Name: Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, sıçan kemik iliğinden osteoklast öncü hücrelerin izolasyonu, arıtılması ve farklılaşmasını. Bu yöntem, kemik metabolizması hastalıkları ve osteoporoz araştırmaları için güvenli ve verimli bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81473692) tarafından Yong ma için desteklenmektedir. Yazarlar Çin tıp Nanjing Üniversitesi Klinik Tıp Ilk Koleji Tıp Araştırma Merkezi tüm personel teşekkür ederiz.

Burada tarif edilen hayvanları içeren tüm yöntemler, Nanjing Çin Tıp Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc) tarafından onaylanmıştır.
1. Kurulum
<ol><li>Birkaç boyuna kesilmiş 1 mL pipet uçları (1 cm) ve birkaç 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpleri hazırlayın. Pipet uçları ve mikrosantrifüjlerin tüplerini 103 kPa ve 121 °C ' de 20 dakika boyunca koyun ve steril olduklarından emin olun.</li>
	<li>Yalıtım prosedürü sırasında izole dokularda korumak için bir kutu buz ve çeşitli steril yemekler hazırlayın.</li>
</ol>2. kültür orta hazırlanması
<ol><li>Tam kültür ortamını hazırlayın. Penisilin/streptomisin% 1 ' inin son çözeltisi ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren asgari esansiyel orta Alfa (α-MEM) kullanın.</li>
	<li>0,22 μm filtre kullanarak 2,1 adımda medyayı filtreleyin.</li>
	<li>Kemik iliği indüksiyon ortamını hazırlayın. Çözümün 50 mL için, 10.000 ng/mL (malzeme tablosu) konsantrasyonunda 125 μL m-CSF eklemek için, tam kültür ortamının (adım 2,2 ' den) 49,875 ml 'ye kadar 25 ng/ml m-CSF ' i son bir çözüm haline getirmek.</li>
	<li>Osteoklast indüksiyon ortamını hazırlayın. Çözümün 50 mL için, 10.000 ng/mL (malzeme tablosu) konsantrasyonu 500 ΜL rankl eklemek Için 49,5 ml kemik iliği indüksiyon Orta (adım 2,3) son bir çözüm yapmak için 25 ng/ml M-csf ve 100 ng/ml rankl.</li>
</ol>3. kemik Miliği-türetilen hücrelerin yalıtımı
<ol><li>
Ötenazi
	<ol>
<li>Dört Sprague Dawley fareler CO tarafından euthanize2 inhalasyon servikal dislocation izledi, ve onları batırmak 75% etanol 1 dakika. Not: Hayvanların aynı cinsiyet ve benzer bir yaş olduğundan emin olun. 2 ila 3 haftalık hayvanlar tavsiye edilir. İki fareler Santrifüjlü Yöntem için hazırlanır, diğer ikisi ise geleneksel yöntem içindir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geleneksel Yöntem
	<ol>
<li>Hayvanları bir dezenfektan tahtasında bir fitil konumuna yerleştirin. Steril makas kullanarak, cilt soyma için Proksimal femur küçük bir kesi (yaklaşık 1 cm) olun.</li>
		<li>Uyluk ve tibias dışarı dışarı incelemek. Kaval ve uyluk dikkatle ve nazikçe izole etmek için kalça, diz ve ayak bileği eklem çevresindeki bilateral bağlantı parçalarını kes. Kemik çevresindeki dokuların bir kısmını keser; dikkatli olun. Tüm süreç boyunca kaval ve uyluk kırmayın.</li>
		<li>Temizlenmiş kemikleri tam kültür ortamının 5 mL 'ye sahip bir çanak içine yerleştirin. Uzun kemiği steril makas ile kesip, iliği boşluğu beyaz olana kadar 10 mL komple medya ile iliği boşluğunu dikkatle temizlemek için 1 mL şırınga iğnesi kullanın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu adım 3.2.3 'den 50 mL tüpüne aktarın ve ardından kalan dokusu kaldırmak için 70 μm filtreyle filtreleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyona 5 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu (malzeme tablosu) ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 8 dakika boyunca inküyün. Sonra, hücre Pelet verim için 5 dakika 250 x g hücreleri Santrifüjü.</li>
