Name: Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Keşfedin, eş-pürifiye edici dizilerden ayrıştırılamayan yeni genomik dizileri tanımlama yöntemini. Ücretsiz yazılım kullanan bu hesaplamalı protokol, bakteri aşı hedefleri ve bilinmeyen viral dizileri belirlemede esneklik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Michelle Biederman, Alyssa Pedersen ve Colin J. Saldanha çeşitli aşamalarında zebra finch genomik proje ile onların yardımını kabul edersiniz. Ayrıca Evgeny Bisk küme sistem yönetimi ve NIH grant 1K22CA184297 (için J.R.B.) ve NIH NS 042767 (C.J.S için) bilgi işlem için kabul.

1. de novo araya başlayarak sırası
Not: derleme bu verilerden üretilebilir sürece herhangi bir yeni nesil sıralı (NGS) verileri, kullanılabilir. Illumina, PacBio, uygun giriş verileri içerir veya Oxford Nanopore bir fasta dosyaya monte okur. Concreteness için bu bölümde açıklanmaktadır bir Illumina tabanlı transcriptomic derleme belirli zebra finch bir çalışma biz gerçekleştirilen7; Ancak ayrıntıları projeye göre değişir unutmayın. Bizim örnek proje için ham veri--dan bir MiSeq elde edilmiştir ve yaklaşık 10 milyon eşleştirilmiş okuma her örnekten elde edilmiştir.
<ol><li>Trimmomatic 0,3214 Illumina adaptörleri ve düşük kaliteli üsleri kaldırmak için kullanın. Komut satırında girin: Java-jar trimmomatic 0.32.jar PE-phred33 forward.fq.gz reverse.fq.gz - baseout quality_and_adaptor_trimmed ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 satır aralığı: 3 firar: 3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:40
</li>
	<li>ARMUT15 0.9.6 v. yüksek kaliteli birleştirilmiş okuma trimmomatic çıkış eşleştirilmiş okur, varsayılan parametrelerini kullanarak oluşturmak için kullanın. Komut satırında girin: armut -f < quality_and_adaptor_trimmed_1P.fastq > - r < quality_and_adaptor_trimmed_2P.fastq >
</li>
	<li>Kullanım sürüngen v. 1,116 hatayı düzeltmek için armut okuma üretilen. 17' açıklanan adım adım iletişim kuralı izleyin.</li>
	<li>Trinity 2.4.0 v. kullanın18 düzeltilmiş dizileri montajı için varsayılan modunda. Strand özel kütüphaneler için kullanın - SS_lib_type parametresi. Çıkış (your_assembly.fasta) bir fasta dosyasıdır. Komut satırında girin: Trinity..... seqType fq--SS_lib_type FR-max_memory 10G-Trinity_output quality_and_adaptor_trimmed_forward_paired_reads.fq yaptı--çıkış – quality_and_adaptor_trimmed_reverse_paired_reads.fq – CPU 10 sağ Not: Çıkış yeni bir dizin, Trinity_output, yer alacak ve derleme 'Trinity.fasta' istenirse Your_assembly.fasta adlandırılabilir isimlendirilecektir. Trinity Web sitesi daha fazla bilgi için bkz: https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Running-Trinity.</li>
</ol>2. patlama derleme başvuru sıra karşı
Not: Kullanım başvuru bir derleme veya uzun olduğunda bu adımı Sanger gibi okur; in oluşuyorsa ham Illumina okur, okuma için sorgu eşleştirmek için adım 3 aşağı bakın. Komutları-meli iş üstünde birisi son patlama yorum-se bile tüm patlama adımları sürüm 2.2.29+ ile tamamlandı.
