Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography
12 Mart 2019
Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.
Otoradyografi, spesifik radyoligand kullanarak dokularda protein bağlayıcı bölgelerin dağılımını inceleyen güçlü ve basit bir tekniktir. Ayrıca immünohistokimyaya da uygun bir alternatif. Bu teknik, geleneksel film pozlama daha hızlı dijital görüntüler ile mekansal çözünürlük ile protein ifade görselleştirir.
Ayrıca protein hedeflerinin farmakolojik analizi için de kullanılabilir. Bu yöntem, cam üzerine monte edilmiş fare dokularını içerir, ancak diğer türlere, hatta kapaklarda yetişen hücrelere de uzatılabilir. Prosedürü göstermek Nane Griem-Krey, benim laboratuvarda bir doktora öğrencisi tarafından olacaktır.
Başlamak için, onu dondurmak için toz kuru buz doku batırın. Donmuş dokuyu doğrudan eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostata aktarın. Doku eksi 20 santigrat derece ye 20 dakika kriyostat alışmak sağlar.
Daha sonra doku tutucuyu kriyostat dışında katıştırma ortamı ile kapatın ve gömme ortamı hala sıvıyken dondurulmuş doku örneğini hızlı bir şekilde istenilen yönde yerleştirin. Doku tutucuyu kriyostat'a geri aktarın ve katıştırma ortamını sertleşme için eksi 10 santigrat derecenin altındaki sıcaklıklara maruz bırakın. Doku tutucuyu kriyostat mikrotomuna yerleştirin.
Eğimli kesitlerden kaçınmak için dokunun yönünü ayarlayın. İstenilen kalınlıkta bölümlerde stereotaksik bir atlas ın rehberliğinde dokuyu kesin ve gerekirse küçük bir fırça ile kesiti açın. Çözülme bölümü mikroskop slayt üzerine monte edin.
Daha sonra istenilen teknik tekrar için ilgi bölgesinden bölümleri sırayla toplayın. Slaytlar üzerindeki bölümlerin daha fazla işleme konmadan önce bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Sertifikalı bir radyoaktivite laboratuvarında, slaytları deneysel koşullarla etiketlemek için bir kalem kullanın.
Slaytları yatay olarak plastik tepsilere yerleştirin. Slaytlara monte edilen bölümlere, söz konusu hedefe ayarlanmış uygun bir SA arabelleği hacmini dikkatlice uygulayın. Her bölümün tamamen kapalı olduğundan emin olun.
Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketlenmemiş bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek SA tampon. Daha sonra buharlaşmayı önlemek için tepsileri kapaklarla kapatın. 20 rpm olarak ayarlanmış bir plaka shaker üzerinde 30 dakika boyunca ilgili bir sıcaklıkta pre-incubate.
Daha sonra, her slayttan kuluçka öncesi sıvıyı dökün ve slaytları plastik tepsiye geri aktarın. Hemen sa tampon radyoligand ilgili konsantrasyon ile tamamen bölümleri kaplayın. Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketli olmayan bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek radyoligand çözeltisi.
20 rpm sürekli nazik sallayarak istenilen koşullar altında kapaklar ve kuluçka ile tepsiler kapağı. Bundan sonra, kuluçka çözeltisini dökün ve slaytları bir mikroskop slayt rafına aktarın. Hemen slaytları yıkayın.
GHB protokolü için, 20 saniye boyunca buz gibi SA tamponuyla iki kez yıkayın ve slayt rafını buz gibi distile su yla dolu tepsilere daldırarak iki kez durulayın. Slaytları raflarda dikey olarak yerleştirin ve en az bir saat kuru havalayın. Daha sonra slaytları oda sıcaklığında gece fiksasyonu için paraformaldehit içeren bir fiksatöre aktarın.
Ertesi gün, oda sıcaklığında silika jel içeren bir kurutucu kutusuna slaytlar aktarın. Nemi ortadan kaldırmak için slaytları kurutucu kutuda üç saat bekletin. İlk olarak, doku yukarı bakacak şekilde radyasyon korumalı görüntüleme plaka kasetiçine bölümleri yerleştirin.
Radyoligve bağlama sonraki nicelik için her kasetbir radyoaktif mikroölçek ekleyin. Kullanımdan hemen önce trityuma duyarlı fosfor görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesine yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre görünür kızılötesi ışığa maruz bırakın. Daha sonra görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesinden çıkarın ve hemen kasetteki bölümlere yerleştirin.