		<li>Orta dışarı aspirate ve tam medya 10 ml hücreleri pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve bu bölümdeki adımlarda harcanan süreyi hesaplayın (Bölüm 3,2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geliştirilmiş Yöntem
	<ol>
<li>Hayvanları bir dezenfektan tahtasında bir fitil konumuna yerleştirin. Cildi soyma için steril makas ile Proksimal femur küçük bir kesi (yaklaşık 1 cm) olun.</li>
		<li>Uyluk ve tibias dışarı dışarı incelemek. Düzgün kemik etrafında dokularının parçası kesilmiş (tamamen kaldırmak için gerek yok). Tüm süreç boyunca kaval ve uyluk kırmayın.</li>
		<li>Fosfat-tamponlu tuz (PBS) 12 ml ile kaval ve uyluk durulayın ve yarısını onları kesti. Snipped kaval ve uyluk bir 1 ml pipet ucu (adım 1,1), daha sonra bir mikrosantrifüjlü tüp içine koymak ve 4 °c ' de 45 s için 1.000 x g 'de 3x santrifüjlenmiş yerleştirin.</li>
		<li>Santrifüjden sonra, kemiği içeren Pipet ucunu çıkarın ve kemik iliğini tüpte bırakın. Mikrosantrifüj tüpüne tam medya 200 μL ekleyin ve iliği iyice parçalayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon adım 3.3.4 bir 50 mL tüp aktarmak ve sonra, kalan doku kaldırmak için bir 70 μm süzgeci ile filtre.</li>
		<li>Bir hemocytometer kullanarak hücreleri saymak ve bu bölümdeki adımlarda harcanan süreyi hesaplayın (Bölüm 3,3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yoğunluk degrade santrifüjleme ile arıtma
<ol><li>Hücre süspansiyonunu adım 3.2.6 veya adım 3.3.5 α-MEM ile 2 mL 'ye ayarlayın.</li>
	<li>Bir steril silisleşmiş santrifüj Tüp hazırlayın ve 8 ml hücre ayırma çözeltisi (malzeme tablosu) tüp ekleyin.</li>
	<li>Hücre ayırma çözümü için adım 4,1 hücredeki süspansiyon ekleyin. Pipet ucunu tüpün iç yüzeyine uyur ve iç yüzeye 45 ° tutun. Süspansiyonu ekledikten sonra hücrelerin tabakası ile ayırma çözeltisi arasında açık bir sınır görünecektir. Not: Operasyon büyük bakım gerektirir ve yavaş yapılması gerekir.</li>
	<li>Katmanlı solüsyonu 30 dakika boyunca 500 x g 'de yatay santrifüjde santrifüjle yapın. Santrifüjden sonra, yukarıdan aşağıya doğru hedef hücreleri içeren bulutlu ikinci katmandan aspirasyon yapın. Not: Santrifüjden önce santrifüj hızlandırmayı ve yavaşlamayı iptal edin. Santrifüjleme sonrası altı kat vardır; ilk katman seyreltilen tabakasıdır, ikinci katman monosit tabakasıdır, üçüncü katman mononükleer hücrelerin tabakasıdır, dördüncü katman şeffaf ayrım sıvı bir katmandır, beşinci granül hücre tabakası ve altıncı katman kırmızı hücredir Katman.</li>
	<li>Hedef hücreleri yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri 3x yıkamak için PBS 5 mL ekleyin. Her yıkamadan sonra, 250 x g 'de hedef hücreleri santrifüjle 5 dakika boyunca hücre Pelet verim.</li>
	<li>Kemik iliği indüksiyon orta ile hücre Pelet resuspend ve bir hemocytometer kullanarak hücreleri saymak. Ekleme 5 – 8 mL kemik iliği indüksiyon orta adım 2,3 son hücre çözümü elde etmek için 300.000 hücreler/mL. 24-kuyu plakasının her bir kuyusu için 1 mL ekleyin.</li>
</ol>5. Kültür ve farklılaşma
<ol><li>37 °C ' de 24 saat boyunca hücreleri inküt ettikten sonra, orta seviyede yavaşça aspirasyon yapın ve her bir kuyu için 1 mL osteoklast indüksiyon ortamını ekleyin. Plakayı yavaşça karıştırın ve 37 °C ' de bir kuluçe yerleştirin.</li>
	<li>Osteoklast indüksiyon orta her 48 h değiştirin. Bunu yaparken, değiştirmek 0,8 kuyu orta ml ve hafifçe plaka kışkırtmak. Not: Büyük, motil ve multinükleated osteoksürer, genellikle 4 – 6 gün etrafında, ters bir mikroskop altında iyi gözlemlenmelidir.</li>
</ol>6. tartrat dirençli asit fosfataz boyama
Not: Bu İndüksiyon (Bölüm 5) başarılı olursa multinucleate osteocsürer 4 – 6 gün sonra mevcut olacaktır.
