Name: Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin, makrofaj hücre modellerinde NBD-kolesterol kullanarak yüksek verimli kolesterol sızma kapasitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, ateroskleroz riskini değerlendirmede güvenli ve standart bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen tarafından desteklenen araştırma FIS (PS12/00866) Instituto de Salud Carlos III, Madrid, İspanya üzerinden; verir. Fondo Europeo para el Desarrollo bölgesel (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-sayımlı (RD16/0025/0002) ve eğer programı / Generalitat de Catalunya. Yazarlar Retrovirology ve Viral Immunopathology laboratuvar Institut d'Investigacions Biomèdiques Ağustos Pi I Sunyer (IDIBAPS) teşekkür ederiz. Biz T. Escribà, C. Rovira ve C. Hurtado onların yardım ve bilgi ve Teknoloji Transfer Ofisi S. Cufí korumak icat onun rehberlik için teşekkür ederiz.

Bu çalışmada, etik kurul onayı (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, hastane Kliniği, Barcelona; onay numarası HCB/2014/0756) ve yazılı tüm konulardan haberdar izni elde edilmiştir.
1. NBD-kolesterol hazırlık
<ol><li>NBD-stok (2 mM) elde etmek için kolesterol (MW 494.63; bkz: Malzemeler tablo) saf etanol geçiyoruz. 10 mg flakon için tüm şişe içeriği 2 mM hisse senedi almak için etanol 10,1 mL hacminde geçiyoruz.</li>
	<li>RPMI % 10 fetal Sığır serum ve %5 penisilin/streptomisin ile (R10 orta) takıma 5 mikron son bir konsantrasyon ulaşmak için 1640 stokta NBD kolesterolden oranında seyreltin (örneğin, NBD-kolesterol 10 mL, 5 mikron son konsantrasyonu elde etmek) tarafından NBD-kolesterol R10 Orta (2 mM) stokta 25 μL sulandrarak. Bu birim bir 96-şey plaka için yeterlidir.</li>
</ol>2. hücre kültür ve tohum (2 gün)
<ol><li>Kültür THP-1 hücreleri R10 orta 37 ° c, % 5 CO2. 106 hücre/mL x 0,3 için 3 günde ayarlayın.</li>
	<li>Düz, açık alt kısmında 0.2 x 106 hücreler/iyi R10 Orta (iyi başına 100 μL) ile beyaz bir 96-şey plaka hücrelerde tohum.</li>
	<li>100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat hücrelerle tedavi (PMA; 10 mikron stoktan) 48-72 h, 37 ° C'de kuluçka için % 5 CO2 THP-1 ayırt etmek için hücreleri dmTHP-1'e. Not: R10 orta 500 μL içinde 5 μL PMA stok (10 mikron) kullanmak için önerilir. Bundan önce dimetil sülfoksit (DMSO), aliquot ve hisse senedi-20 ° C'de 10 mL 1 g liyofilize şişede çözülerek PMA hisse senedi 10 mikron hazırlamak</li>
	<li>Alternatif olarak (öneri) birleştirmek adım 2.2 ve 2.3 daha iyi homojenizasyon için. THP-1 hücre 15 mL tüp 10 mL hazırlamak, PMA stok (10 mikron) 200 μL eklemek, karışımı yavaşça ve hemen iyi plaka üzerine başına 100 μL tohum. 2.3. adımda açıklandığı gibi hücreleri kuluçkaya.</li>
</ol>3. Apolipoprotein B Serum (ABDS) hazırlık (günde 2 ya da 3) tükenmiş
<ol><li>Polietilen glikol (PEG) çözüm hazırlamak için glisin (steril H2O ile) % 10 PBS'ye pH 7.4 200 mM bir konsantrasyon içinde oranında seyreltin. PEG PEG elde etmek için 8000 10 g için 200 mM glisin 40 mL ekleyin (w/v). Şiddetle homojenize çözüm mix.</li>
	<li>4 uygulamak parçalar % 20 serum/plazma her serum/plazma örneği 1,5 mL tüp içinde 10 parça başına PEG ve karışımı buz 25 dk17 bırakmaktır (plazma veya serum, 100 μL eklemek için 40 μL Örneğin, çözüm PEG).</li>
	<li>PEG-apolipoprotein B çökelti, 13.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Çökelti atmak. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın. Not: Biz ABDS gün 3 (taze) hazırlama öneririz. Bu mümkün değilse, ABDS 2 gün hazırlamak ve gecede 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. NBD-kolesterol hücre yükleme (2 gün)
<ol><li>DmTHP-1'in kültür orta atın ve hücreleri iki kez 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile yıkayın.</li>
	<li>5 mikron hücrelerle yük NBD-kolesterol (iyi başına 100 μL) R10 orta ve gecede kuluçkaya 37 ° C, % 5 CO2.</li>
</ol>5. kuluçka kolesterol alıcısı (3 gün) ile