Kasetin tamamen kapalı olduğundan emin olun. Işıktan korunurken oda sıcaklığında optimize edilmiş pozlama süresi için bölümleri fosfor görüntüleme plakasına maruz bırakın. Pozlamadan sonra, karanlıkta kaseti dikkatlice açın ve görüntüleme plakasını hemen fosfor görüntüleyicisinin karanlık kutusuna aktarın.
Dijital görüntü elde etmek için plakayı mümkün olan en yüksek çözünürlükte taz.yama. Başlamak için uygun bir görüntü analizi programı açın. Menü öğesi bölge belirlemesini seçerek her kalibrasyon standardı için göreli optik yoğunlukları belirleyin.
Bölge oluşturma aracını seçin ve radyoaktif mikro ölçeğin her noktası için eşit boyutta bir alan seçmek için kullanın. Menü öğesi etiketinin altındaki numaraya tıklayarak seçili her alana bir sayı atayın. Kalibrasyon standardının her noktası için OD değerlerini dışa aktarmak için Dosya Dışa Aktarma ve ardından 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.
Tescilli görüntüleme yazılımında, her bölümdeki ilgi çekici bölgeyi seçmek ve otoradyogramların niceliğini gerçekleştirmeye başlamak için oD'lerini ölçmek için bir bölge oluşturma aracı kullanın. İlgi alanı için bir şablon oluşturarak her bölümde aynı bölgeyi seçin ve kopyalayın ve her otoradyogramdaki beyin anatomisindeki küçük varyasyonlara göre ayarlayın. Bundan sonra, rod değerlerini ve seçili alanların boyutlarını elektronik tabloya aktarmak için Dosya Dışa Aktar 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.
Metin protokolünde belirtildiği gibi radioligand'ın bağlayıcılığı belirleyin. Bu çalışmada, yüksek afinite GHB bağlama sitelerinin anatomik dağılımı, koronal, sagital ve yatay kesitler halinde kesilmiş bir fare beyninde radyoetiketli GHB analog radyoaktif HOCPCA ile görselleştirilmiştir. Hipokampus ve kortekste yüksek düzeyde bağlama görülürken striatumda daha düşük bağlama düzeyleri görülür ve beyincikte bağlayıcılık saptanmaz.
Burada gösterildiği gibi, anatomik yapılar farklı düzlemler kullanılarak görselleştirilebilir ve anatomik bütünlük cresyl menekşe boyama ile desteklenebilir. Bir sıçan, fare ve bir domuzun temsili otoradyogramları memeli beynindeki yüksek yakınlıklı GHB ciltleme alanlarının evrimsel korumasını göstermektedir. Radyoaktif HOCPCA bağlama siteleri aralarında brüt beyin anatomisi karşılaştırma sağlayan her üç tür tespit edilir.
Yüksek afinite GHB bağlama siteleri, bağlayıcı sitelere farklı yakınlıklar gösteren ancak benzer özel faaliyetler gösteren GHB radyoligandlarla incelenir. Radyoaktif HOCPCA yüksek hassasiyet ve gürültü oranına mükemmel sinyal ile donatılmıştır. Radyoaktif NCS-382'nin daha düşük hassasiyeti nedeniyle benzer düzeyde bağlama elde etmek için daha yüksek radyoligve konsantrasyonlar kullanılmalıdır.
Daha yüksek radyoligand konsantrasyonları radyoaktif GHB karşılaştırılabilir bağlama düzeyleri elde etmek için gereklidir. Ancak, daha yüksek radyoligand konsantrasyonları da gürültü oranı daha düşük bir sinyal ile spesifik olmayan bağlama düzeyini artırmak. Gürültü oranlarına en iyi sinyali almak için radyoligand konsantrasyonu, yıkama ve maruz kalma süresi gibi ar-ge koşullarını optimize etmek önemlidir ve daha önce plakayı silmeyi hatırlamak da çok önemlidir.
Prosedür keşif projeleri için yararlı olabilir canlı bir hayvan bileşik bağlama hakkında bir fikir almak için in vivo koşullara uzatılabilir. Sertifikalı tam radyoaktif malzeme ile bir laboratuvarda çalışmayı unutmayın ve radyoaktivite veya paraformaldehit kullanırken koruyucu giysiler giymek.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, doku kesitlerinde radyoligat bağlanmasını ölçmede etkili bir teknik olarak otoridyografiyi gösterir. Fare dokuları kullanarak, yöntem yüksek mekansal çözünürlük ile bağlanma yerlerini görselleştirir ve geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre daha hızlı bir alternatif sunar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Farmakoloji
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Otoridyografi, protein bağlanma yeri dağılımının incelenmesine olanak tanır.