<ol><li>4 mL% 37 formaldehit, 32,5 mL aseton ve 12,5 mL 'yi bir sitrat çözeltisi ile birleştirerek, fixatif solüsyonu hazırlayın. Fixatif solüsyonu 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Tartrat dirençli asit fosfataz (Trap) leke çözeltisi (malzeme tablosu) 50 μL sodyum nitrite, 50 μL hızlı Garnet GBC baz çözeltisi, 50 μL naftol as-bı fosfat çözeltisi, 200 μL bir asetat çözeltisi ve 100 μL ekleyerek hazırlayın 37 °C ' ye prewarmed olan 4,55 mL deiyonize su içine tartrat solüsyonu. Daha sonra, 1 dakika boyunca inversiyon hafifçe karıştırın ve 2 dakika stand izin.</li>
	<li>Osteocsürer başarılı indüksiyon sonra, orta Aspire, ve yavaşça PBS ile 3 kuyuları yıkayın.</li>
	<li>Sabitleme çözümünü oda sıcaklığına (RT) getirin. 30 s için kuyulara 2 mL fixatif çözüm ekleyin ve hücrelerin kurumasına izin vermez.</li>
	<li>Fixatif çözeltisi Aspire, 37 °c ' ye prewarmed olan deiyonize su ile 3x yıkayın ve sonra su Aspire.</li>
	<li>37 °C ' de 1 saat için 2 mL TRAP leke çözeltisi ekleyin ve numuneyi karanlıkta tutun.</li>
	<li>1 saat sonra, leke Aspire, ve yavaşça 37 °c prewarmed deiyonize su ile örnek yıkayın, ve sonra, su Aspire.</li>
	<li>Bir hematoksinlin çözeltisi içinde 1 dakika hücreleri karşı. Boyamadan sonra, hematoksilen çözeltisi Aspire ve hafifçe deiyonize su ile hücreleri 3x yıkayın.</li>
	<li>Aydınlık alan mikroskobu kullanarak görüntü osteocsürer, ve üç veya daha fazla çekirdekler ile Trap+ hücreler mor görünecektir.</li>
</ol>7. toluidine mavi boyama kullanarak kemik Reorpsiyon assay
<ol><li>
Kemik dilimleri ön tedavisi
	<ol>
<li>Mikroelektrik testere ile uzunlamasına eksen boyunca 2 cm kalınlığında dilimleri içine taze sığır femoral kemik korteks kes. Sonra, kesme ve 80 μm içine sert doku öğütücüler ile dilimleri eziyet.</li>
		<li>Dilimleri deiyonize su ile bir kabı ve 100 Hz ultrason 1 h için yıkayın ve 3x tekrarlayın.</li>
		<li>Dilimleri 2 h için% 75 alkole batırın. Sonra, alkol Aspire ve temiz bir platformda 1 saat için ultraviyole ışık için dilimleri her yan açığa.</li>
		<li>Hücreleri dikmeden önce, en az 2 h için kültür ortamında dilimleri batırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toluidin mavi boyama
	<ol>
<li>Önceden işlenmiş kemik dilimleri 24 kuyu plakasına yerleştirin. 4,6 adımda belirtildiği gibi hücreleri bitki ve Bölüm 5 ' te belirtildiği gibi hücreleri teşvik.</li>
		<li>Osteocsürer (4 – 6 gün sonra) görünümünden sonra, dilimleri 1 mL 0,25 M amonyum hidroksit ile yıkayın ve 5 dakika boyunca her biri kemik dilimleri üzerinde rezorpsiyon çukurları analizine izin vermek için canlı hücreleri kaldırmak için 3x 'i sonlayın. Daha sonra, amonyum hidroksit çıkarın ve 2 dakika için dilim başına 1% 1 ml (WT/Vol) toluidin mavi çözüm ile dilimleri leke.</li>
		<li>Dilimleri PBS ile yıkayın. Rastgele beş görünümü seçin ve bir görüntü analiz yazılımı kullanarak reorpsiyon alanının yarı niceliksel analizini gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. tarama Elektron Mikroskopisi
<ol><li>1 mL 2,5% glutaraldehit ile adım 7.2.1 kemik dilimleri önek RT 2 h için dilim başına, ve daha sonra, her biri 1 M amonyum hidroksit ile 3 dakika için dilimleri 3x sonikat hücreleri kaldırmak ve amonyum hidroksit kaldırmak için.</li>
	<li>PBS ile her biri 12 dakikalık kemik dilimleri 3x yıkayın.</li>
	<li>RT 2 h için% 1 osmik asit ile kemik dilimleri düzeltin.</li>