<ol><li>Orta atın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>2-%5 ABDS veya renksiz RPMI 1640 Orta (iyi başına 100 μL) için 4-6 h 37 ° C'de seyreltilmiş saf lipid alıcısı (HDL, ApoA, apolipoprotein, vb) istenen konsantrasyonu hücrelerle kuluçkaya Not: renksiz RPMI 1640 orta alıcısı ve olumlu bir denetimi (C +) (örneğin, sağlıklı bağış bir havuzdan ABDS) veya saf HDL olmadan oluşan bir negatif kontrol (C-) içerir. Not (ek Şekil 1) analiz olumlu denetim özellikle hasta numuneleri (hastalık koşullar) olduğunda geçerlidir.</li>
	<li>Hücre lizis çözümü 1 (50 mM Tris arabellek, 150 mM NaCl, H2O) bir 200 mL hazır hazırlamak. Hücre lizis çözüm 1:1 (v: v) 1 oranı lizis çözüm 2 elde etmek için saf etanol ile karıştırın.</li>
</ol>6. floresan sinyal yakalama (3. gün)
<ol><li>
Medya NBD-kolesterol algılama
	<ol>
<li>Hücre orta plakalar kaldırmak ve yeni bir beyaz 96-şey plaka opak bir düz dipli ile toplamak.</li>
		<li>Medya örneklerinde bir en uygun floresan sinyal algılama için 1:1 oran 96-şey beyaz tabak içinde elde etmek için her Orta örneğinin 100 μL saf etanol 100 μL ekleyin.</li>
		<li>Plaka tedavi medya ile daha fazla ölçmek için luminometer içinde bir 463⁄536 nm (uyarma/emisyon) dalga boyu floresan yoğunluğu (FI) tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre içi NBD-kolesterol algılama
	<ol>
<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Hücre içi kolesterol elde etmek için onları 100 μL lizis çözüm iyi 2 ile kuluçka hücreleri parçalayıcı ve oda sıcaklığında (RT) 25 min için plaka sallamak.</li>
		<li>Bir en uygun floresan sinyal algılama hücre lysate örneklerinde yakalamak için hücre lysates aynı beyaz floresan yoğunluğu 96-şey plaka ile açık düz alt (aynı plaka içinde adım 2.2 hücreleri seribaşı).</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.3 floresan yoğunluğu (FI) içinde luminometer duyarlılığı parametresi 50 yazılım ayarlarken ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
</ol>7. sonuçları analiz
<ol><li>Bir örnek kolesterol sızma oranı formülüne göre hesaplanan yüzde olarak ifade: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg">
</li>
	<li>Kolesterol sızma (CE) son ölçü negatif kontrol (NBD-kolesterol ile yüklü ama kolesterol alıcısı olmadan renksiz RPMI 1640 orta ile inkübe örnek) CE çıkararak CE elde bir tane verdim: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
<li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-cholesterol%3A+Is+it+really+good%3F+Differences+between+apoA-I+and+HDL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li>
<li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li>
<li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples%3A+Systematic+Review+of+the+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li>
<li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Probes+and+Tags+to+Study+Biomolecular+Function%3A+for+Proteins%2C+RNA%2C+and+Membranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li>
<li>Ostašov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells%3A+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li>
<li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li>
<li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li>
<li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+reporter+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li>
<li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanden+Development+of+a+Cell-Based%2C+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li>
<li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function%3A+implications+for+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sage+weed+%28Salvia+plebeia%29+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li>
<li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport%3A+Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li>
<li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar mucitler başlıklı patent başvuru (EPO; 18382337.6-1118; 17 Mayıs 2018) olduğunu bildirmek istiyorum "kolesterol sızma belirlemek için yöntem" dayalı bu yöntemi.

