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl elektrot</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1317</td><td></td></tr><tr><td>Banyo Sonikatörü</td><td>Branson</td><td>M1800H-J</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu Fotonik</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal</td><td>Harvard Aparatı</td><td>30-0062</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Dojindo</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Delikli Sürgülü Cam</td><td>Matsunami Cam</td><td>S339929</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon Tablosu</td><td>Herz</td><td>TDI-86LA(Y)2</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Injenctor</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Manipülatör</td><td>Narishige</td><td>EMM</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet tutucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n-Hexadecane</td><td>Nacalai</td><td>07819-32</td><td></td></tr><tr><td>Yama-Kelepçe Amplifikatörü</td><td>HEKA</td><td>EPC800</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin)</td><td>Avanti Polar Lipidleri</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>PAPA (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin </td>)<td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757</td><td></td></tr><tr><td>POPG (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rak-gliserol))</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840457</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Nacalai</td><td>28514-75</td><td></td></tr><tr><td>Döner Evapolatör</td><td>Iwaki</td><td>REN-1000</td><td></td></tr><tr><td>Süksinik Asit</td><td>Nacalai</td><td>32402-05</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Pompası</td><td>Buchi</td><td>V-100</td><td></td></tr></tbody></table>

lipid bilayer deneyler ile iletişim balonu bilayers yama-clampers için

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid bilayers iyon kanalları, kanal-membran etkileşimleri çeşitli membran altında incelenmesi lipit kompozisyonları sağlayan fonksiyonel çalışmalar için benzersiz bir deneysel platform sağlar. Bunlar arasında damlacık arabirimi bilayer popülerlik kazanmıştır; Ancak, büyük zar boyutu düşük elektrik arka plan gürültü kayıt engeller. Düzlemsel lipid bilayer avantajlarını birleştiren bir iletişim kabarcık bilayer (CBB) yöntemi ve lipid bileşimi değişir ve bilayer mekanik, sırasıyla işlemek olanağı gibi yama-kelepçe yöntemleri kurduk. Kurulumu geleneksel yama-kelepçe deneyler için kullanarak, deneyler CBB tabanlı kolayca gerçekleştirilebilir. Kısaca, bir cam pipet elektrolit çözümde bir organik çözücü faz (hexadecane) attı ve pipet basınç istikrarlı kabarcık boyutu elde etmek için korunur. Kabarcık kendiliğinden lipozomlar kabarcıkları üzerinden sağlanan bir lipid monolayer (saf yağlar veya karışık lipidler) ile kaplı olduğu. Daha sonra iki monolayer kaplı kabarcıklar (~ 50 µm çapında) Cam pipetler ucundaki bilayer oluşumu için yerleştirilmiş. Kanal yeniden düzenlendi lipozomlar giriş kabarcık içine bırakmak için tek kanallı geçerli kaydı bir sinyal-gürültü oranı ile yama-kelepçe kayıtları karşılaştırılabilir bilayer kanallarında birleşme yol açar. CBBs bir asimetrik lipid bileşimi ile kolayca meydana gelir. CBB art arda önceki kabarcıklar üfleme ve yenilerini şekillendirme yenilenir. (Örneğin, membran perfüzyon ve bilayer gerginlik) çeşitli kimyasal ve fiziksel tedirginlikler CBBs. İşbu üzerinde empoze edilebilir, biz temel yordamı CBB oluşumu için mevcut.

Tipik bir CBB çapı 50 µm (Şekil 56) ve hexadecane belirli membran kapasitans 0.65 µF/cm2. Kabarcık boyutu keyfi içi-balon basıncı tarafından kontrol ediliyordu. Küçük kabarcıklar düşük gürültü kayıtları için gerekli olduğunda, uç çapı buna küçük olmalıdır. Örneğin, çapı 50 µm kabarcık boyutunun için uç çapı 30 µm olması gerekir.
CBB oluşmuş bir kez kanal molekülleri sulu ...

Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Temas Kabarcık Bilayer yöntemi geleneksel Lipid Bilayers için alternatif bir tekniktir. ve bu yöntem membran üzerinden daha çok yönlü titreşim sağlar. CBB yöntemi Düzlemsel Lipid Bilayer ve yama kelepçe yönteminin faydalarını entegre eder.Bir lipid çift katmanlı teknik olarak rasgele lipid bileşimi ile bir CBB oluşturulabilir. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip tek kanallı akım kayıtları için bir CBB geliştirdik. Bu yöntem membran titreşim çeşitleri sağlar ve kanal membran arayüzü için geniş bir tip platform sunuyor.Herkes sabun köpüğü üfleme yi yatmıştır. Benzer manevralar ağızdan üfleme yerine uygulanan basıncı manuel olarak ince ayarlayarak CBB oluşumu için alınır. Pratik ve CBB keyfini çıkarın.Bu işlem olmak için yuvarlak bir alt şişede istenilen konsantrasyonda kloroform fosfolipidler dağıtmak. Fosfolipid çözeltisini bir azot gazı silindirine bağlı bir döner evaporatörüzerine yerleştirin. İnce bir fosfolipid film görünene kadar oda sıcaklığında azot akışı altında şişedöndürün.Sonraki yerde bir vakum pompası bağlı bir kurutucu içine açık şişe. Vakum pompası kullanarak iyice kloroform kaldırmak için birkaç saat için kurutucu iç aspire. Daha sonra şişeye uygun miktarda elektrolit çözeltisi ekleyin ve mililitre fosfolipid süspansiyon başına iki miligrmas elde etmek için fosfolipid askıya alın.Çok katmanlı vezikül süspansiyon elde etmek için bir banyo sonicator kullanarak 20 ila 30 saniye için süspansiyon sonciate. Iyon kanal proteinleri içeren proteolipozomların hazırlanması için, çok katmanlı vezikül süspansiyon bir protein çözeltisi ekleyin. Ve banyo sonicator kullanarak birkaç saniye sonicate.Büyük delikli cam pipetler hazırlamak için, bir pipet çekmecebir cam kılcal yerleştirin ve iki adım çekerek ince konik ucu ile mikro pipet imal. Daha sonra mikro pipeti mikro bir forge üzerine ayarlayın ve mikropipetin ucunu 30 ila 50 mikrometre çapında konik kısımdaki platin iplikle tulaşın. Filamenti kısa bir süre ısıtın ve hemen kapatın.Distile su ve etanol kullanarak sığ bir kuyu ile cam slayt yüzeyini temizleyin. Daha sonra cam kaydırak üzerine silikonlaştırıcı reaktif uygulayın ve reaktif tamamen havada kurumasını bekleyin. Sonra ters bir mikroskop sahnesine cam slayt yerleştirin.Silikonlu cam slayt sığ kuyuiçine heksadecane 100 mikrolitre ekleyin. Bir tüberkülin şırınga kullanarak mikropipetin yarısına kadar elektrolit çözeltisi doldurun. Daha sonra mikropipeti basınç portlu mikropipet tutucuya ayarlayın ve gümüş/gümüş klorür telelektrotun pipet elektrolit çözeltisine batırMasını sağlar.Mikropipet tutuculardan birini yama kelepçesi amplifikatörünün baş aşamasına, diğerini de elektrik zeminine bağlayın. Daha sonra mikropipet tutucunun basınç portuna bir mikroenjektör bağlayın. Mikropipeti, mikromanipülörü kullanarak ters bir mikroskop un sahnesinin üzerinde uygun bir konuma ayarlayın.Elektrot ofset potansiyelini ayarlamak için, bir elektrolit kubbe oluşturmak için cam slayt sığ kuyu etrafında düz yüzeyüzerinde mikropipet doldurmak için kullanılan aynı elektrolit çözeltisinin bir mikrolitre yerleştirin. Her iki mikropipetin ucunu elektrolit kubbesinde ıslatın. Daha sonra yama kelepçesi amplifikatörünün elektrot ofset potansiyelini ayarlayın.Ucundan lipozom çözeltisi çizmek için, slayt cam sığ kuyu etrafında düz yüzeye lipozom çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Sonraki yer lipozom kubbe içeren mikropipet ucu. Mikroenjektör kullanarak lipozom içeren çözeltiyi aspire edin.Kanal yeniden lipozomlar yeniden spirating için diğer mircopipette için prosedürü tekrarlayın. Şimdi sığ kuyuda heksadecane içinde mikropipet yerleştirin. Kabarcık istenilen boyuta ulaşana kadar basıncı artırarak yavaş yavaş bir su kabarcığı darbe ve bundan sonra aynı basıncı korumak.Kabarcığın boyutunu sabit tutmak zorsa, yağ-hava arabiriminden ucu geçirerek kabarcığı atın. İki kararlı kabarcık lar oluşana kadar yordamları tekrarlayın. Iki kabarcıklar arasında bir temas kurun.Boyutu yavaş yavaş sabit kabarcık içi basınç bile değişebilir, çünkü kabarcık boyutunu korumak için basınç ince ayar. Yama talep amplifikatörü kullanarak membran potansiyelini uygun değere ayarlayın ve kanal akımının ortaya çıkmasını bekleyin. Kararlı lipid çift katmanlı oluşumu için lekeleri temizlemek için gereklidir.Cam kılcal damar veya pipet hazırlama iyice yıkanmalı ve deterjan molekülleri tarafından kontaminasyon önlenmelidir. CBB kanal moleküllerini oluşturduktan sonra ya sulu çözeltide ya da lipozomda birkaç ila düzinelerce dakika içinde çift katmanlı içine kendiliğinden yerleştirildi. Kanalların eklemeleri, uygulanan membran potansiyeli altında mevcut genliğin adım adım artması yla doğrulandı.CBB yöntemi ile oluşturulan bir çift katmanlı iki tek katmanlı parçalanabilir. PTB kanal akımı iki tek katmanlı taktıktan hemen sonra ortaya çıktı. Ve temas genliği arttıkça akım daha büyük oldu akım CBB'nin detach eklemek manipülasyonu ile senkronize edildi.Kabarcıkların sayısı patlarsa sulu çözeltideki lipid konsantrasyonu azalır ve monolayer oluşmaz. Sonra lipozom bölümünde baskıyı hafifletmeye çalışın. CBB oluşumu ve kanal reconstitution kurulduktan sonra profüzyon veya hidrofilik veya hidrofobik maddeler enjekte yoluyla sulu çözelti ve membran bileşimlerini değiştirmek için deneyebilirsiniz.CBB yöntemi kanal membran interplays keşfetmek için çok yönlü yollar açmıştır.