	<li>Etanol gradyan dehidrasyon gerçekleştirin, ile 50%, 70%, 80%, 90%, ve 95% etanol, için 15 her gradyan için dakika, ve daha sonra, 15 dakika boyunca isoamill asetat ile etanol değiştirin.</li>
	<li>Kat altın Paladyum ile dilimleri, ve daha sonra, elektron mikroskobu tarama ile analiz.</li>
</ol>9. kalsitonin reseptörün immünofluorescence boyama
Not: Bu indüksiyon başarılı olursa multinucleate osteocsürer 4 – 6 gün sonra mevcut olacaktır (Bölüm 5).
<ol><li>Orta dışarı aspirate ve hafifçe PBS ile iyi 3x yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C ' ye önceden soğutulan% 4 paraformaldehit ile 10 dakika boyunca düzeltin.</li>
	<li>Buz üzerinde 30 dakika için iyi başına 0,3% noniyonik yüzey madde ile 1 mL PBS ekleyin. Daha sonra, PBS 'yi% 0,3 Noniyonik yüzeyden Aspire ve buzda 30 dakika boyunca% 5 FBS ile 1 ml PBS ekleyin.</li>
	<li>PBS 'den aspirate ve membranları Anti-kalsitonin reseptörü (Anti-CTR) ile PBS 'de 4 °C ' de bir gece içinde 1:100 seyreltme ile inküyin.</li>
	<li>Solüsyonu aspirate ve membranları Alexa-488-Conjugated Anti-Rabbit IgG antikorları ile 1:1000 ' de PBS 'de 1 saat RT 'de seyreltme.</li>
	<li>Çözeltinin aspirate ve hafifçe PBS ile hücreleri 3x yıkayın. Hoechst 33342 ile çekirdekleri counterstain RT 3 dk için leke.</li>
	<li>Çözelti aspirate ve hafifçe PBS ile hücreleri 3x yıkayın. Floresans microskopi ile to yoğunluğuna uyun.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li>
<li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22British+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li>
<li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li>
<li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin%2Fosteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE%2FRANKL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+The+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culture+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570(2014).</li>
<li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li>
<li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li>
<li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li>
<li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+osteoclast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li>
<li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Kemik emici hastalıkların mekanizmalarını anlamanıza ve yeni terapötik ajanlar geliştirmesine yardımcı olabilecek kemik metabolizmasını incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için osteocsürer in vitro elde etme ve çalışma becerisi, önemli ve temel bir beceridir. Bu çalışmada, önceki yöntemlere dayalı bazı değişikliklerle ilgili bir protokol tanımlanmıştır.
Kemik iliği elde etmek için pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, büyük ölçüde kemik iliği ve geleneksel yöntemlerle karşı...

Kemik homeostazisi, kemik-reorbing osteoksürer ve kemik oluşturan osteoblastlar1ile düzenlenmiş karmaşık bir fizyolojik süreçtir. Osteoblastlar ve osteocsürer ile aracılı osteoblastik ve osteoklastik aktivite arasında bir denge, sırasıyla, kemik sağlığı ve homeostaz korumak için son derece önemlidir, çünkü kemik homeostazı perturbations kemik hastalıklarına yol açabilir, böyle anormal kemik büyümesi veya kemik yoğunluğu kaybı olarak. Benzersiz kemik-reorpsiyon hücreleri olarak, osteocsürer anormal kemik imha ile ilgili hastalıklarda önemlidir, osteoporoz dahil, periodontitis, ve periprotez Osteoliz2,3.