Floresan etiketli kolesterol çözümlemek ve özellikleri ve metabolizma doğal kolesterol tüp bebek araştırmak için umut verici bir stratejidir. Başlıca avantajları vardır bu hücreleri tarafından alınabilir, hücre içi sağlar ve membran dağıtım çalışmaları ve kolesterol sızma deneyleri bu Protokolü (Şekil 7) olduğu gibi bu tür uygulanabilir. Bazı floresan etiketli steroller kolesterol izleme BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol ve 22 - ve 25-NBD-kolesterol12<...

Dünya Sağlık Örgütü göre iskemik kalp hastalığı ve inme (muhasebe 15.2 milyon ölüm olmak üzere toplam)1ölüm dünya çapında geçerli asıl nedenleri vardır. Ateroskleroz ve kan damarları2,3' te aterom plak yırtılması tarafından öncesinde kardiyovasküler hastalık (CVD) ikisi de.
Ateroskleroz makrofajlar, T hücreleri, mast hücreleri ve dendritik hücreler endotel sızmak ve sonunda aterosklerotik plaklar oluşturan kan birikir bir gemi Duvar iltihabi bir hastalıktır. Aterosklerotik plaklar çekirdek ve kolesterol kristalleri, yüksek çözünürlüklü B-mod ultrasonografi ölçümleri karotis intima media kalınlığı4,5tarafından kanıtlanan bir lipid mevcut. Makrofajlar, kolesterol sızma lipid alıcısı parçacıklar doğru ve çöpçü reseptör SR-BI aracı ATP-bağlayıcı kaset (ABC) reseptörleri ABCA1, ATP bağlama kaset Alt familya G üye 1 (ABCG1) tarafından yapılır. Kolesterol akını ve sızma makrofajlar içinde dengesizlik ateroskleroz başlatma6anahtar bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol sızma periferik doku için plazma kolesterol eleme önemli bir adım ve karaciğer ters kolesterol taşıma (RCT) denen bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) parçacıklar yüzeyinde bulunan makrofajlar ağırlıklı olarak apolipoprotein A1 (ApoA1) üzerinden aktarılır. HDL kolesterol karaciğere atılımı ve yeniden kullanımı7,8,9sonra taşıma.
Geleneksel olarak, trityum (3H) radyo etiketli kolesterol kolesterol sızma10dakika sonra kullanılmıştır. Radioisotopes emisyon sinyalinin son derece hassas10' dur; Ancak, radyo etiketli kolesterol uzun iletişim kuralları, iyonizan radyasyona maruz kalma riski ve özel radyoaktivite tesisler ve ekipman radyoaktif emisyon güvenli kullanımı sağlamak için ihtiyaç gibi bariz handikapları sunar. Aksine, floresans başarıyla sadeliği floresan sinyal algılama, fluorophores mevcut çok çeşitli ve emanet11nedeniyle tanı teknikleri dahil edilmiştir. Çeşitli floresan etiketli steroller kolesterol metabolizması (BODIPY) dehydroergosterol (ile içsel floresan), dansyl kolesterol, 4,4 üzerinden-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene de dahil olmak üzere eğitim için kullanılan - kolesterol ve 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Özellikle, NBD-kolesterol verimli bir alımı insan hücreleri12' sunar. İki farklı NBD etiketli-kolesterol Şu anda kullanılabilir: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) ve 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Şekil 1). 25-NBD-kolesterol hücresel zar dinamiği araştırma13,14' te ağırlıklı olarak kullanıldığı gibi kolesterol ile 22-NBD yan etiketli en iyi kolesterol sızma çalışmalar, uygun olmayabilir.
Hücre hatları genellikle tüp bebek kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılan insan lösemi kaynaklı THP-1 hücreleri, fare ham 264.7 hücreleri15veya J774.1 gibi monosit benzeri hücrelerdir. Bu hücrelerin tümünü phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) kullanılarak in vitro makrofajlar içine farklılaşmış, ama makrofajlar (dmTHP-1) en iyi THP 1 türetilmiş yansıtmak ve insan makrofajlar16taklit.