<ol><li>Bir patlama veritabanı başvuru sırası (nucleotide_reference.fasta) komut satırında olun. Komut satırında aşağıdakini girin: makeblastdb - dbtype nucl-nucleotide_reference.fasta içinde-nucleotide_reference.db dışarı
</li>
	<li>PATLAMA-maç (1. adımda oluşturulan) sorgu derlemesi için başvuru veritabanı. Bir çıkış dosyası elde etmek için kullanın [-BLAST_results.txt dışarı] ve [-outfmt 6] tablo çıkış (Python komut dosyaları ile sonraki işlem adımları için gerekli) oluşturmak için kullanın. Bu seçeneklerin herhangi bir sıra ile kombine edilebilir, bir örneği tamamlamak için emirdir [blastn-your_assembly.fasta - db nucleotide_reference.db sorgulamak-BLAST_results.txt - outfmt 6 dışarı]. Bir e-değer ayarı isterseniz - evalue seçeneği örnek [evalue-1e-6] için uygun bir rakam ile kullanın. Ancak bu Eksiltici döngüsü etkili bir şekilde tartışmaya açıklandığı gibi ayarlar evalue ters çevirir unutmayın.</li>
	<li>Artan sıkılık için protein dizileri derlemeden ile çevrilmiş nükleotit 6-yönlü çeviri (nükleotit) veritabanının gerçekleştirir (tBLASTn), patlama patlama sorguyu kullanın. Bu yöntem eksik protein ek açıklamaları sorun kaçınarak çoğu modeli olmayan sistemler için önerilir.<ol>
<li>Doğru genetik kodu organizma olduğu için seçili emin olmak okudu, kullanarak - db_gencode seçeneği. Sorgu için protein serileri elde etmek için TransDecoder.LongOrfs komutunu (3.0.1 v. TransDecoder paketinden) birleştirilmiş sorgu dizilerinden en uzun açık okuma çerçevesi tanımlamak için çalıştırın. [TransDecoder.LongOrfs -t your_assembly.fasta] emirdir; Çıkış 'transcripts.transdecoder_dir' adlı dizin içinde yer alacak ve your_assembly.fasta her serisinden en uzun tahmini protein dizileri içeren longest_orfs.pep adlı bir dosya içerir.</li>
		<li>TBLASTn kullanmak için koşmak belgili tanımlık buyurmak [tblastn-longest_orfs.pep - db nucleotide_reference.db sorgulamak-BLAST_results.txt - outfmt 6 dışarı]. Yüksek kaliteli protein başvuru varsa, protein-protein tBLASTn yerine BLASTp ile eşleşen kullanın.</li>
		<li>Bir patlama veritabanı protein referans yapmak [makeblastdb - dbtype prot-protein_reference.fasta içinde-protein_reference.db dışarı] ve sonra [blastp-longest_orfs.pep - db protein_reference.db sorgulamak-BLAST_results.txt - outfmt 6 dışarı]. Sonuçlar için aşağı akım işlem dosyası olarak kaydettiğinizden emin olun ve Python komut dosyaları doğru şekilde ayrıştırılır emin olmak için tablo (outfmt 6) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. harita derleme okur
Not: Bu yöntem ham genomik okuma yerine monte diziler başvuru veri kümesi oluşur veya Sanger dizileri, hangi durumda kullanımda patlama (adım 2.1) kullanılabilir.
<ol><li>BWA kullanarak-MEM 0.7.12 v.19 veya bowtie220, sorgu derleme üzerine indirilen ham okuma (raw_reads.fastq) göster. Çıkış .sam biçimi olacaktır. Komutlar şunlardır: ilk derleme dizin: [bwa Dizin your_assembly.fasta] ve sonra okuma eşleme [bwa mem your_assembly.fasta raw_reads.fastq > mapped.sam]. (Not ' >' sembol daha büyük bir değil-daha imzalamak; bunun yerine dosya mapped.sam gitmek için çıktı bildirir).</li>
</ol>4. herhangi bir eşleştirme dizileri kaldırmak için Python komut dosyası kullanma
Not: komut dosyaları iş Python 2.7 ile sağlanan.
<ol><li>2. adımda [./Non-matching_sequences.py your_assembly.fasta BLAST_results.txt] komutunu kullanarak Eksiltici Python komut dosyasını kullanın. Komut dosyasını çalıştırmadan önce patlama çıktı dosyası biçimi 6 (sekmeli) olduğundan emin olun. Komut çıktısı bir dosyayla eşleşmeyen serilerinde fasta formatı your_assembly.fasta_non-matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta adlı ve aynı zamanda eşleşen kayıtları için your_assembly.fasta_matching_sequences_BLAST_ dizileri results.txt.fasta. Sigara eşleşen dosya en önemli, test için potansiyel T sıralarının bir kaynak ve daha fazla Eksiltici genomik döngüleri olarak olacaktır.</li>
	<li>Adım 3, Python komut dosyası removeUnmapped.py olarak almak çalıştırmak takip adım 3.1, .sam girin ve eşleşen herhangi bir okuma olmadan sorgu sıralarının adları tanımlar ve yeni bir metin dosyasına kaydeder. [./RemoveUnmapped.py mapped.sam] komutunu kullanın ve çıkış mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt olacaktır. (Program kaldırıldı tüm bağlanılmayan okuma ile bir slimmed aşağı sam dosyası oluşturur; resimi bu protokolü amaçları doğrultusunda yoksayılabilir ama diğer analizler için yararlı olabilir).</li>
	<li>Önceki adımı mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt adlı bir metin dosyası sıra adları listesi çıktı gibi bu DNA dizileri ile fasta dosyasını ayıklayın: [./getContig.py your_assembly.fasta mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt]. Çıkış mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt.fasta adlı bir dosya olacaktır.</li>
</ol>5. tasarım astar kalır serisi için
Not: Bu aşamada aday T dizileri içeren bir fasta dosya yoktur. QPCR deneysel olarak T ya da r. önceden bilinmeyen bölgelerden gelen olup olmadığını sınamak için bu bölümde açıklanmaktadır Adım 4'te çıkarma tüm dizileri kaldırdıktan sonra T eklemek ilk derleme başarısız oldu veya çıkarma çok sıkı olabilir.
