Name: Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, fare dokularında otoradyografi ile protein bağlanma bölgelerini yüksek uzamsal çözünürlükle görselleştirme yöntemini. Bu teknik, farmakolojik analiz ve bağlanma dağılımını hızlıca belirlemek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İş Lundbeck Vakfı (Grant R133-A12270) ve Novo Nordisk Vakfı (Grant NNF0C0028664) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Aleš Marek [3H] radioligand temini için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan işleme Danimarka hayvan deney Müfettişliği yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.
Not: Burada açıklanan protokol doku hazırlık (Yani, fare beyin dokusu), vitro autoradiographic tahlil kurma yöntemi yeni bir laboratuvarda, tabak Imaging fosfor maruz için yeterli ayrıntılı kapsar yanı sıra autoradiograms (Şekil 2) sonraki densitometric analizi Yerelleştirme ve farklı anatomik yapıları bağlamasında radioligand miktarının amacı ile. Histolojik karşılaştırma için Kresil Menekşe boyama için bir protokol dahil edilir. Ayrıca, non-spesifik bağlama rakip bir ligand ile belirlenmesi protokolde yer alır. Kd, Bmax veya Kbenbelirleme hakkında ayrıntılı bir açıklama için bkz: önceki yayın4.
1. doku hazırlık Cryosectioning tarafından
<ol><li>Fare tarafından servikal çıkığı ötenazi ve hemen makas ve forseps kullanarak beyin incelemek. Doğrudan doku hasarı önlemek için bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Ek-doku batma tarafından toz kuru buz, gaz halinde olan yakıtlar CO2 veya isopentane donma. Doğrudan transfer donmuş doku bir cryostat ile sıcaklığı-20 ° c için ayarla Alternatif olarak,-80 ° C'de doku işleme kadar saklayın. Not: tekrarlanan çözdürme/doku hasarı azaltmak için dondurma kaçının.</li>
	<li>Doku doku yıkıcı önlemek için daha fazla alay önce 20 min cryostat-20 ° C'de alışmana izin.</li>
	<li>Cryostat dışında gömme orta ile doku tutucu kapak ve gömme orta hala sıvı ise hızlı bir şekilde istenen yönde donmuş doku örneği yerleştirin. Örneğin, dikey olarak beyincik üzerine fare beyin rostral koronal bölümler elde etmek için koyun. Geri cryostat için doku tutucu aktarmak ve sıcaklığa aşağıdaki gömme orta-10 ° C sertleştirme için maruz. Not: Kırılgan doku örneği orta montaj önce doku kalıpları içinde katıştırma kaplı olması.</li>
	<li>Doku tutucu cryostat microtome içinde konumlandırın. Eğimli bölümlerde önlemek için doku yönünü ayarlayın.</li>
	<li>İstediğiniz kalınlıkta bölümlerini stereotaksik atlas18 rehberliğinde doku kesmek (12 µm [3için H] tavsiye ligandlar etiketli). Dikkatli bir şekilde düzeltmek ve küçük boyutlu bir fırçayla bölümünü gerekirse açılmak ve tezcan-bölüm bir mikroskop slayt üzerine monte. Ardışık olarak istenen teknik çoğaltma (örneğin, slayt başına 4 bölüm) için ilgi bölgesinden bölümleri toplamak.</li>
	<li>1 h için daha fazla tutmadan önce kurumasını slaytlardaki bölümler de olanak sağlar. Not: Ek slayt kutularına nem alıcı malzemenin doku bölümlerinde nem inşa en aza indirir. Alınırken burada-80 ° C'de slayt kutularındaki bölümleri uzun vadeli depolayarak duraklatılmış</li>
</ol>2. vitro Autoradiography
Dikkat: radyoaktivite. Yerel düzenlemelere göre sertifikalı bir laboratuarda çalışmak. Koruyucu giysi giyin. Radyoaktif bozunma uygun olarak imha etme veya sertifikalı bir şirkete dış kaynak.
