Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin
January 9th, 2019
Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.
Bu yöntem, immüno-metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, farklı hücre tiplerinin karmaşık bir karışımı nda, tek tek canlı hücrelerde mitokondri veya lizozomların sayısallaştırılmasına olanak sağlamasıdır. T ve B hücrelerini incelemek için kullanılan bu yöntem, makrofajlar, dendritik hücreler veya doku örneğinden alınan birincil hücreler gibi diğer birçok hücre tipine de uygulanabilir.
Prosedür, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Chin-Wen Wei tarafından kanıtlanacak. Sayısallaştırma için organelleri etiketlemek için, ilk olarak, işaretçi başına bir yuvarlak alt faks tüpüne altıncı fare T hücrelerine bir kez on ekleyin. Ve santrifüj ile hücreleri pelet.
37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış serumsuz kültür ortamı, organel ekibe özgü prob stok çözeltilerini ortamdaki son çalışma konsantrasyonlarına seyreltmek için kullanılır. Ve tüpler başına 100 mikrolitre probu boyasında hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, uygun boyama dönemi için bir hücre kültürü kuluçka hücreleri kuluçka, tüp başına buz gibi faks tampon bir mililitre ile kuluçka sonunda reaksiyonu durdurarak.
Sonra, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve önceden titremiş 24G2 hibridoma supernatant buz üzerinde 100 mikrolitre pelet yeniden askıya. On dakika sonra, tüp başına faks tampon bir mililitre ekleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve ilgi önceden titremiş floresan kontrküllü antikor kokteyl 50 mikrolitre ile hücreleri etiket.
Tabloya göre uygun konsantrasyonu ekleyin. Ve faks tamponu 20 dakika boyunca buzda, ışıktan korunuyor. Kuluçka sonunda, tüp başına faks tampon bir mililitre ekleyin.
Santrifüj ile hücreleri toplayın. Ve 300 mikrolitre lik faks tamponundaki hücreleri mililitre de propidium iyodür başına bir mikrogramla yeniden askıya alın. Nükleer ve kromozom karşılemi ni ekledikten hemen sonra, akış sitometre analiz bilgisayarını, akış sitometresini, faks edinme yazılımını ve makine platformuna bağlı olarak diğer aksesuar cihazlarını açın.
Akış çizgisinin PBS ile dolu olduğundan ve tamponu sabitlemediğinden emin olmak için PBS'yi yaklaşık bir dakika boyunca sistemde çalıştırın. Yeni bir deneme açın ve sitometre parametrelerini üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.
Ve girdap önce her örnek elde kümeleri ve doublet oluşumunu önlemek için. Otomatik Telafi ayarını açın ve her floresan parametre için nokta çizimleri oluşturun. Tüm gerilimler ayarlandıktan sonra, tazminatı ayarlayın ve telafiyi numunelere uygulayın.
Yan dağılım çizimine karşı ileri bir dağılım oluşturun ve ilgi hücrelerinin çizim içinde görünmesi için gerilimleri optimize edin. İleri dağılım adağı ile ileri dağılım yüksekliği çizimi oluşturun ve tek hücreleri kapama. Yan dağılım alanı arsa karşı bir ileri dağılım alanı oluşturun ve lenfositler kapısı.
Propidium iyodür çizimine karşı bir ileri dağılım alanı oluşturun ve canlı hücreleri kapayın. Tüm gerilimler ayarlandıktan sonra, tazminatı ayarlayın ve telafiyi numunelere uygulayın. Daha sonra ilk örnek tüpü yükleyin, uygun hücre yüzeyi işaretçisi çizimlerini oluşturun ve ilgi çeken nüfusun en az 1.000 olayını toplayın.
Tüm örnekler çalıştırıldığında, sonraki çözümleme için akış verilerini dışa aktarın. Ve gelecekte benzer deneyler için sitometre ayarlarını ve parametreleri korumak için denemeyi şablon olarak kaydedin. Son site mitokondriyal içerikçift negatif bir T hücrelerinde en düşük, çift negatif evre iki ve üç zirve, ve biraz çift negatif evre dört azalma.
Cd4 ve CD8 tek pozitif timositlere göre mitokondri sayısının daha yüksek olduğunu gösteren çift pozitif timositler ile mitokondriyal içeriğinin gelişim sırasında dalgalandığını düşündürmektedir. CD4 ve CD8 tek pozitif timositler, splenik CD4 veya CD8 T hücrelerinden daha yüksek mitokondriyal ortalama floresan yoğunluğu sergilerler ve oksijen açısından zengin kan ortamında dolaşan naif T hücrelerinin timositlerden daha düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğunu düşündürmektedir. İlginçtir, mitokondriyal içeriğin bu azalma CD4 T hücre soyundan daha CD8 daha belirgindir, ve T hücre aktivasyonu daha bu organellerin varlığını azaltır.
