Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO₂ boncuk hazırlanması için Protein Saflaştırma

Bu yöntem, ilaç dağıtımı, biyolojik hedef tespiti ve biyo ayrışma gibi alanlarda uygulamaları olan biyomolekülle aktive edilmiş yüzeylerin hazırlanmasında kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, poli PFPA fırçaların aminlerle son derece reaktif olması ve antikorların immobilizasyonunun tampon çözeltide birkaç saat kuluçka ile elde edilmesidir. Immobilize antikor başarıyla hedef antijenler ile bağlamak gibi bu tekniğin etkileri, immünpurifikasyon yoluyla protein saflaştırma doğru uzanır.

Bu yöntem antikor mobilizasyonu ve protein arınması için gösterilmiş olsa da, biyomoleküler mobilizasyon gerektiren diğer sistemlere de uygulanabilir. APTES ile silikon dioksit boncukları tedavi etmek için, ilk% 5 ağırlık hacmi sulu süspansiyon şeklinde silikon dioksit parçacıkları elde. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 20 mililitre scintillation vial 40 miligram APTES ile silikon dioksit süspansiyon 0.8 mililitre ve metanol sekiz mililitre birleştirin.

Reaksiyonun oda sıcaklığında beş saat boyunca kuvvetli karıştırma ile devam etmesine izin verin. Beş saat sonra, konik bir tüp için çözüm aktarın. APTES fonksiyonel silikon dioksit boncukları izole etmek için, çözeltiyi 10,000 G'de beş dakika santrifüj edin.

Sonra supernatant çıkarın. Şimdi taze metanol üç mililitre onları redispursing tarafından boncukyı yıkayın. Karıştırma için elle tüp çalkalayın, ancak gerekirse, birkaç saniye için bir su banyosunda sonication tarafından dağılım geliştirmek.

Santrifüj daha önce olduğu gibi, ve yıkama adım ını bir kez daha tekrarlayın. Metanol yıkama silikon dioksit boncuklar dimetil sülfoksit üç mililitre veya DMSO ile birleştirin. Karışımı elle çalkalayın veya gerekirse boncuklar DMSO'da tamamen dağılana kadar birkaç saniye sonicate yapın.

Daha önce santrifüj den sonra, supernatant çıkarın. Metanolden DMSO'ya tam çözücü değişimi sağlamak için santrifüj adımını son bir kez tekrarlayın. Poli PFPA çözeltisini hazırlamak için, 20 mililitrelik sintilasyon flakonunda iki mililitre DMSO'da 20 miligram poli PFPA çözün.

PEG çözeltisi hazırlamak için amin fonksiyonel PEG'i bir mililitre DMSO'da çözün. Şimdi PEG çözeltisini poli PFPA çözeltisine aktarın. Güçlü karıştırma ile bir saat oda sıcaklığında tepki.

DMSO'da askıya alınan APTES fonksiyonel silikon dioksit boncuklarının bir mililitresini PEG yerine bulunan poli PFPA çözeltisine aktarın. Poli PFPA ve APTES fonksiyonel silikon dioksit boncuklar arasındaki greftleme kuvvetli karıştırma ile bir saat oda sıcaklığında devam etmek için izin verin. Daha sonra 10, 000 G'de beş dakika boyunca santrifüj le boncukları izole edin ve ardından süpernatantın çıkarılmasını bekleyin.

DMSO üç mililitre ekleyerek boncukyı yıkayın ve elle veya sonication birkaç saniye ile karıştırın. Boncukları daha önce olduğu gibi santrifüj edin. DMSO yıkamayı iki kez tekrarlamadan önce supernatant'ı çıkarın.

Üç mililitre üç distile su ile boncukları iki kez daha yıkayın. Sonra elle veya sonication birkaç saniye ile karıştırın. Daha önce olduğu gibi boncuk santrifüj ve supernatant kaldırın.

Son olarak bir vakum fırında bir gecede 40 derece santigrat boncuk kuru. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne beş miligram poli PFPA aşılı silikon dioksit boncuk ekleyin. 800 mikrolitre PBS ekleyerek boncukları yıkayın ve girdap yaparak iyice karıştırın.

Boncukları 10,000 G'de oda sıcaklığında bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve yıkama adımı üç kez tekrarlayın. Şimdi taze PBS 350 mikrolitre, 0.1% PBST 50 mikrolitre ve antikor 6.67 mikrogram ekleyin.

Dört santigrat derecede bir rotator üzerinde yaklaşık 20 saat kuluçka. Ertesi gün, boncukları ve santrifüjleri 400 G ve 4 derece santigrat derecede bir dakika yıkayın. Sonra supernatant çıkarın ve dikkatle lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin.

Boncukları beş kez aşağı yukarı borulandırarak yavaşça askıya alın. Bu yıkama adımLarını üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, mümkün olduğunca supernatant kadar çıkarın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri ve lysis arabelleği hazırlayın. Daha sonra 400 mikrolitre likis tamponu ile hücre peletini yeniden askıya alın. Ultra sonicator kullanarak hücreleri sonicate.

Sonication sonra, girdap kısaca. Sonra 20, 000 G'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca lysate santrifüj edin. Supernatant'ı yeni, 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpe aktarın.

İmmünoenare rendelenerek, 300 mikrolitre hücre lisatını daha önce hazırlanmış antikor immobilize edilmiş poli PFPA aşılı silikon dioksit boncuklarına aktarın. Yeni bir mikrosantrifüj tüpte giriş örneği olarak hücre lisatının 30 mikrolitresini saklayın. Lysate boncuk karışımını dört derece lik bir rotatörde üç saat kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra karışımı 400 G'de 4 derece santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve dikkatle yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin. Boncukları yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı borulandırarak yavaşça askıya alın.

Üç yıkar sonra, mümkün olduğunca supernatant kadar çıkarın. Boncuklara ve giriş örneğine 30 mikrolitre 2x SDS yükleme boyası ekleyin. Sonra 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.

Isıtma dan sonra, batı lekeleme kullanarak örnek analiz veya eksi 20 derece santigrat derece de örnek saklayın. İşlevselleştirilmiş silika boncuklar yüzey kompozisyonu belirlemek için x-ışını fotoelektron spektroskopisi veya XPS ile incelenir. Temsilci XPS verileri burada gösterilmiştir.

APTES tedavisinden sonra, amin grubu bölgesi APTES ile ilişkili azot 1s tepe saptanır. Poli PFPA tedavisinden sonra polimer üzerindeki PFP üniteleri ile ilişkili flor 1s tepe saptanır. Protein kinaz RNA aktive, veya immünopredi ile PKR zenginleştirme yapılır, ve ima protein örneği batı blotting kullanılarak analiz edilir.

Beklendiği gibi, hiçbir antikor ile immobilize boncuklar, ya da non-spesifik antikor mikser hiçbir PKR kurtarma göstermektedir. Anti-PKR ile inkübe boncukbaşarıyla pkr bandı varlığı ve GAPDH bandının yokluğunda belirtildiği gibi PKR zenginleştirmek olabilir. Bu yordamı denerken, sistemlerin karşılaştırılması sırasında, IP deneyleri ve sonraki batı lekeleme analizinin aynı anda yapılması gerektiğini unutmamak gerekir.

Gelişiminden sonra, bu teknik farklı biyomoleküler veya malzeme substrat immobilizasyonu için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem, her uygulamanın ihtiyacına göre uyarlanacak yalnızca yüzey özelliğini ayarı ek yararı vardır.