<ol><li>Bölümler için en az 30 dk (RT) oda sıcaklığında erimek. Slaytlar deneysel koşullar ile etiketleyin. Slaytları etanol sonraki boyama sırasında banyo çünkü bir kalem kullanın.</li>
	<li>Slaytları yatay olarak plastik tepsilerde yerleştirin. Not: slaytlar plastik tepsi içinde yükseltilmiş platformda konumlandırma kullandıklarında daha kolaylaştırır.</li>
	<li>(GHB protokolü, 50 mM KHPO4 tampon pH 6.0 kullanılan için) önceden incubate tahlil arabellek slaytları monte bölümleri hedef söz konusu dikkatle slayt (3-4 kemirgen koronal bölümleri için 700 µL) uygun bir birimi uygulayarak ayarlanabilir. Not: her bölüm tamamen sıvı ile kaplıdır emin olun.<ol>
<li>Plastik tepsi buharlaşma önlemek ve sürekli hafif (20 devir/dakika) bir tabak shaker sallayarak altında (GHB protokolü için RT, 30 dk önceden incubate için) ilgili sıcaklığında önceden kuluçkaya için bir kapak ile kapak.</li>
		<li>Non-spesifik bağlama belirlenmesi için tahlil arabellek etiketsiz bileşik (için GHB protokolü, 1 mM GHB) ilgili konsantrasyonu ile ek. Not: Ön kuluçka gerekli olmayabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her slayt sıvıdan ön kuluçka kapalı dökün ve slaytları plastik tepsiyi aktarın.</li>
	<li>Kurutma önlemek için hemen radioligand tahlil arabelleği istenen koşullar altında ilgili konsantrasyonu bölümlerle kuluçkaya (GHB protokolü, 1 nM [3H] HOCPCA RT, 1 h için) radioligand tamamen bölümlerle kapsayan tarafından çözüm (3-4 kemirgen koronal bölümleri için 700 µL).<ol>
<li>Altında kapalı Kapaklı plastik tepsilerinin sürekli hafif (20 devir/dakika) sallayarak altında kuluçkaya. Not: Bir aliquot bir sıvı mercek Counter sayarak radioligand konsantrasyon doğrulanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ve slaytlar mikroskop slayt raf transfer kuluçka çözüm sıvı dökerek çıkarın. Hemen bölüm kurutma önlemek için sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Slaytları yıkayın. GHB iletişim kuralı için buz gibi tahlil arabellek 20 s ve sonra durulama için iki kez iki kez slayt raf tuzları kaldırmak için buz gibi soğuk distile su kanalları içine daldırma tarafından yıkayın. Slaytları dikey olarak en az 1 h RT için air-drying için raflar yerleştirin veya kuru bir üfleyici ile 5 min için slaytlar için soğuk sıcaklık ayarlayın. Not: Çamaşır optimize edilmiş olması gerekir, örneğin, geniş çamaşır non-spesifik bağlama azaltmak için yararlı olabilir.</li>
	<li>Slaytları ligand-hedef karmaşık bütünlüğünü korumak için paraformaldehyde (PFA) toz ile İngiltere'de yılın buharları RT adlı gecede fiksasyon için içeren bir fiksatör aktarın. Dikkat: PFA zehirlidir. Positionthe fiksatör hood duman ve İngiltere'de yılın cilt/göz temasından kaçının.</li>
	<li>Ertesi gün, slaytları RT nem ortadan kaldırmak için 3 h için silika jel içeren bir desiccator kutusu aktarın.</li>
</ol>3. fosfor görüntüleme plakaları ve tarama maruz
<ol><li>Bölümleri görüntüleme plaka radyasyon korumalı kaset içinde bir doku yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. İçin sonraki miktar radioligand bağlama [3H] microscale her kasete içerir. Rasgele bölümleri düzenlemek ve doğrudan karşılaştırma aynı kaset için bölümleri bulaşmasına neden.</li>