<ol><li>Geneious21 en uygun astar dizileri el ile belirlemek için kullanın.<ol>
<li>21-28 bp ileri astar için aday dizisi vurgulayın. 4 veya daha fazla herhangi bir Bankası nöbetleri önlemek. Tüm basepairs oldukça düzgün bir kombinasyonu ile bir bölge hedeflemek deneyin. Tek bir G veya C 3' ucunda astar tutturmak yardım, faydalıdır.</li>
		<li>Aday bölge vurgulandığında sırasının erime sıcaklığı (Tm) tahmini görüntülemek için ekranın sağ tarafında İstatistikleri sekmesinde tıklayın. Erime sıcaklığı arasındaki 55-60 ° C tekrarlar ve uzun ishal G/c kaçınırken, elde etmek için bak</li>
		<li>5.1.1 adımları. ve geriye doğru bir astar seçmek için 5.1.2 yer alan 150-250 baz çifti 3' ileri astar. Astar uzunluğu eşleşmesi gerekmez, tahmin edilen Tm mümkün olduğu kadar yakın ileri astar Tm için olmalıdır. Tamamlayıcı sırasını tersine çevirmek emin olun (sıra vurgulanır iken Geneious içinde sağ Eğer menü seçenektir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıra penceredeki üst araç çubuğunda bulunan Astar dizayn işlevini kullanın.<ol>
<li>Astar tasarım düğmesini tıklatın. Hedef bölgealtında yükseltmek için bölge ekleme.</li>
		<li>Özellikleri sekmesi altında istediğiniz boyuta, erime sıcaklığı (Tm) ve % GC (bkz. Adım 5.1.1.) ekleyin.</li>
		<li>Oluşturulan astar için Tamam düğmesini tıklatın. Astar özel oligo servisi üzerinden sipariş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Astar (T ve R kodlama) denetim DNA ile Tm ve uzantısı zaman optimize etmek için doğrulayın. Grup boyutunu görmek için düzenli Taq ve jel elektroforez kullanır, ancak en iyi duruma getirme yöntemleri 6. adımda takip qPCR ile de yapılabilir.<ol>
<li>Böylece astar 10 mikron bir konsantrasyon ileriye ve geriye doğru astar, 10 X dilutions olun.</li>
		<li>Böylece 5 bir konsantrasyon ile şablonu başına 25 μL dNTP 0.5 μL, 0.5 μL ileri astar, 0.5 μL ters astar, Taq polimeraz 0.1 μL, 2 μL şablonunun, magnezyum 0,75 μL, arabelleği 2.5 μL ve su 18.15 μL PCR karışımı kullanın ng / μL.</li>
		<li>PCR programda astar farklı erime sıcaklıkları adlı sınayın. Genellikle en iyi performans gözlenen erime sıcaklıkları biraz aşağıda öngörülen Tm astar, fakat genellikle 60 ° c üzerinde olduğunu Ayrıca bu kılavuzu kullanarak kez en iyi uzantısı için test: 1 min başına 1000 bp (böylece, genellikle 10-30 saniye amplicon uzunluğu bağlı olarak).</li>
		<li>Son nokta jel elektroforez astar beklenen sıra yükseltmek onaylamak için gerçekleştirin. 6 X gliserol boya 200 V 20 dk için % 2 TAE özel jel üzerinde 5 μL ile karışık qPCR ürünün 25 μL çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. qPCR kalan sırasının doğrulama
Not: Bu adımı doğrulanmış astar ve adım 5'te kurulan PCR koşulları gerektirir.
<ol><li>Her şablon nüsha aşağıdaki karışımı ile çalıştırmak; PowerSYBR yeşil ana Mix 12.5 μL, ileri astar 0.5 μL 10 mikron, ters astar 0.5 μL 10 mikron, 10.5 μL su ve 1 μL şablonunun DNA (at 2 ng/μL bir konsantrasyon) bir konsantrasyon ile bir konsantrasyon ile , böylece her şey toplam hacminin 25 μL içerir.</li>
	<li>Doğrulanmış sıcaklık ve adım 4 uzantısı zaman haberdar qPCR programını çalıştırın. Tasarlanmış ve bir iki aşamalı döngü, için 10 dk ilk eritebilir, 95 ° C ile uyumlu olacak şekilde tüm astar doğrulanmış sonra 40 döngüleri 95 ° C 30 ve 60 ° C için 1 dk için. Ancak, bir üç aşamalı programı (erime-tavlama-uzatmak) astar için daha uygun olabilir ve gerekirse adapte olmalıdır. Son denaturing eğrileri en az astar qPCR içinde tek bir DNA ürün amplifikasyon doğrulamak için istihdam edilmektedir ilk kez oluşturulması tavsiye ediyoruz.</li>
	<li>Ölçü qPCR/SYBR yeşil sinyalleri aktin (veya herhangi bir diğer uygun 'R' denetimi) göreceli olarak CT için tarafından her zaman hesaplamak ortalama ve standart sapmayı 2-(gen Ct - β-aktin Ct).</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Doğru ürün boyutu algılama qPCR tarafından onaylamak için son nokta jel elektroforez gerçekleştirin. Burada, 6 x gliserol boya 200 V 20 dk için % 2 TAE özel jel üzerinde 5 μL ile karışık qPCR ürünün 25 μL çalıştırın.</li>
</ol>7. Pare bilgi yeni bir başvuru ile yineleyin .