- İmmünohistokimya için uygun bir alternatif olarak hizmet eder.
- Bu yöntem, geleneksel yöntemlere göre daha hızlı dijital görselleştirmeler sağlar.
- Teknik farmakolojik analiz için de kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Doku örneklerinde otoridyografi prosedürünü göstermek.
- Protein ekspresyonunu görselleştirmede mekansal çözünürlüğü göstermek.
- Çeşitli beyin bölgelerinde bağlanma yeri farklılıklarını vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Aniden dondurulmuş ve kesitlenmiş fare dokuları kullanıldı.
- Otoridyografi yöntemi, doku kesitlerini radyoligatlarla etiketlemeyi ve kuluçkaya bırakmayı içerir.
- Önemli adımlar arasında doku hazırlığı, kuluçka, yıkama ve görüntüleme bulunur.
- Bağlanmayı ölçmek için fosfor görüntüleme plakaları ile dijital görüntüleme yapıldı.
Ana Sonuçlar
- Yüksek afiniteli GHB bağlanma yerlerinin belirgin anatomik dağılımı gözlendi.
- Hipokampüste ve kortekste yüksek bağlanma seviyeleri belirlendi.
- Striatumda daha düşük bağlanma seviyeleri not edildi, serebellumda ise bağlanma tespit edilmedi.
- Çalışma, farklı düzlemlerde anatomik yapıların önemli görselleştirmelerini sağladı.
Sonuçlar
- Çalışma, dokularda protein bağlanmasını görselleştirmek için otoridyografinin güçlü bir araç olduğunu vurgular.
- Beyin bölgelerinde bağlanma yeri dağılımlarının anlaşılmasını artırır.
- Bu yöntem farmakolojik değerlendirmeleri ve nörolojik mekanizmaların anlaşılmasını bilgilendirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Autoradiography enables precise visualization and quantification of pharmacological target distribution in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides spatially resolved binding data that informs ligand selectivity and affinity measurements, directly impacting lead identification and portfolio triage decisions. Its compatibility with multiple species and tissue types enhances translational continuity from discovery through preclinical assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Visualizes anatomical distribution of high-affinity binding sites to interrogate therapeutic hypotheses and clarify target engagement.
- Operational Value: Enables pharmacological characterization of ligand affinity through Kd, Ki, and Bmax measurements in selected tissues.
- Strategic Value: Supports predictive confidence by quantifying target density and selectivity across brain regions for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative autoradiograms with high spatial resolution for reliable compound evaluation in validated biological systems.
- Operational Value: Standardizes binding assay parameters including radioligand concentration, washing, and exposure time to optimize signal-to-noise ratios.
- Strategic Value: Facilitates assay reproducibility and scalability across species (mouse, rat, pig) demonstrating evolutionary conservation of targets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates evolutionary conservation of high-affinity GHB binding sites across mammalian species, supporting cross-species target validation.
- Operational Value: Enables comparison of gross brain anatomy between species using consistent radioligand binding patterns.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing binding site distribution data relevant to neurological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative binding data that supports mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing target distribution in distinct anatomical structures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and imaging protocols that yield reproducible quantitative outputs.
- Analytics: Enables measurement of relative optical densities and region-of-interest quantification for comparing binding levels across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by demonstrating target conservation across species and anatomical planes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for pharmacological target characterization applicable to diverse discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target localization and ligand selectivity characterization reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding assays across tissue types and species.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative binding site density and distribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radioligand handling, tissue sectioning, and radioactive material safety protocols.
- Dependent on specialized instrumentation including cryostat, phosphor imaging plates, and image analysis software for quantification.
- Necessitates cross-team standardization of binding assay parameters such as incubation temperature, washing steps, and exposure times.
- Involves adaptation considerations across model systems including tissue mounting, section thickness, and blocking agents for non-specific binding.
- Includes practical limitations such as the need for certified radioactivity laboratories, signal-to-noise optimization, and careful selection of radioligand concentration to minimize non-specific binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Tissue Preparation by Cryosectioning
2:13
In vitro Autoradiography
4:44
Exposure to Phosphor Imaging Plates and Scanning
6:04
Densitometric Analysis of Digital Image
7:34
Results: Visualization and Characterization of Pharmacological Targets Using Radiography
9:34
Conclusion
![Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [11C] SNAP-7941](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59557.jpg%3Fv%3D2026-07-04T06%253A55%253A47.000Z&w=384&q=75)