	<li>Birikmiş sinyalleri deposundan kaldırmak için plaka kullanımdan hemen önce Imaging trityum duyarlı fosfor silmek ve arka plan ortadan kaldırmak için sinyal gönderir. Bu nedenle, plaka fosfor görüntüleme makineye yüklemek ve görünür/kızılötesi üreticinin yönergelerine göre ışık için maruz kalmaktadır.</li>
	<li>Fosfor görüntüleme plaka çıkarın ve hemen kaset bölümlerde üzerine yerleştirin. Kaset tamamen kapalı olduğundan emin olun. Fosfor görüntüleme plaka bölümlerine gelen ışık korumalı RT 3 gün için ortaya çıkarmak.</li>
	<li>Işık sinyal görüntüleme plaka siler çünkü dikkatle kaset karanlıkta açın ve hemen görüntüleme plaka fosfor Imager koyu kutu aktarmak veya fosfor Imager karanlık bir odaya yerleştirin. Not: dijital görüntü üzerinde bireysel numune analiz sonra tanımlamak için mekansal düzenleme slaytları pozlama sırasında notate emin olun. Bu nedenle, fosfor görüntüleme tabaklar da bir köşe amacıyla dijital resim tabağa doğru yönünü belirlemek için farklı bir açı kesmek görüntüleyin.</li>
	<li>Plaka dijital bir görüntü elde etmek olası en yüksek çözünürlükte tarama.</li>
</ol>4. isteğe bağlı: Kresil doku bölümlerini Menekşe boyama
<ol><li>Kresil Menekşe asetat 500 mL deiyonize su (dH2O) içinde 5 g karıştırılarak % 1 Kresil Menekşe çözüm hazırlamak (yaklaşık 2 h) eriyene kadar. Bir huni yeni bir 500 mL şişe kullanarak bir filtre kağıdı ile filtre. PH 3.5-3,8 için ayarlayın.</li>
	<li>Duman başlık altında slayt boyama konumunu belirleyin. Tepsiler beyaz Polipropilen tepsiler (Ksilen dışında) aşağıdaki çözümleri ile hazırlayın: a. P ethanol/50% dH2O b. p ethanol/30% dH2O c. 0 etanol ö. 0 etanol e. 0 dH2O f. %1 Kresil Menekşe g. %0,07 Asetik asit (dH2O için 250 mL asetik asitin 175 µL ekleyin). h. 0 Ksilen yeşil solvent dayanıklı kasetlerine Ben 0 Ksilen yeşil solvent dayanıklı kasetlerine</li>
	<li>Duman başlık slaytları aktarmak ve bir slayt rafa koyun.</li>
	<li>Lipidler dH2O etanol artan kademeli dizi 1 dk slaytlarını daldırma tarafından % 100 etanol (tepsi a-d) geçiyoruz.</li>
	<li>Numuneler için 1 dk slaytlarını daldırma tarafından etanol (tepsi a-d tepsi e tarafından takip ters sırada) konsantrasyonları azalan aracılığıyla dH2O suyla temasa.</li>
	<li>Numunelerin Kresil Menekşe çözüm için 10 dk içinde bırakın.</li>
	<li>Örnek slaytlar dH2O için 1 dk içinde daldırma tarafından yukarı ve aşağı slayt 4-8 s. yıkama için hafifçe kaldırarak % 0.07 Asetik asit durulayın.</li>
	<li>30 slaytlarını daldırma tarafından numuneler kurutmak etanol (tepsi a-d) konsantrasyonları artan s.</li>
	<li>Numunelerin % 100 Ksilen (tepsi h ve ben) etanol gidermek için sahip iki kanalları aracılığıyla aktarın.</li>
	<li>Numuneler için 1 dk slaytlarını daldırma tarafından etanol (tepsi a-d tepsi e tarafından takip ters sırada) konsantrasyonları azalan aracılığıyla dH2O suyla temasa.</li>
	<li>Slaytları Forseps ile serum kaldırın. Organik çözücü slayt başına ortam takma birkaç damla ekleyin ve bir 24 x 60 mm coverslip numuneler korumak için üstüne ekleyin. Hava kabarcıkları numune ve coverslip arasında yavaşça coverslip basarak kaldırın. Not: kalan slaytlar kurutma önlemek için montaj sırasında Ksilen içinde tutun.</li>
	<li>Slaytları bir duman başlıklı RT., Kuru gecede</li>