Not: adım 6 t tanımlanan dizileri doğrulanmış, (Şekil 2A) döngüsü sona. Ancak, dikkat edilmesi gereken noktalar çeşitli döngüsü, örneğin çok R dizileri dosyasında kalır veya adım 6'aday T dizileri hiçbiri qPCR tarafından doğrulanmış Eğer bir devamıdır motive.
<ol><li>Yeni bir referans elde edilir. Bu adım yeni bir yineleme döngüsü sağlar ve ham genomik veri, ham RNA-seq veri ve diğer birleştirilmiş veri kümelerini içerebilir. Biyoteknoloji genleri (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/), FTP aracılığıyla erişilebilir hangi mağazalarda monte bilgi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) için genom veritabanı Ulusal Merkezi referans veri için değerli kaynaklar dahil ve gen ifade ham yeni nesil sıralı okuma depolandığı Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Genom projeleri diğer proje ilgili web siteleri ve veritabanları üzerinden kendi ham sıra veri sağlayabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li>
<li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer+Science+%26+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science & Systems Biology. 2 (5), (2009).</li>
<li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li>
<li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li>
<li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GBV-D%2C+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+%28Pteropus+giganteus%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li>
<li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li>
<li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch%2C+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li>
<li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer%27s+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular%2C+Genetic%2C+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li>
<li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+virome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li>
<li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li>
<li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li>
<li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+a+songbird%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li>
<li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEAR%3A+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li>
<li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reptile%3A+representative+tiling+for+short+read+error+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li>
<li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li>
<li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+sequence+reads%2C+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geneious+Basic%3A+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li>
<li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li>
<li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAPR+citation%3A+REAPR%3A+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li>
<li>Gunnarsdóttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae%3A+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species%3A+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biologyogy+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li>
<li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li>
<li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics%27+GemCode+Sequencing+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li>
<li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed-field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Eksiltici genomik güçlü olmakla birlikte, özelleştirme birkaç önemli adımlar ve başvuru dizileri ve test örnekleri dikkatli seçimi gerektiren bir çerez kesici yaklaşım değildir. Sorgu derleme kalitesiz ise, adımları süzme yalnızca derleme eserler izole. Bu nedenle, iyice belirli proje için bir uygun doğrulama protokolü kullanılarak de novo derleme doğrulanması önemlidir. RNA-seq için yönergeleri Tarih teslis Web sitesi18 ve DNA'ın, REAPR23 kullanılabilir gibi bir a...

Bu yöntemin amacı bir roman hedef (T) genomik serisinden, DNA veya RNA, genomik bağlam veya başvuru (R) (resim 1) belirlemektir. Hedef fiziksel olarak ayrı tutulamaz veya bunu yapmak için pahalı olacağını, yöntem en yararlı olur. Yani bizim Yöntem önemli bir yenilik içine referans kusurlu olduğunda hedef sıraları ayırmak araştırmacılar etkinleştirme bir döngüsü, ya da bir taslak tezgah yöntemleri ve hesaplama birleşimi yalnızca birkaç organizmaların mükemmel genleri çıkarma için bitirdikten bir sigara modeli organizmadan genom. Bir döngü sonunda, qPCR sınama daha fazla çıkarma gerekip gerekmediğini belirlemek için kullanılır. Doğrulanmış aday T sıra istatistiksel olarak daha büyük algılama qPCR tarafından bilinen T-pozitif örnekleri gösterir.
Ana bilgisayar homologs1,2,3,4 var mı yeni bakteri uyuşturucu hedefler keşfi ve kimliği roman virüslerden virüslü bilgisayarlardan yöntemi enkarnasyonları uygulanmıştır 5,6. T kimlik ek olarak, yöntem yöntem zebra finch başvuru genom 936 eksik genler ve salt germline kromozom (T)7yeni bir gen tanımlamak için son kullanılan R: artırabilirsiniz. Eksiltici genomik T bilinen dizileri son derece farklı olma olasılığı veya olduğu gibi zebra finch germline tarafından kısıtlanmış kromozom7T kimliğini geniş tanımsızdır özellikle değerlidir.