Osteoklast kültürünün gelişimi ağırlıklı olarak iki aşamaya ayrılır. Boyde et al.4 ve Chambers ve al.5 tarafından kurulan Yöntemler 1980 ' lerde ilk aşamadan oluşuyor. Hızlı remodeling dönemi olan yenidoğan hayvanların kemiklerinden nispeten bol miktarda osteocsürer elde ettiler. Osteocsürer, özel bir ortamda kemikleri birleştirerek ve karıştırarak serbest bırakılır. Ancak, bu yöntem tarafından elde edilen hücreler miktarı ve saflık düşüktür. İkinci aşama, kemik iliği6' dan elde edilen hematopoetik soy hücrelerini kullanarak, osteoklast oluşumunun uzun menzilli kültürlerinin gelişmedir. Sitokinler, 1α gibi, 25-dihidroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2), ve Paratiroid hormonu (PTH), hangi kültür ortamına eklenir, osteoblastlar sistemi aracılığıyla hareket/stromal hücreler osteoklast oluşumu uyarmak için7,8 . Ancak, bu yöntemle elde edilen osteocsürer saflık ve miktarı modern moleküler biyoloji araştırmalarının ihtiyaçlarını karşılamaz. Sonra, makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) ve reseptör aktivatörü nükleer Factor-κB ligand (rankl) keşfi daha kolay osteoclastogenesis yapmak9,10,11, ve M-CSF ve kullanma yöntemi RANKL doğrudan osteoklast oluşumu uyarmak için yaygın olarak dünya çapında kullanılır. Ancak, hala iyileştirilmesi gereken metodoloji bazı detaylar vardır.
Şu anda, en sık kullanılan osteoklast kültür yöntemi, Marino ve al.12 ve Pei et al.13tarafından açıklandığı gibi, genellikle kemik çevresindeki çevreleyen doku kaldırılması gerektirir ve ile iliği boşluğu temizlemek için sterilize iğne kullanır tamamlanmış medya. Bu süreçte bazı dezavantajları vardır, (1) kemik etrafında çevreleyen doku kaldırılması çok zaman ve büyük cerrahi tekniği gerektirir, (2) kemikler kırılgan ve kemik iliği çıkışı yol açabilir, (3) kemik iliği boşluğu olabilir floş için çok küçük ve (4) iğne sopa yaralanma riski vardır. Bu sorunlardan kaçınmak için, kemik iliği yerine kemik iliğinin kemikleri içeren tüpleri santrifüjler. Burada, daha az zamanda ve geleneksel prosedür ile karşılaştırıldığında daha az çaba ile kemik iliği yalıtır istikrarlı ve güvenli bir yöntem tanıtmak. Yoğunluk degrade santrifüjleme kullanımı ile birlikte, tam farklılaşmış osteocsürer in vitro büyük miktarlarda elde.