	<li>Örnek bir resmini elde etmek mikroskop ve 1,25 X amacı ile.</li>
</ol>5. densitometric dijital görüntü analizi
<ol><li>Her kalibrasyon standart [3H] microscale bir görüntü analiz yazılımı ile gelen göreli optik yoğunlukları (çubuklar) ölçmek.<ol>
<li>Menü öğesi Bölge belirlenmesiiçin Bölge oluşturma aracıyla [3H] microscale her noktası için eşit büyüklükte bir alan seçin. Bir sayı sayı üzerine Etiketmenü öðesi altýnda tıklayarak seçili her alanına atamak.</li>
		<li>Tıklatarak her nokta kalibrasyon standart OD değerleri verme dosya | E Dışa Aktar | 2D bölge raporu. ÇUBUK değerleri bir e-tabloya aktarmak ve seçili alanın büyüklüğüne göre normalize. Daha fazla densitometric çözümleme için standart bir eğri elde etmek için doğrusal regresyon gerçekleştirmek. Not: Seçilen alanları eşleşen ROD değerleri ve örnekleri belirlemek için etiketli emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Özel bölge seçerek görüntüleme yazılımı kullanarak autoradiograms miktar gerçekleştirmek her bölümünde bir Bölge oluşturma aracını kullanarak ve onun ODs ölçme faiz (ROI). Aynı bölge için bölge ilgi hangi bol ve el ile beyin anatomisi her autoradiogram için küçük değişimler için ayarlanmış bir şablon oluşturarak her bölümünde seçin. ROI anatomisi ile bir beyin atlas18autoradiograms kıyasla tanımlayın. Birden çok tedavileri karşılaştırıldığında, kör ve önyargılı ROIs yelpazesi önlemek için randomize çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>ÇUBUK değerlerini ve boyutlarını Seçilen alanların tıklatarak bir elektronik tabloya verme dosya | E Dışa Aktar | 2D bölge raporu.</li>
	<li>Belirli alan başına yoğunluğu elde etmek için seçilen Roi onun alanına göre ölçülen ROD bölün.</li>
	<li>Arka plaka çubuk ölçmek ve ilgili ROD değerleri ve alan boyutu bir elektronik tabloya dışa aktarın. Her yatırım Getirisi her çubuk değerinden ortalama arka plan sinyal çıkarma.</li>
	<li>Ortalama teknik çoğaltır, Yani, Bölüm başlıkları aynı hayvan dokudan kullanarak çoğaltır.</li>
	<li>Çubuklar radioligand bağlama, i.ebirimlerine dönüştürmek için standart eğri kullanın., ncı/mg doku eşdeğerleri (TE). Not: standartları doku simüle malzemelerle üretilen çünkü terim TE kullanılır.</li>
	<li>Bağlama nmol/mg TE ncı/mg dönüşüm tarafından radioligand (Denklem 1) özel faaliyetin göre hızlı. <img alt="Ligand bağlama hesaplama formülü, nmol/mg TE'yi tanımlayan denklem, biyokimyasal çalışma ile ilgili." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation">(1)</li>
	<li>Belirli bağlama değerleri elde etmek için non-spesifik bağlama toplam bağlama çıkarma.</li>
	<li>Ortalama ortalama teknik kullanarak her biyolojik REPLICATE bağlama (Adım 5.6 elde edilen) her hayvan çoğaltır.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Autoradiographic bir tahlil kalitesini en sık radioligand duyarlılık tarafından belirlenir. Bilinen ligandlar kullanılabilirliğini veya özel etiketleme teknikler fizibilite ligandlar uygun belirli aktivite ile (Yani, radyoaktivite miktarı verim verilir seçili Radyoizotop önemli bir faktör olduğunu bir radioligand birimi mol) başına23ve sınırlı miktarda kimyasal bozulması. Çok sayıda bilinen ligandlar radioligands hangi çeşitli yararları infers trityum9,<...