Önceden T olumlu tanımlaması gerektirmeyen bir anahtar Eksiltici genomik tarafsız avantajdır. Bir son çalışmada, Readhead ve ark. Alzheimer hastalığı ve viral bolluk içinde dört beyin bölgeleri arasındaki ilişki incelenmiştir. İçin viral tanımlama, Readhead ve ark. 515 virüs8ağır sınırlama yaptıkları çalışmada teşhis edebilir viral ajanlar, bir veritabanı oluşturdu. Eksiltici genomik sağlıklı ve Alzheimer genleri karşılaştırmak için ne olursa olsun onların benzerlik bilinen bulaşıcı hastalığı ile ilişkili olası roman virüslerden yalıtmak için kullanılabilirdi. 263 bilinen virüsler insan hedefleme iken, bu yaklaşık 1.67 milyon keşfedilmemiş viral tür var, 631,000-827,000 insanlar9bulaştırmak için bir potansiyele sahip biri ile tahmin edilmektedir.
Roman virüslerden işlemleri olan bir alandır hangi Eksiltici genomik özellikle etkilidir, ancak bazı çalışmalarda sıkı bir yöntem gerekmeyebilir. Örneğin, tanımlayıcı roman virüslerden ayıklamak ve ters ters transkripsiyon ve BLASTx için viral dizileri5 ardından tarafsız yüksek üretilen iş sıralama veya viral nükleik asitleri zenginleştirici kullanmış çalışmalar viral dizileri uyarlamak 6. bu çalışmalar de novo sıralama ve derleme ediyor hedef sıraları olumlu aracılığıyla patlama tespit edilmiştir çünkü çıkarma kullanılmadı. Eğer belgili tanımlık virüs tamamen Roman ve ilişkili olmayan (veya uzaktan ilgili) diğer virüs, Eksiltici genomik yararlı bir yöntem olurdu. Eksiltici genomik yararı tamamen yeni dizileri elde edilebilir olmasıdır. Canlı genomunun büyüklüğü biliniyorsa, o dışarı herhangi bir viral dizileri bırakmak düşülen. Örneğin, bizim orijinal niyet7değildi ama bizim yayınlanan çalışmada biz zebra finch Eksiltici genomik, üzerinden viral bir roman serisinden izole.
Eksiltici genomik da yararlı bakteri aşısı hedefleri, antibiyotik direnci1,2,3,4dramatik artış tarafından motive tanımlaması içinde kanıtlamıştır. Otoimmün reaksiyon riski en aza indirmek için homologs içinde insan sahibi herhangi bir protein çıkararak araştırmacılar potansiyel aşı hedefleri daralmış. Uyuşturucu hedefleri proteinler yan etkileri için önde gelen ana bilgisayarlar arasında etkilemeyeceği emin olmak için birkaç bakteriyel genom üzerinden çıkarma omurgalı ana bilgisayar genleri Corynebacterium pseudotuberculosis, arıyorum bir belirli çalışmada gerçekleştirilen 1. bu çalışmaların temel iş akışı bakteriyel Proteom indir, hayati proteinler belirlemek, gereksiz proteinler kaldırmak için gerekli proteinler yalıtmak için BLASTp ve BLASTp ana bilgisayar Proteom karşı herhangi bir protein ile ev sahibi homologs kaldırmak için kullanın etmektir 1 , 2 , 3 , 4. Bu durumda, Eksiltici genomik geliştirilen aşı ana bilgisayar1,2,3,4' te herhangi bir hedef kapalı etkisi olmayacaktır emin olun.
Biz Eksiltici genomik ilk protein kodlayıcı gen germlines içinde bulunan bir germline tarafından kısıtlanmış kromozom üzerinde (GRC) (Bu durumda, T), tanımlamak için kullanılan ancak ikisinden de değil somatik doku10cinsiyette. Bu çalışmada önce GRC hakkında bilinen sadece genomik bilgi bir yinelenen bölge11oldu. De novo derleme yumurtalık ve teste dokulardan (R + T) Yetişkin zebra finches üzerinden sıralı RNA üzerinde gerçekleştirildi. Dizileri Hesaplamalı ortadan kaldırılması yayımlanmış somatik (kas) genom dizisi (R1)12kullanarak gerçekleştirilen, onun ham (Sanger) veri (R2) ve somatik (beyin) transcriptome (R3)13okuyun. Üç başvurular sıralı kullanımı ek filtreleme gerekli gösterilen adımında her döngüsü (Şekil 2A), 5 test qPCR tarafından tahrik edildi. Keşfedilen α-ek gen DNA ve RNA ve klonlama ve sıralamanın üzerinden qPCR üzerinden teyit edildi. Biz örneğimizde bu yöntem esnektir gösterir: Bu çıkarma-ebilmek var olmak kılınmak ile başvuruları (R) bu derlemeleri veya ham okuma oluşmaktadır ve nükleik asit (DNA vs RNA) eşleşen üzerinde bağımlı değildir.