Mevcut çalışmada, en iyi duruma getirme ve 22-NBD-kolesterol [3H] Alternatif olarak kullanarak serum numuneleri dmTHP-1, kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için bir floresan yüksek üretilen iş yöntemi standartlaştırmak-kolesterol. Buna ek olarak, biz en iyi duruma getirilmiş floresan tekniği ile standart radyoaktif analog karşılaştırın.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu toplama plakası</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>opak şeffaf tabanlı beyaz 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>96 oyuklu kültür plakası</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>beyaz 96 oyuklu plaka düz şeffaf</td></tr> <tr><td>dipliKolesterol Akış Test Kiti (Hücre bazlı)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>ticari yüksek verimli hücre bazlı tahlil kiti, kolesterol akışı</td></tr><tr><td>renksiz RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640, pehnol-kırmızı</td></tr><tr><td>Gen5 Veri Analiz Yazılımı</td><td>olmadan BioTek</td><td></td><td>Sürüm 2.0</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>Glisin, hayvansal olmayan kullanım</td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Çoklu Algılama Mikroplaka</td></tr><tr><td>Okuyucu Lizis Çözeltisi 1</td><td>kurum</td><td></td> içi <td>50 mM Tris Tamponu, 150 mM NaCl ve H2O</td></tr><tr><td>Lizis Çözeltisi 2</td><td>kurum</td><td></td> içi <td>Saf etanol ve Hücre Lizis Çözeltisi 1:1 (v:v)</td></tr><tr><td>NBD-kolesterol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oksa-1,3-Diazol-4-il)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&beta;-Ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Fosfat tamponlu&nbsp; tuzlu</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202452-250G</td><td>polietilen glikol</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td>Phorbol 12-merystate B-asetat.</td></tr><tr><td>%10</td><td>fetal sığır serumu ve %5 Penisilin/Streptomisin ile desteklenmiş R10</td> <td>kurum</td><td></td> içi RPMI 1640.</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640, 1.5 g/L sodyum bikarbonat ve 4.5 g/L glikoz içeren 2 mM L-glutamin</td></tr><tr><td>ile THP-1 hücreleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ATCC, #TIB-202</td><td>bir yaşındaki bir bebekten lösemiden türetilen monosit benzeri çizgi</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek işlem hacmi nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Ateroskleroz kardiyovasküler hastalık (CVD) yol açar. Hala belirsiz olup kolesterol HDL (cHDL) konsantrasyon ateroskleroz gelişmede nedensel bir rol oynar. Ancak, önemli bir aterom plak oluşumu, erken evrelerinde kolesterol sızma kapasitesi HDL (makrofajlar kolesterolden kabul etme yeteneği HDL parçacıkların) için faktördür köpük hücre oluşumunu önlemek için. Bu endotel ve ters kolesterol taşıma (RCT) kolesterol karaciğer yoluyla ortadan kaldırmak için bir parçası kolesterol birikimi kaçınmak önemli bir adımdır. Kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri biyomarker ateroskleroz için kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. Geleneksel olarak, [3H]-kolesterol kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılır. Bu çalışmada, floresan etiketli-kolesterol (NBD-kolesterol) kullanarak daha güvenli ve daha hızlı bir strateji geliştirmek için THP 1 türetilmiş makrofajlar kolesterol alımı ve sızma sürecinde izlemek için hücresel bir tahlil amacımız. Son olarak, biz optimize etmek ve NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.