Autoradiography radyoaktif bozunma görüntüleri sağlayan bir yöntemdir. Tekniği rutin bir protein radiolabelled bir bileşik ve hedefine arasında belirli bir farmakolojik etkileşim temel faiz vitro doku dağılımı incelemek için kullanılır. Bu hedef için ligand selectivity hakkında doğrudan bilgi sağlar. Vitro autoradiography de radioligands, bağlayıcı siteleri (Bmax), yoğunluğu ve ayrışma sabiti (Kd) gibi parametrelerin farmakolojik bağlama kantitatif tayin yanı sıra belirlemek için kullanılabilir rakip ligandlar1,2inhibisyon sabiti (Ki). Geleneksel homogenate radioligand bağlama için karşılaştırıldığında, autoradiography kayma anatomi görselleştirmek için güçlü olmak ve bölgesel ifade kalıpları3özlü ayrıntılarını veren avantajına sahiptir. Autoradiography yöntemi bu nedenle özellikle doğrulanmış bir antikor yokluğunda immunocytochemistry ilgili bir alternatiftir. Autoradiography kolayca uygun bir radioligand durumu ile gerekli farmakolojik özgüllüğü, doku bölümleri ve uygun bir görüntüleme hazırlanması için bir microtome cryostat erişim verilen bir standart Radyoizotop laboratuvar uygulanır radyoaktivite kendi doku bölümlerde dağıtım analiz yapabiliyor aygıt. Özellikle, bir önemli seçim radioligand için sınırlı bağlama hedef olmayan sitelere bir kriterdir. Bu diğer proteinler, membran veya plastik veya filtreler gibi maddeler olabilir ve toplu non-spesifik bağlama olarak anılacaktır. Genellikle, non-spesifik bağlama saturable olmayan ama belirli bir hedef kapalı protein içeriyorsa saturable olabilir. Doğru belirli bağlama doğrulama için en iyi yolu (knock-out) doku4hedef örneğin, genetik olarak eksik dokuların karşılaştırmak için tasarlanmış olduğunu.
Burada, metodoloji γ-hidroksibütrik asit (GHB) memeli beyinde yüksek afinite bağlama sitesine autoradiographic karakterizasyonu gösterilmektedir. GHB hem klinik olarak yararlı bir ilaç tedavisi Narkolepsi ve alkolizm5, aynı zamanda doğal bir kurucu memeli beyin ve bir eğlence olduğu gibi farmakolojik etkileşim GHB ve bağlama sitesi arasında alaka en önemli noktadır uyuşturucu6. Yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri ilk [3H] GHB bağlama sıçan beyin homogenate7kullanarak açıklanan. Yıllar içinde autoradiography çalışmaları [3H] ile daha fazla GHB ve analog [3H] NCS-382 siteler fare8,9,10, fare9 ön bölgelerinde bağlama yüksek yoğunluklu gösterdi ,11ve maymun/insan beyin12domuz. Ancak, bu bağlama sitelerin tam işlevsel alaka ve moleküler kimlik zor kalmıştır.
Daha fazla bağlayıcı siteleri niteleyen ve GHB fizyolojik rolü üzerinde çalışmalar kolaylaştırmak için niyeti ile birden çok radioligands farklı benzeşim ile donatılmış farklı izotoplar birleşmeyle geliştirilmiştir ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA ve [125ben] BnOPh-GHB)13,14,15,16(17' gözden) (şekil 1). Siteleri görüntüleme tekniği9,11fosfor kullanarak yüksek kaliteli görüntüleri üretimi için izin bağlama çok yüksek doku yoğunluğu ve seçmeli yüksek benzeşme radioligands birleşimi. Autoradiographic deney ve bir örnek ayrıntıları örneklemek için ayarlama içinde pratik noktaları bir taslağını ile birlikte, i) radyonüklid seçimi, ii) tahlil koşullar seçimi ve III) fosfor kullanımı tartışma bölümünde vurgulamak olacaktır Röntgen film karşı plakaları görüntüleme. Bu yazıda genel amacı autoradiography tekniğine doku dağıtım ve protein hedeflerin farmakolojik analizleri hakkında bilgilendirmek için teknik, metodolojik, bilimsel bilgileri sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Merck Millipore 107017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 Görüntüleme Plakası</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 cm - Trityum</td></tr><tr><td>Cresil menekşe asetata</td> duyarlı <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (mikroskopi için susuz montaj ortamı)</td><td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Bileşiği, 12 x 125 mL</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Doku-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slaytları</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>mikroskop slaytları</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Manuel Slayt Boyama Seti</td><td>Sakura Finetek Danimarka ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Glas Üzerinde Trityum Standardı</td><td>Amerikan Radyoaktif Etiketli Kimyasallar A.Ş.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Vitro autoradiography deneysel hayvan hem de insan dokudan ilgi bir proteinin anatomik dağılımını görselleştirmenizi amaçlamaktadır. Bu yöntem bir radioligand biyolojik hedefine için belirli bağlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, donmuş doku bölümleri radioligand çözüm ile inkübe ve bağlama hedef için daha sonra radyoaktif bozunma, algılama tarafından Örneğin, ışığa duyarlı film ya da fosfor plakaları Imaging kullanarak yerelleştirilmiştir. Elde edilen dijital autoradiograms miktar ve yerelleştirme radioligand bağlama farklı anatomik yapılar sağlar olağanüstü Uzaysal çözünürlük görüntüler. Ayrıca, miktar ligand afinite farmakolojik karakterizasyonu için ayrılma sabitleri (Kd), inhibisyon sabitleri (Kben) yanı sıra bağlayıcı siteleri (Bmax) seçili dokularda yoğunluğu aracılığıyla izin verir. Böylece, belgili tanımlık yöntem hedef Yerelleştirme ve ligand seçicilik hakkında bilgi sağlar. Burada, teknik autoradiographic karakterizasyonu siteleri bağlama tahlil ile ilgili metodolojik konuları üzerinde durularak memeli beyin dokusu içinde bağlama yüksek afinite γ-hidroksibütrik asit (GHB) örneği Parametreler, radioligand ve algılama yöntemi seçimi.