<table><tbody><tr><td>Accustart II Taq DNA Polimeraz</td><td>Quanta Bio</td><td>95141</td><td></td></tr><tr><td>Blasic Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td></tr><tr><td>Papyon 2</td><td></td><td></td><td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td></tr> <tr><td>BWA-MEM v. 0.7.12</td><td></td><td></td><td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td></tr><tr><td>Geneious</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>PEAR v. 0.9.6</td><td></td><td></td><td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td></tr><tr><td>Kişisel Bilgisayar</td><td>Biomatters</td><td></td><td>http://www.geneious.com/</td></tr> <tr><td>PowerSYBR qPCR karışımı</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Python v. 2.7</td><td></td><td></td><td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td></tr> <tr><td>Sürüngen v.1.1</td><td></td><td></td><td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td></tr><tr><td>Stratagene Mx3005P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>TransDecoder v. 3.0.1</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td></tr> <tr><td>Trinity v. 2.4.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td></tr></tbody></table>

eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Eksiltici genomik hedefi gen, protein veya daha büyük bir genomik bağlamda katıştırılmış genel bölge sırasını tanımlamak için nerede herhangi bir araştırmada kullanılabilir. Eksiltici genomik faiz (T) bir hedef dizi kapsamlı sıralama ve bilinen genetik öğeleri (başvuru, R) çıkarılarak tarafından izole etmek bir araştırmacı sağlar. Yöntem mitokondri, kloroplast, virüs gibi roman serileri tanımlamak için kullanılan veya germline kromozomlar sınırlı ve T kapsamlı genomik veri ile (R + T), yöntem başlayan R. kolayca izole olamaz özellikle yararlıdır Temel yerel hizalama arama aracı (patlama) eşleşen bilinen dizileri (R), (T) hedef bırakarak kaldırmak için bir başvuru sırası veya dizileri, karşı kullanır. En iyi çalışacak şekilde çıkarma için R T. eksik nispeten tam bir taslak olmalıdır Çıkarma test sonra nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) aracılığıyla kalan dizileri beri R yöntemin işe yaraması için tamamlanmış olması gerekmez. Biz gerektiği gibi tekrarlanır bir döngü içine deneysel adımlarla Hesaplamalı adımları sırayla birden fazla başvuru dizileri kaldırma ve T. için arama rafine link burada Eksiltici genomik avantajı tamamen yeni hedef sıra fiziksel arıtma zor, imkansız ya da pahalı olduğu durumlarda bile belirlenebilir olması. Yöntemin bir dezavantajı uygun bir başvuru için çıkarma bulma ve T-pozitif alma ve negatif qPCR sınama örnekleri. Bizim zebra finch germline tarafından kısıtlanmış kromozom gelen ilk gen tanımlaması yönteminde uygulanması açıklanmaktadır. Bu durumda üç başvuruları (R), sırayla üç devir kaldırıldı Hesaplamalı filtreleme söz konusu: bir eksik genomik derleme, ham genomik veri ve transcriptomic veri.

PATLAMA çalıştırdıktan sonra çıktı dosyasını sorgudan veritabanıyla eşleşmesi sýra bir listesi olacak. Python çıkarma sonra nonmatching dizileri bir dizi elde edilen ve qPCR tarafından test edilmiştir. Bu sonuçlar ve sonraki adımlar, aşağıda ele alınmıştır.
Negatif sonuç. Patlamadan sonra başvuru sırasına görülebilir iki olası olumsuz sonuçları vardır. Toplam sıra herhangi bir benzer dizileri başvuru yok anlamı ...

Bu iletişim kuralının amacı bilinen yalnızca kısmen bir ortak arındırıcı serisinden kolayca ayrılamayan roman dizileri bulamadı bir arada hesaplamalı ve tezgah araştırma kullanmaktır.