Kolesterol sızma tahlil vitro bir verilen serum, plazma veya HDL parçacıkları içeren süpernatant kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için amaçtır. Etiketli-kolesterol bir standart makrofaj hücre kültürünü bir kültürün içine yükleme ve FBS ücretsiz medya ile hücre içine seyreltilmiş test örnek ile iletişim inducing yöntemi oluşur. Son olarak, NBD floresan düzeylerinden medya ve hücre lysate olarak ölçülür. Ölçümler en iyi duruma getirmek için hücreleri effluxed kolesterolden medya için etanol içeren bir çözücü bir ha...

Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.

Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Bu protokol, ceramal plazmada kolesterol reflüsünün kolesterolü sonlandırılması için hücre bazlı yöntemimizdir. Özellikle gösterimlerde. Bu kardiyovasküler risk tanısı için uygulanabilir, ve tanımlamak veya kolesterol düşük bakım değerlendirmek için.Bu teknik, benzer kalite düzeyleri ile sonuçlar sağlayarak yayılan malzemelerin taşınması ile risk ve yükleri önler, Kolesterol reflü olanlar ait böylece ilişkilendirmek için bildirilmiştir, plazma veya ceramal kolesterol reflü kabul karşılaştırılabilir, bizim referans kontrolü ve bu yöntemden muzdarip riskini sağlayabilir hücre hatları da uygulanacaktır , diğer insan hücre hatları ve hatta birincil makro aşamaları gibi. Makro fazlar veya ve insan kaynaklı sprey düğmesi kök hücreleri. Bu prosedürü başlatmak için, iki mikromolar son konsantrasyonu ile bir stok çözeltisi elde etmek için saf etanol NPD kolesterol eritmek.Beş mikromolar son konsantrasyonulaşmak için AR 10 orta NBD kolesterol stokunun seyreltilmiş 25 mikrolitre. Kültür thp-1 hücreleri bizim 10 orta 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile. Her üç günde bir hücre yoğunluğunu mililitre başına 300.000 hücreye ayarlayın.Sonra düz bir açık alt ile 96-iyi plaka elde edin. Daha iyi homojenizasyon için, 15 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre thp-1 hücresi hazırlayın ve 200 mikrolitre PMA stoku ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 200, kuyu başına 000 hücreleri plaka kuyuları içine karışımın 100 mikrolitre tohum.Thp-1 hücrelerini DM thp-1 hücrelerine ayırmak için 48 ila 72 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. İlk seyreltik glisin 10% PBS steril su ile, pH 7.4 de 200 mikromolar konsantrasyonu için. %20 peg çözeltisi hazırlamak için 10 gram peg 8000'e 40 mililitre seyreltilmiş glisin ekleyin ve homojenize etmek için şiddetle karıştırın.Daha sonra 1,5 ml'lik bir tüpteki her serum veya plazma örneğine numunenin 10 parça başına %20'si dört parça uygulayın. Karışımı 25 dakika buzda bekletin. Peg apolipoprotein B santrifüj 13000 kez G çöktü ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat.Çökelti atın ve yeni bir tüp için supernatant aktarın. Farklılaştırılmış thp-1 hücrelerini içeren plakayı alın. Kültür ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın.Her kuyuya AR-10 orta 5 mikromolar MVD kolesterol 100 mikrolitre ekleyin. Bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün atın, orta atın.Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve sonra 100 mikrolitre ABDS ekleyin veya saflaştırılmış lipid alıcı rpmi seyreltilmiş 1630 orta her bir kuyuya istenilen konsantrasyona. Metin protokolünde belirtildiği gibi, kolesterol kabul edenleri içermeyen negatif bir kontrol ekleyin ve 4-6 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bu arada, metinde belirtildiği gibi hücre lisis çözüm bir 200 mililitre stok hazırlayın.Bu çözeltiyi etanol ile karıştırın, bire bir hacimsel oranda da lysis çözeltisi elde edin. Medya ve BD kolesterol tespiti için, opak düz alt ile yeni bir beyaz 96-well plaka toplanan plakalardan hücre orta kaldırın. Yeni plakada bire bir oranı elde etmek için her orta numunenin 100 mikrolitresine 100 mikrolitre saf etanol ekleyin.Bir illuminometre kullanarak, floresan yoğunluğunu 463 nanometre uyarma ve 536 nanometre emisyon ölçün. Hücre içi NBD kolesterol tespiti için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre lysis çözeltisi ekleyin ve 25 dakika sallayarak oda sıcaklığında kuluçkaya yatın.Bundan sonra, yazılımdaki duyarlılık parametresini 50'ye ayarlarken floresan yoğunluğunu ölçün. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi kolesterol efflux son ölçüsünde kolesterol efflux oranını belirlemek. Saf etanol nbd kolesterol seyreltme sulu çözeltiyüksek içerik, yoğunluğunu düşürür iken en yüksek floresan yoğunluğu değerleri üretir.Bu, floresan salınımının bu molekülün içerdiği ortama son derece bağımlı olduğunu göstermektedir. Bire bir oranında ortam ve etanol karışımı kullanılırken, floresan yoğunluğu orantılı olarak artış gibi görünüyor, kolesterol analog bir konsantrasyon ile, prob bu koşullar altında uygun davrandığını düşündürmektedir. Yüklü hücreleri kolesterol kabul edenlerle kuluçkaya yatırmak için gereken süreyi belirlemek için hücre ortamı farklı zaman noktalarında hasat edilir.Kolesterol efflux doğrusal olarak sıfırdan altı saate kadar gelişti ve maksimum sinyal ABDS hücrelere eklendikten altı saat sonra alındı. Doygunluk eşiği ve dinamik aralık, medya içeren HDL'nin farklı yüzdelerinde kolesterol efflux'ü ölçerek test edilir. Yüksek verim varlığında, efflux doğrusal olarak %1'den %7'ye yükselir ve %7'den yüksek konsantrasyonlarda kolesterol efflux kapasitesinin zirvesine ulaşır ve fluroescent'in yoğunluğu ABDS yüzdesi ile ters bir ilişkide azalır.Floresan tabanlı yöntemin performansı daha sonra standart radyo etiketli teknik ile karşılaştırılarak değerlendirilir. Her iki teknik de abds farklı konsantrasyonlarda kullanırken son derece ilişkilidir. Açıklanan yöntem, kolesterol efflux değerleri içinde kabul eden konsantrasyonların %5 ile %15 arasında artmasına duyarlıdır Selülarizerin agrega içermediğinden emin olmak önemlidir.Kritik nokta, homojen ve optimum ağırlıkta floresan ölçmek için, bir agrega etanol içeren bir ortam sınıflamaktır. Bu işlemden sonra, adı teknik kolesterol ölçülebilir, ve kolesterol efflux yolu ilaçların etkisi belirlenebilir. Ayrıca okul sonunda kardiyovasküler risk asses bir tanı olarak kullanılabilir.Bu yöntemin radyoaktif standart yöntemden çok daha kolay ve güvenli olduğuna inanıyoruz. Ancak yine de hücre bağımlısıdır. Etanol'ün yanıcı olduğunu ve buna göre depolanıp ele alınması gerektiğini lütfen unutmayın.