<table><tbody><tr><td>Asit Fosfataz, Lekosit (TRAP) kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Sert Doku Dilimleyici</td><td>Lecia</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Sığır femur kemiği</td><td></td><td></td><td>Kendimiz tarafından satın alındı</td></tr><tr><td>Hücre İnkübatörü</td><td>Heraus</td><td>BB16 / BB5060</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sarana</td><td>s-fbs-au-015</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Sert Doku Öğütücüler</td><td>Lecia</td><td>SP-2600</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque Kit</td><td>TianJing Haoyang</td><td>TBD2013DR</td><td>Silislenmiş santrifüj tüp AMD hücre ayırma çözeltisi</td></tr><tr><td>Hochest33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Ters Faz Kontrast Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskobu</td><td>Lecia</td><td>DMI-3000</td><td></td></tr><tr><td>MEM, Glutamin yok</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, Sıvı</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Anti-Kalsitonin reseptörü</td><td>Bioss</td><td>bs-0124R</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Sıçan M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Sıçan sRANK Ligand</td><td>PeproTech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu</td><td>Absin</td><td>abs47014932</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı Elektron Mikroskobu</td><td>FEI</td><td>Quanta 200</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin Mavi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89649</td><td></td></tr></tbody></table>

sıçan kemik iliği osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteositler, monosit veya makrophaj öncülerinin birleşerek oluşturduğu monoksit-makrophaj sırının büyük, multinükleated ve kemik-resorbing hücrelerdir. Aşırı kemik reorpsiyonu osteolitik hastalıklara yol açan en önemli hücresel mekanizmalardan biridir, osteoporoz dahil, periodontitis, ve periprotez Osteoliz. Osteocsürer ana fizyolojik fonksiyon hem hidroksiatit mineral bileşeni ve kemik organik matris absorbe, kemik yüzeyinde karakteristik reorpsiyon görünümünü üreten. Vücudun diğer hücrelerine kıyasla nispeten az osteocsürer, özellikle yetişkin kemiklerde. Son çalışmalar her zaman bir sorun olmuştur daha az zaman, daha olgun osteocsürer elde etmek için nasıl odaklanmıştır. İzolasyon ve kültür tekniklerinde çeşitli iyileştirmeler daha olgun osteocsürer elde etmek için laboratuvarlarda geliştirdik. Burada, özel ve basit bir cihaz kullanarak, daha az zaman içinde kemik iliği yalıtır ve geleneksel prosedür ile karşılaştırıldığında daha az çaba ile bir yöntem tanıtmak. Yoğunluk degrade santrifüjleme kullanımı ile, biz klasik yöntemlerle tanımlanır sıçan kemik iliği, tam farklılaşmış osteocsürer büyük miktarda elde.

Protokolün amacı, çok sayıda osteoklast öncülerini rahat bir şekilde izole etmek ve arındırmak ve osteocsürer 'i başarılı bir şekilde teşvik etmektir. M-CSF ve RANKL ile tamamlayıcı olarak, dev osteocsürer gün 5 – 6 görüldü. Osteoksürer oluşumu, TRAP boyama ile başarıyla tespit edilmiştir (Şekil 1a). Büyük ve mor hücreler birden fazla çekirdeklerle TRAP-pozitif hücreler olarak kabul edildi (genellikle ≥ üç çekirdekler). Bu yöntem sayesinde, 24-kuyu plakasında...

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Bu yöntem, tam diferansiye osteoklastlar in vitro büyük miktarlarda elde etmek için kullanılabilir, çünkü önemlidir. Bu yöntemin en büyük avantajı, daha kararlı ve güvenli olması ve kemik iliği izole daha kısa sürede ve daha az çaba ile geleneksel işlem göre. Bu teknik osteoporoz, parodontit ve periprotez osteoliz gibi kemik metabolik hastalığın önemli nesnesi olan osteoklastlar, istikrarlı bir kaynak sağlayabilir.Küçük değişiklikler ile, bu protokol aynı zamanda kemik iliği sıçan veya diğer hayvanlarda hücreleri elde çeşitli elde etmek için uygun olabilir. Başlamak için, bir supine pozisyonda dezenfekte tahtası üzerinde ötenazi hayvanları yerleştirin. Steril makas kullanarak, cildi soymak için proksimal femur uzunluğu yaklaşık bir santimetre bir kesi yapmak.Sonra, uyluk ve tibias dışarı incelemek. Dikkatle ve nazikçe, tibias ve femurlar izole etmek için kalça, diz ve ayak bileği eklemleri etrafında ikili bağlantı parçaları kesti. Kemik çevresindeki