Tüm timosit popülasyonlarında nispeten düşük, ancak saptanabilen, lisozomal içerikler gözlenir ve çift negatif bir timositte daha belirgin dir. Çevrede bellek ve efektör CD8 pozitif T hücrelerinde nispeten yüksek sayıda izozom tespit edilir. Organel spesifik boyalar ve yüzey belirteci ile akış sitometrisi birleştirilmesi karmaşık bir karışım hücrelerin metabolik durumunu karakterize etmek için güçlü bir yoldur.
Ek organel spesifik boya endoplazmik retikulum tespit etmek için kullanılabilir, otophagic vakuol, veya ilgi diğer hücre içi bölmesi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, canlı hücrelerde mitokondri veya lizozomları kantitativ ölçmek için güçlü bir yöntemi göstermektedir. Bu teknik, farklı hücre türlerinin karmaşık karışımları içindeki bireysel canlı hücrelerde bu organellerin kantitativ ölçümü için olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
- Metabolizma
Arka Plan
- Organellerin kantitativ ölçümü, hücresel fonksiyonları anlamak için çok önemlidir.
- Bu yöntem T ve B hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre türlerine uygulanabilir.
- Lizozom veya mitokondri spesifik boyaları ile floresan konjuge antikorlar kullanarak kantitativ ölçüm yapar.
- Analizler için akış sitometrisi kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Karma hücre popülasyonlarında organellerin kantitativ ölçümü için bir yöntem sunmak.
- İmmuno-metabolizma hakkındaki anlayışı geliştirmek.
- Bu tekniği doku örneklerinden elde edilen primer hücrelerde uygulamayı göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Yuvarlak tabanlı bir fax tüpünde fare T hücrelerinin hazırlanması.
- Hücrelerin pelet halinde çökeltilmesi için santrifüjlemeyi.
- Organellerin spesifik boyalarla etiketlenmesi.
- Çok renkli akış sitometrisi kullanılarak analiz yapılması.
Ana Sonuçlar
- Bu yöntem, mitokondri ve lizozomların kesin kantitativ ölçümüne izin verir.
- Farklı hücre türlerini ayırt etmede etkilidir.
- Çeşitli primer hücrelerde uygulanabilirliğini göstermiştir.
- İmmuno-metabolizma araştırmalarını kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Bu teknik, hücresel organelleri incelemek için değerli bir araçtır.
- Hücrelerin metabolik durumuna dair içgörüler sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar diğer hücre biyolojisi alanlarına genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying mitochondrial and lysosomal dynamics in T cells provides critical insights into immuno-metabolic reprogramming during immune responses. This method enables high-resolution, single-cell analysis of organelle content within heterogeneous populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. By linking organelle metrics to functional states, it enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial and lysosomal flux to T cell differentiation and activation states.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative organelle readouts that reflect metabolic fitness.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying metabolic vulnerabilities in pathogenic T cell subsets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline organelle metrics in primary T cells.
- Reproducibility: Standardizes organelle quantification via flow cytometry, enabling consistent readouts across screening campaigns.
- Scalability: Supports multiplexed analysis of organelle content alongside surface markers for high-content phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial and lysosomal dynamics to T cell-mediated pathologies in autoimmune and cancer models.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase metabolic profiling with preclinical validation of immunomodulatory candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating organelle shifts with functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling metabolic phenotyping as a filter for immunomodulatory activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying organelle responses to genetic or pharmacological perturbations in T cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for lysosomal and mitochondrial content that are compatible with flow cytometry-based screening platforms.
- Analytics: Generates mean fluorescence intensity and percentage-positive metrics that allow comparison of metabolic states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects organelle metrics to preclinical continuity by tracking metabolic adaptation in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry panel for immunometabolic profiling across multiple projects and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in T cell metabolic regulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through standardized dye protocols and compensation controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying metabolically compromised or hyperactive T cell states early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their impact on mitochondrial and lysosomal homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design and organelle-specific dye titration.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient fluorescence channels for multiplexed organelle and surface marker detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-lymphoid primary cells or tissue-derived samples.
- Limited by the availability and specificity of organelle dyes, which may require validation in new model systems.