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Protokolümüz önemlidir, çünkü ortak arındırıcı dizilerden izole edilemeyen genomik dizileri tanımlamak için kullanılabilir, ki bu da kısmen bilinebilir. Bu tekniğin ana avantajları ucuz olmasıdır, hem de esnek indirilebilir çoğunlukla ücretsiz yazılım kullanarak. Birçok biyolojik soruya uygulayabilirsiniz.Potansiyel uygulamalar bakteriyel aşı hedeflerinin belirlenmesi ve dizileri bilinen mikroplardan son derece farklı olan virüslerin belirlenmesini içerir. Bu yöntem, genomik hedef olmadan referans sırası mevcut olduğu sürece, bilinmeyenin deneysel olarak ayrılamayacağı herhangi bir sisteme uygulanabilir. Bu teknik bazı deneme yanılma alır, bu yüzden sabır önemlidir.Programları çekmekte sorun yaşamanız gerekebilir. Burada tanımladıklarından farklı programlar kullanabilirsiniz. Kullanım kılavuzlarını mümkün olduğunca kullanın.Hesaplamalı çalışma komut satırı programlamanın nasıl yapılandırıldığına ilişkin temel bir anlayışa bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. Başlamak için, illumina adaptörleri ve düşük kaliteli üsleri kaldırmak için Trimmomatic 0.32 kullanın. Varsayılan parametreleri kullanarak trimmomatic output eşleştirilmiş okumalardan yüksek kaliteli birleştirilmiş okumalar oluşturmak için Armut sürüm 0.9.11'i kullanın.Daha sonra Armut üzerinden üretilen okumaları düzeltmek için Sürüngen sürüm 1.1'i kullanın. Son olarak düzeltilmiş sıraları bir araya getirmek için varsayılan modda Trinity sürüm 2.4.0'ı kullanın. Strand belirli kitaplıklar için SS_lib_type parametresini kullanın.Çıktı, trinity_output adı verilen yeni bir dizine yerleştirilecek bir FASTA dosyasıdır. nucleotide_reference başvuru sırasının BLAST veritabanını yapın. komut satırında fasta.BLAST, biraraya getirilen sorguyu başvuru veritabanıyla eşleştirdi. Çıktı dosyası almak için BLAST_results kullanın. txt Python komut dosyaları ile alt sıra işleme adımları için gerekli tabular çıktı oluşturmak için, artan sıkılık için outfmt 6 kullanın, nükleotit veritabanının altı yönlü çevirisini gerçekleştiren çevrilmiş nükleotit BLAST ile BLAST sorgusu olarak montajdan protein dizilerini kullanın.Sorgu için protein dizileri elde etmek için TransDecoder'ı çalıştırın. Uzun0rfs komutu biraraya sorgu dizileri en uzun açık okuma kareleri tanımlamak için. Şimdi tblastn çalıştırın.Gerekirse, uygun kod seçeneği ile db_gencode kullanılarak incelenen organizma için doğru genetik kodun seçildiğinden emin olun. Yüksek kaliteli bir protein referansı varsa, tblastn yerine blastp ile eşleşen protein-protein kullanın Protein referansına ait blast veritabanını yapın. Sonucu akış aşağı işleme için bir dosya olarak kaydettiğinden emin olun ve Python komut dosyalarının bunları doğru şekilde ayrıştıradığından emin olmak için tabular çıktıkullanın.Şimdi, eşleşen dizileri kaldırmak için çıkarma Python komut dosyasını kullanın. Okumaları derlemeye eşlemek için, indirilen ham okumaların sorgu derlemesine eşlemi için BWA-MEM Sürüm 0.7.12 veya bowtie 2'yi kullanın. Önce derlemeyi dizine dizin, sonra okumaların haritasını göster.Çıktı SAM biçimi olacaktır. Python komut dosyası removeUnmapped çalıştırın. giriş olarak SAM dosyasını kullanarak py.Bu, eşleşen okumalar yapmadan sorgu dizilerinin adlarını tanımlar ve bunları yeni bir metin dosyasına kaydeder. Önceki adımın çıktısı, txt dosyasındaki dizi adlarının listesidir. Bu dizileri içeren bir FASTA dosyası ayıklayın.Çıktı bir fasta dosyası olacak. En iyi astar dizilerini el ile belirlemek için Genius'ı kullanın. Herhangi bir tabandan dört veya daha fazla sayıda çalıştırmayı önleyerek, ileri astar için 21 ila 28 baz çifti arasında bir aday sırasını vurgulayın.Tüm baz çiftleri oldukça düzgün bir kombinasyonu ile bir bölge hedef deneyin. Üç Prime End'de tek bir G veya C yararlıdır, astar çapa yardımcı olur. Adayın bölge olarak tahmin edilen erime sıcaklığının altını görmek için ekranın sağ tarafındaki İstatistikler sekmesine tıklayın.55 ve 60 santigrat derece arasında bir erime sıcaklığı hedefleyin, tekrarları kaçınarak, ve G C.Uzun çalışır aynı şekilde bir ters astar seçin, 150-250 baz çiftleri üç ileri astar üç astar yer. Astar uzunluklarının eşleşmesine gerek olmasa da, öngörülen erime sıcaklığı ileri astarınkine mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bir