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri anatomik dağıtımını radiolabelled GHB analog [3H] ile görüntülenmiştir koronal, sagittal ve yatay bölüme (şekil 3 kesildi fare beynindeki HOCPCA ). Yüksek yüzey-in bağlama Hipokampus ve korteks gözlendi, alt striatum bağlamasında ve hiçbir bağlama beyincik içinde yüksek-benzeşme GHB siteleri9,10önceki bildir...

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Otoradyografi, spesifik radyoligand kullanarak dokularda protein bağlayıcı bölgelerin dağılımını inceleyen güçlü ve basit bir tekniktir. Ayrıca immünohistokimyaya da uygun bir alternatif. Bu teknik, geleneksel film pozlama daha hızlı dijital görüntüler ile mekansal çözünürlük ile protein ifade görselleştirir.Ayrıca protein hedeflerinin farmakolojik analizi için de kullanılabilir. Bu yöntem, cam üzerine monte edilmiş fare dokularını içerir, ancak diğer türlere, hatta kapaklarda yetişen hücrelere de uzatılabilir. Prosedürü göstermek Nane Griem-Krey, benim laboratuvarda bir doktora öğrencisi tarafından olacaktır.Başlamak için, onu dondurmak için toz kuru buz doku batırın. Donmuş dokuyu doğrudan eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostata aktarın. Doku eksi 20 santigrat derece ye 20 dakika kriyostat alışmak sağlar.Daha sonra doku tutucuyu kriyostat dışında katıştırma ortamı ile kapatın ve gömme ortamı hala sıvıyken dondurulmuş doku örneğini hızlı bir şekilde istenilen yönde yerleştirin. Doku tutucuyu kriyostat'a geri aktarın ve katıştırma ortamını sertleşme için eksi 10 santigrat derecenin altındaki sıcaklıklara maruz bırakın. Doku tutucuyu kriyostat mikrotomuna yerleştirin.Eğimli kesitlerden kaçınmak için dokunun yönünü ayarlayın. İstenilen kalınlıkta bölümlerde stereotaksik bir atlas ın rehberliğinde dokuyu kesin ve gerekirse küçük bir fırça ile kesiti açın. Çözülme bölümü mikroskop slayt üzerine monte edin.Daha sonra istenilen teknik tekrar için ilgi bölgesinden bölümleri sırayla toplayın. Slaytlar üzerindeki bölümlerin daha fazla işleme konmadan önce bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Sertifikalı bir radyoaktivite laboratuvarında, slaytları deneysel koşullarla etiketlemek için bir kalem kullanın.Slaytları yatay olarak plastik tepsilere yerleştirin. Slaytlara monte edilen bölümlere, söz konusu hedefe ayarlanmış uygun bir SA arabelleği hacmini dikkatlice uygulayın. Her bölümün tamamen kapalı olduğundan emin olun.Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketlenmemiş bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek SA tampon. Daha sonra buharlaşmayı önlemek için tepsileri kapaklarla kapatın. 20 rpm olarak ayarlanmış bir plaka shaker üzerinde 30 dakika boyunca ilgili bir sıcaklıkta pre-incubate.Daha sonra, her slayttan kuluçka öncesi sıvıyı dökün ve slaytları plastik tepsiye geri aktarın. Hemen sa tampon radyoligand ilgili konsantrasyon ile tamamen bölümleri kaplayın. Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketli olmayan bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek radyoligand çözeltisi.20 rpm sürekli nazik sallayarak istenilen koşullar altında kapaklar ve kuluçka ile tepsiler kapağı. Bundan sonra, kuluçka çözeltisini dökün ve slaytları bir mikroskop slayt rafına aktarın. Hemen slaytları yıkayın.GHB protokolü için, 20 saniye boyunca buz gibi SA tamponuyla iki kez yıkayın ve slayt rafını buz gibi distile su yla dolu tepsilere daldırarak iki kez durulayın. Slaytları raflarda dikey olarak yerleştirin ve en az bir saat kuru