dokuların bir kısmını kesin olarak kesin.Sonra, tam kültür orta beş mililitre ile bir çanak içine temizlenmiş kemikleri yerleştirin. Uzun kemiği kesmek için steril makas kullanın. Ilik boşluğu beyaza dönene kadar 10 mililitre lik tam ortamla ilik boşluğunu dikkatlice yıkamak için bir mililitrelik şırınga iğnesi kullanın.Bu hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan dokuyu çıkarmak için 70 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin. Beş mililitre kırmızı kan lisis tamponu ekleyin ve hücreleri sekiz dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, hücre pelet verimi için beş dakika boyunca 250 kez G hücreleri santrifüj.Supernatant aspire ve tam medya 10 mililitre hücreleri resuspend. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu yöntem için yapılan eylemler için harcanan zamanı hesaplayın. İlk olarak, bir supine pozisyonda dezenfekte tahtası üzerinde ötenazi hayvanlar yerleştirin.Steril makas kullanarak, cildi soymak için proksimal femur uzunluğu yaklaşık bir santimetre bir kesi yapmak. Sonra, uyluk ve tibias dışarı incelemek. Tamamen doku kaldırmak için gerek olmamasına rağmen, kemik çevresindeki dokuların parçaları kesin.Tibias ve uyluk kemiğini 12 mililitre PBS ile durulayın ve sonra ikiye bölün. Hazırlanan bir mililitre pipet ucu içine snipped tibias ve femurlar yerleştirin ve hazırlanmış bir mikro santrifüj tüp içine yerleştirin. Tüpü 1,000 kez G'de üç kez ve 45 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.Bundan sonra, kemik içeren pipet ucunu tüpten çıkarın ve kemik iliğini tüpte bırakın. Tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve iliği iyice parçalamak için tekrar tekrar yukarı pipet ekleyin. Bu hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan dokuları çıkarmak için 70 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin.Ardından, hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu bölümde atılan adımlarda harcanan zamanı hesaplayın. Steril silikize santrifüj tüpüne altı mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tüpe seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.Süspansiyon ekledikten sonra, hücre tabakası ve ayırma çözümü arasında net bir sınır görünür. Daha sonra, 45 derecelik bir açıyla tüpün iç yüzeyine bir pipet ucu yapıştırın. Katmanlı çözeltiyi yatay bir santrifüjde 500 kez G'de 30 dakika santrifüj edin.Bundan sonra, yukarıdan aşağıya hedef hücreleri içeren bulutlu ikinci tabaka aspire. Hedef hücreleri yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri yıkamak için beş mililitre PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj.Toplam üç yıkama için PBS ve santrifüj ekleyerek bu yıkama işlemini tekrarlayın. Kemik iliği indüksiyon orta ile hücre pelet resuspend. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.Daha sonra, mililitre başına 300, 000 hücrelik nihai bir hücre çözümü elde etmek için kemik iliği indüksiyon ortamı beş ila sekiz mililitre ekleyin. 24 kuyu plakaher kuyuya bu hücre çözeltisi bir mililitre ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, hafifçe orta kapalı aspire ve her kuyuya osteoklast indüksiyon ortamı bir mililitre ekleyin.Yavaşça plakayı çalkalayın ve kuvöze geri dönün. Her 48 saatte bir, her kuyudan 0.8 mililitre osteoklast indüksiyon ortamını çıkarın ve değiştirin. Kuvöze geri vermeden önce tabağı hafifçe çalkalayın.Kemik dilimleri nin ön tedavisine başlamak için, taze büyükbaş femoral kemik korteksini uzunlamasına eksen boyunca iki santimetre kalınlığında dilimler halinde kesmek için mikro elektrikli testere kullanın. Dilimleri kesip öğüttükten sonra, dilimleri deiyonize su kabına batırarak ve 100 hertz'de bir saat ultrasona tabi tutarak yıkayın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Yıkanmış dilimleri iki saat boyunca %75 alkole batırın. Daha sonra, alkol kapalı aspire ve temiz bir platformda bir saat boyunca ultraviyole ışığa dilim her slayt maruz. Toluidin mavi boyama başlamak için, 24 kuyu plaka kuyuları içine önceden işlenmiş kemik dilimleri yerleştirin.Bundan sonra, iki saat boyunca kemik dilimleri batırmak için 24 iyi plaka içine kültür ortamı ekleyin. Bitki ve daha önce gösterildiği gibi hücreleri indüklemek. Osteoklastlar dört ila altı gün çıktıktan sonra, 0.25 molar amonyum hidroksit bir mililitre ile dilimleri yıkayın.Yaşayan