high-throughput-nitrobenzoxadiazole-labeled-cholesterol-efflux-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kolesterol tahlilini kültürü hücrelerinden kolesterol akışı hızı ve hücreler serbest kolesterol kabul plazma alıcısının kapasitesi ölçmek için tasarlanmıştır. Tahlil içi havuzu ve ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest bırakılması arasında kolesterol kolesterol, denge ile hücrelerin etiketlenmesi oluşur.

Kolesterol akışı Testi

Proteolipozomlar, iyi tanımlanmış bir biyokimyasal ortamda yeniden oluşturulan saflaştırılmış kanalları ve taşıyıcıları incelemek için kullanılır. Bu proteinlerin aracılık ettiği akışı ölçmek için deneysel bir prosedür gösterilmiştir. Sulandırılmış proteinin fonksiyonel özelliklerini kantitatif olarak belirlemek için proteolipozomları hazırlama, kayıtları gerçekleştirme ve verileri analiz etme adımları açıklanmaktadır.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Bu çalışmanın amacı kolesterol parçacıkları morfolojisi oransal vitro lipid düşürücü ilaç etkileri değerlendirmek için yapıldı. Karşılaştırma lipid düşürücü ilaçların kolesterol parçacıkları Morfolojik özellikleri oransal olarak etkileri varyasyonlar saptandı.

Kolesterol parçacıkları morfolojisi oransal olarak Lipid düşürücü ilaçlar farklı etkileri

Bu iletişim kuralı görüntüleme sistemi içinde çeşitli hücre tiplerinin bir canlı hücre kullanarak gerçek zamanlı akını oranları ile LDL kolesterol alımını ölçme verimli bir yaklaşım sağlar. Bu teknik Farmakolojik aktivite LDL akını hücre morfolojisi ve dolayısıyla potansiyel sitotoksisite izleme sırasında etkileyen bileşiklerin ekran için bir platform sağlar.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Bu protokol, uzun zincirli ve çok uzun zincirli doymuş yağ asitlerinin BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 floresan analogları ile stimülasyon üzerine endotel hücrelerinde hücresel lipid alımını ölçmek için bir in vitro testi detaylandırır. Bu yöntem verimlidir ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir ve lipid metabolizmasını incelemek için yararlı bir yaklaşım sunar.

Floresan Yağ Asidi Analogları Kullanılarak Endotelyal Yağ Asidi Alımının Miktar Tayini

Burada, tüm insan plazmasında veya serumunda bulunan yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) tarafından lipid donör partiküllerinden spesifik olarak uzaklaştırılan floresan fosfolipid miktarını ölçmek için protokolleri açıklıyoruz. HDL işlevselliğinin bu metriğinin, kardiyovasküler hastalık olayını öngördüğünü gösterdik.

Yüksek Yoğunluklu Lipoproteine Özgü Fosfolipid Akış Testi

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Öğrenin, makrofaj hücre modellerinde NBD-kolesterol kullanarak yüksek verimli kolesterol sızma kapasitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, ateroskleroz riskini değerlendirmede güvenli ve standart bir araç sunar.

Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

Daha fazla video keşfet