havalayın. Daha sonra slaytları oda sıcaklığında gece fiksasyonu için paraformaldehit içeren bir fiksatöre aktarın.Ertesi gün, oda sıcaklığında silika jel içeren bir kurutucu kutusuna slaytlar aktarın. Nemi ortadan kaldırmak için slaytları kurutucu kutuda üç saat bekletin. İlk olarak, doku yukarı bakacak şekilde radyasyon korumalı görüntüleme plaka kasetiçine bölümleri yerleştirin.Radyoligve bağlama sonraki nicelik için her kasetbir radyoaktif mikroölçek ekleyin. Kullanımdan hemen önce trityuma duyarlı fosfor görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesine yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre görünür kızılötesi ışığa maruz bırakın. Daha sonra görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesinden çıkarın ve hemen kasetteki bölümlere yerleştirin.Kasetin tamamen kapalı olduğundan emin olun. Işıktan korunurken oda sıcaklığında optimize edilmiş pozlama süresi için bölümleri fosfor görüntüleme plakasına maruz bırakın. Pozlamadan sonra, karanlıkta kaseti dikkatlice açın ve görüntüleme plakasını hemen fosfor görüntüleyicisinin karanlık kutusuna aktarın.Dijital görüntü elde etmek için plakayı mümkün olan en yüksek çözünürlükte taz.yama. Başlamak için uygun bir görüntü analizi programı açın. Menü öğesi bölge belirlemesini seçerek her kalibrasyon standardı için göreli optik yoğunlukları belirleyin.Bölge oluşturma aracını seçin ve radyoaktif mikro ölçeğin her noktası için eşit boyutta bir alan seçmek için kullanın. Menü öğesi etiketinin altındaki numaraya tıklayarak seçili her alana bir sayı atayın. Kalibrasyon standardının her noktası için OD değerlerini dışa aktarmak için Dosya Dışa Aktarma ve ardından 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.Tescilli görüntüleme yazılımında, her bölümdeki ilgi çekici bölgeyi seçmek ve otoradyogramların niceliğini gerçekleştirmeye başlamak için oD'lerini ölçmek için bir bölge oluşturma aracı kullanın. İlgi alanı için bir şablon oluşturarak her bölümde aynı bölgeyi seçin ve kopyalayın ve her otoradyogramdaki beyin anatomisindeki küçük varyasyonlara göre ayarlayın. Bundan sonra, rod değerlerini ve seçili alanların boyutlarını elektronik tabloya aktarmak için Dosya Dışa Aktar 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.Metin protokolünde belirtildiği gibi radioligand'ın bağlayıcılığı belirleyin. Bu çalışmada, yüksek afinite GHB bağlama sitelerinin anatomik dağılımı, koronal, sagital ve yatay kesitler halinde kesilmiş bir fare beyninde radyoetiketli GHB analog radyoaktif HOCPCA ile görselleştirilmiştir. Hipokampus ve kortekste yüksek düzeyde bağlama görülürken striatumda daha düşük bağlama düzeyleri görülür ve beyincikte bağlayıcılık saptanmaz.Burada gösterildiği gibi, anatomik yapılar farklı düzlemler kullanılarak görselleştirilebilir ve anatomik bütünlük cresyl menekşe boyama ile desteklenebilir. Bir sıçan, fare ve bir domuzun temsili otoradyogramları memeli beynindeki yüksek yakınlıklı GHB ciltleme alanlarının evrimsel korumasını göstermektedir. Radyoaktif HOCPCA bağlama siteleri aralarında brüt beyin anatomisi karşılaştırma sağlayan her üç tür tespit edilir.Yüksek afinite GHB bağlama siteleri, bağlayıcı sitelere farklı yakınlıklar gösteren ancak benzer özel faaliyetler gösteren GHB radyoligandlarla incelenir. Radyoaktif HOCPCA yüksek hassasiyet ve gürültü oranına mükemmel sinyal ile donatılmıştır. Radyoaktif NCS-382'nin daha düşük hassasiyeti nedeniyle benzer düzeyde bağlama elde etmek için daha yüksek radyoligve