lipid-bilayer-experiments-with-contact-bubble-bilayers-for-patch

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Membran protein fonksiyonu, hücre zarı lipid bileşimi tarafından düzenlenir. Bu video-makale nasıl değişmiş membran özellikleri gazetecilere olarak çift katlı yama elektrotlar, hem de nasıl kullanılacağı gibi gramicidin kanallarını kullanarak bir yama oluşturmak için ayrıntıları.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Düzlemsel çift katlı lipit katmanını da adlandırılan yapay çift katlı lipit katmanını, çalışma izin iyon iletken, iyi tanımlanmış bir ortamda kanal. Burada, bilayeri odası hazırlamak için gerekli bireysel adımlar, elektrotlar ve nasıl bilayeri tek kanal ölçümleri için uygun olup olmadığını test etmek için ortaya koymaktadır.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Bu videoda, toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak in vitro olarak cam destekli bir lipid çift tabakası üzerinde septin organizasyonunu araştırmak için bir prosedür gösteriyoruz.

Düzlemsel Destekli Lipid Bilayer Deneyi: Biyolojik Membran Mimiklerinde Septin Montajını Araştırmak İçin Mikroskopi Tabanlı İn Vitro Teknik

Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb'leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb'leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

Bu protokol, yüksek erime sıcaklıklarına sahip lipitler için lipid monolayer montajını ve damlacık arayüzü bilayer oluşumunu teşvik etmek için geri bildirim sıcaklığı kontrollü bir ısıtma sisteminin kullanımını ve membrandaki sıcaklık odaklı değişiklikleri karakterize etmek için kapasitans ölçümlerini detaylandırıyor.

Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin, iletişim balonu lipid çift katmanı yöntemiyle tek kanal akım kayıtları için biyofiziksel elektrofizyoloji tekniklerini. Bu yöntem, membran dinamikleri ve kanal-membran etkileşimlerini yüksek sinyal-gürültü oranıyla incelemeyi sağlar.

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Daha fazla video keşfet