hücreleri çıkarmak ve kemik dilimleri üzerindeki rezorpsiyon çukurlarının analizine izin vermek için dilimleri beş dakika boyunca üç kez sonicate. Daha sonra, amonyum hidroksit çıkarın ve iki dakika boyunca dilim başına% 1 toluidin mavi çözeltibir mililitre ile dilimleke. Leke dilimlerini PBS ile yıkayın.Rasgele beş görünüm seçin ve rezorpsiyon alanının yarı nicel analizini gerçekleştirmek için bir görüntü analizi yazılımı kullanın. İlk olarak, oda sıcaklığında iki saat boyunca dilim başına%2.5 glutaraldehit bir mililitre ile kemik dilimleri önek. Hücreleri kaldırmak için bir molar amonyum hidroksit ile üç dakika boyunca üç kez önceden sabitlenmiş dilimleri sonicate.Daha sonra amonyum hidroksiti çıkarın ve kemik dilimlerini PBS ile üç kez yıkayın ve her yıkama 12 dakika sürsin. Yıkanmış kemik dilimlerini oda sıcaklığında iki saat boyunca %1 osmik asitle sabitleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi etanol gradyan dehidratasyon gerçekleştirin.Bundan sonra, 15 dakika boyunca isoamyl asetat ile etanol değiştirin. Altın paladyum ile dilimkat ve elektron mikroskobu tarama ile analiz. Bu çalışmada, osteoklast öncüleri çok sayıda izole edildi, saflaştırılmış ve başarılı osteoklastlar olmak için indüklenen.M-CSF ve RANKL ile takviye ederek, dev osteoklastlar gün beş ila altı görülür. Bu osteoklastların oluşumu tuzak boyama ile başarıyla tanımlanır. Büyük ve mor hücreler birden fazla çekirdekli TRAP pozitif hücreler olarak kabul edilir.Bu yöntem sayesinde, 24 iyi plaka osteoklast başına 30 çekirdek kadar içeren 800 osteoklast elde etmek için tipiktir. Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, bu geliştirilmiş yöntem tüm yalıtım işlemi sırasında yaklaşık 20 dakika tasarruf sağlar. Kemik rezorpsiyon aktivitesini değerlendirmek için kemik dilimleri kullanarak tipik bir in vitro yöntemdir.Toluidin mavi boyama sayesinde, rezorpsiyon alanı açık yeşil olarak görselleştirilmiş. Kemik çukurlarının yapısı ve özellikleri elektron mikroskobu taranarak açıkça görülebilir. TO, osteoklastlar belirli hücre belirteçleri biri, osteoklastlar tanımlamak ve kemik osteoklastoluşumunu incelemek için önemlidir.TO'nun pozitif ekspresyonu osteoklastları açıkça tanımlar ve makrofaj polikaryonlardan ayırır. TO, immünoforesans tahlillerinde yeşil renkle açıkça gösterilirken, mavi hücre çekirdeğini gösterir. Kemik iliği kaybetmemek için uyluk kemiği ve tibias kırık değil emin olun.Bu tekniği daha önce hiç yapmamış bir birey, hücre operasyon çözümüne yardımcı olurken mücadele edebilir. Pipet ucu tüpün iç yüzeyine yapıştırılmalı ve iç yüzeye 45 derecelik açıyla tutulmalıdır.

isolation-purification-differentiation-osteoclast-precursors-from-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.

Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz.<br...

Monosit-Makrofaj Soy Hücrelerinin Sıçan Kemiklerinden İkincil Aderans Yöntemi ile İzolasyonu

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Bu araştırma, sıçan kemik iliğinden bol miktarda nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) izole etmek için iki tekniği özetlemektedir. Bir yöntem, ticari bir nötrofil izolasyon kitini yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birleştirirken, diğeri yalnızca yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi kullanır. Her iki yaklaşım da periferik kan nötrofillerinden daha iyi fonksiyonel NET'ler verir.

Karşılaştırılabilir Kapasiteye Sahip Sıçan Kemik İliği Nötrofillerini İzole Etmek için Benzersiz Yaklaşım

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Çene kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler, çeşitli farklılaşma, kendini yenileme ve immün modülasyonda önemli işlevlere sahiptir. Gen terapisi, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta öncü hücrelerin çok önemli bir rezervuarı olarak ortaya çıkmışlardır. Burada, sıçanlarda çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için benzersiz bir yöntem sunuyoruz.

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

Öğrenin, sıçan kemik iliğinden osteoklast öncü hücrelerin izolasyonu, arıtılması ve farklılaşmasını. Bu yöntem, kemik metabolizması hastalıkları ve osteoporoz araştırmaları için güvenli ve verimli bir protokol sunar.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Daha fazla video keşfet