menü seçeneğinde bir sıra vurgulanırken Genius'da sağ tıklayarak sırayı tersine çevirdiğinden emin olun.Alternatif bir yöntem, Sıra penceresindeki üst araç çubuğunda bulunan Primer Design işlevini kullanmaktır. Hedef Bölge altında yükseltmek için bölgeyi yerleştirin. Özellikler sekmesinin altında, istenilen boyutu, erime sıcaklığını ve yüzde G C'yi ekleyin ve astarların oluşturulması için Tamam'ı tıklatın.Kalan dizinin nicel PCR doğrulaması gerçekleştirmek için, öncelikle sybr Green Master Mix, ileri ve ters astarlar ve su ile toplam 25 mikrolitre hacim için, triplicate her şablon için bir reaksiyon karışımı hazırlamak. Daha önce doğrulanmış sıcaklık ve uzatma süresi tarafından bilgilendirilmiş bir qPCR programı çalıştırın. Son denaturing eğrileri en azından ilk kez astarlar tek bir DNA ürünampampampifikasyon doğrulamak için qPCR istihdam oluşturulmalıdır.Tüm durumlar için Ct ile Actin'e göre qPCR SYBR Yeşil sinyallerini ölçün, Actin'e göre ct'ye göre iki sinin ortalamasını ve standart sapmasını hesaplayın. QPCR tarafından doğru ürün boyutu tespiti onaylamak için, uç nokta jel elektroforez gerçekleştirin. Burada, 20 dakika boyunca 200 voltta 2% TAE Agarose jel üzerinde 6X Glitterol boya beş mikrolitre ile karışık qPCR ürün 25 mikrolitre çalıştırın.QPCR'ınız hedef dizileri tanımlamadığınızı gösterirse, tüm döngüyü çevrimiçi bir veritabanından elde edilebilecek yeni bir başvuruyla yineleyin. Bu durumda subtraktif proje erkek ve kadın yetişkin zebra ispinoz mikrop kaplı doku Dan RNA dizilime ile başladı. Sonuç olarak, daha önce tüm genom ek açıklamalarında yer almayan 935 somatik gen tespit edildi.Hesaplamalı filtrelemeden sonra, kantitatif PCR kuş dokuları arasında algılamada bir fark olmadığı olumsuz bir sonuç verebilir. Tersine, genomik DNA qPCR referansgöre, ilgi dokusunda istatistiksel olarak daha fazla algılama gösterdiğinde, Gerçek Hedef Dizisi nin tanımlanmasını temsil eden olumlu bir sonuç doğrulanır. Burada, alfa snap geninin mikrop ile sınırlı olduğu doğrulandı çünkü somatik dokuda testees DNA'sına göre tükenmişti.Hesaplama adımlarının her birinde doğru girişleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Hedef sırasını veya dizilerini elde etmek için döngü çıkarma dan birden çok kez geçmeniz gerekebilir. Keşfedilen genler üzerinde çeşitli filogenetik, yapısal ve fonksiyonel analizler yapılabilir.Bu ek yöntemler genlerin evrimsel ve işlevsel rolleri hakkında fikir verir. Mikrop ile sınırlı bir ötücü kuş kromozomundaki ilk geni belirledik, bu da bu şaşırtıcı genomik elemente olan ilgiyi genişletti. Sonraki çalışmalarda birçok ötücü kuş türünde benzer kromozomlar birçok ek genler içeren gösterdi.

novel-sequence-discovery-by-subtractive-genomics

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER'da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

Mikrobiyal topluluğu karakterize etmek, çevresel mikrobiyolojide uzun süredir devam eden bir hedef olmuştur. Yeni nesil dizileme yöntemleri artık mikrobiyal toplulukların minimum maliyet ve iş gücü ile benzeri görülmemiş bir derinlikte karakterizasyonuna izin veriyor. Burada, bir tezgah üstü dizileyici kullanarak bakteriyel 16S ribozomal RNA genlerini dizileme yaklaşımımızı detaylandırıyoruz.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Burada bir kütle spektrometresi güdümlü genom madenciliği protokolü oluşturulmuş ve tanımlanmıştır. Genom dizilimi bilgileri ve LC-MS/MS analizine dayanan bu analiz, kompleks mikrobiyal ve bitki özlerinden moleküllerin belirlenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Yeni Doğal Ürünleri Ortaya Çıkarmak İçin Bir Araç Olarak Kütle Spektrometresi Güdümlü Genom Madenciliği

Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması

Bu yazıda, transkripsiyonu ve bakteriyel transkripsiyonu hedefleyen antibakteriyel ajanların inhibitör aktivitesini işlevsel olarak incelemek için bir protokol açıklıyoruz.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

Keşfedin, eş-pürifiye edici dizilerden ayrıştırılamayan yeni genomik dizileri tanımlama yöntemini. Ücretsiz yazılım kullanan bu hesaplamalı protokol, bakteri aşı hedefleri ve bilinmeyen viral dizileri belirlemede esneklik sağlar.

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Daha fazla video keşfet