konsantrasyonlar kullanılmalıdır.Daha yüksek radyoligand konsantrasyonları radyoaktif GHB karşılaştırılabilir bağlama düzeyleri elde etmek için gereklidir. Ancak, daha yüksek radyoligand konsantrasyonları da gürültü oranı daha düşük bir sinyal ile spesifik olmayan bağlama düzeyini artırmak. Gürültü oranlarına en iyi sinyali almak için radyoligand konsantrasyonu, yıkama ve maruz kalma süresi gibi ar-ge koşullarını optimize etmek önemlidir ve daha önce plakayı silmeyi hatırlamak da çok önemlidir.Prosedür keşif projeleri için yararlı olabilir canlı bir hayvan bileşik bağlama hakkında bir fikir almak için in vivo koşullara uzatılabilir. Sertifikalı tam radyoaktif malzeme ile bir laboratuvarda çalışmayı unutmayın ve radyoaktivite veya paraformaldehit kullanırken koruyucu giysiler giymek.

autoradiography-as-simple-powerful-method-for-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

İlaç yüklü proteini şablon olarak kullanan ultra küçük floresan altın nanokümelerinin (Au NC'ler) yerinde sentezine dayanan küçük moleküler ilaç taraması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, protein şablonlu Au NC'lerden yayılan görünür bir floresan sinyali ile ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemek için basittir.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Burada, anjiyotensin II'nin iyot-125 etiketli bir analogu kullanılarak sıçan beynindeki anjiyotensin II Tip 1 reseptörlerinin lokalizasyonunu kantitatif, dansitometrik, in vitro reseptör otoradyografisi ile tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

Buraya, taşıma retinitis pigmentosa ile ilişkili rhodopsin mutantların ölçmek için bir yüksek-içerik görüntüleme yöntemi nitelendirdi. Bir çoklu dalga boyu Puanlama analiz rhodopsin protein hücre yüzeyine veya tüm cep telefonu ölçmek için kullanıldı.

Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Burada, [11C] SNAP-7941 tam otomatik radiolabelling ve P-GP ifade ve non-ifade HÜCRELERI Bu Pet-Tracer gerçek zamanlı kinetiği analizi için bir protokol temsil eder.

Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [11C] SNAP-7941

Eksvivo görüntüleme sistemlerini kullanan hücre penetran peptidler ile transdüksiyon derecesini değerlendirmek için protokolleri, parafin katıştırma, kesitleme ve konfokal floresan mikroskopisi kalp hedefleme peptidini örnek olarak kullanarak açıklıyoruz. Protokolümüzde, tek bir hayvan aynı organların her iki tür de görüntüleme değerlendirmesini elde etmek için kullanılabilir ve bu da çalışmalar için gerekli hayvan sayısını yarı yarıya azaltabilir.

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.

Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Bu protokol, "döngü yöntemi" [11 C] metilasyonu yoluyla dört karbon-11radyoizleyici hazırlamak için ayrıntılı bir prosedür sunar. [11C]ER-176'yı sentezleme prosedürünü, üç ek radyoizleyici için verilerle açıklıyoruz: [11C]MRB, [11C]mHED ve [11C]PiB. Döngü yöntemi, geleneksel reaksiyon kabı [11C] metilasyonuna karşı artan radyokimyasal verimlerle verimli bir sentez sağlar.

Döngü Yöntemini Kullanarak Klinik Araştırmalar için Karbon-11 Radyoligandlarının Verimliliğini ve Radyoetiketleme Verimlerini Artırma

Öğrenin, fare dokularında otoradyografi ile protein bağlanma bölgelerini yüksek uzamsal çözünürlükle görselleştirme yöntemini. Bu teknik, farmakolojik analiz ve bağlanma dağılımını hızlıca belirlemek için güçlü bir araçtır.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Daha fazla video keşfet