Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Bu yöntem, doğal lipid iki katmanlı bir ortamda sitokrom BO3 gibi solunum membran enzimlerinin proton taşıma aktivitesinin incelenmesini sağlar. Bu tek enzim tekniğinin en önemli avantajları elektrokimya kullanarak enzimatik reaksiyonları her an başlatma ve durdurma imkanıdır. Bir cam şırınga kullanarak beş miligram aliquots yapmak için cam şişeler içine Escherichia coli lipid polar ekstresi kloroform stok 200 mikrolitre transferi.

Lipidler için 1 00 0 0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 Karışıma mililitre likit uzun dalga boyu floresan boya sıyrık olarak etiketlenmiş 20 mikrolitre lik fdll. Kloroform çözeltisini kısa girdaplarla homojenize edin ve kloroformun çoğunu nazik bir azot veya argon akışı altında buharlaştırın.

En az bir saat boyunca vakum altında daha fazla buharlaşma ile tamamen kloroform izleri çıkarın. Lipitler ubiquinone 10 FDLL kuru karışımı bir aliquot için 40 milimolar MOPS pH 7,4 tampon 312,5 mikrolitre ekleyin. Lipid film tamamen yeniden askıya alınana kadar girdap karıştırın bir ultrasonik banyoda tedavi iki dakika takip.

Sonraki 25 milimolar HPTS, lipozomlar içinde kapsüllenmiş olacak bir pH duyarlı floresan boya 125 mikrolitre ekleyin. Şimdi 250 milimolar OGP yüzey aktif 137,5 mikrolitre ekleyin. Girdap kullanarak karıştırdıktan sonra, tüm lipidler sürfaktan lı misel içine solubilize olduğundan emin olmak için 10 dakika boyunca bir ultrasonik su banyosukarışımı sonicate.

Sonra 1.5 mililitrelik plastik tüp içine dağılım aktarın. Sitokrom BO3 gerekli miktarda ekleyin ve 50 mikrolitre toplam hacim yapmak için ultra saf su ekleyin. Reconstitution karışımını bir rulo mikserde 10 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın.

Sonraki iki 1,5 mililitrelik tüp kapakları her içine polistiren mikroboncuklar 50 miligram ağırlığında. Sonra başka iki 1.5 mililitrelik tüp kapakları içine polistiren mikroboncuklar 100 miligram tartın. Kurumasını önlemek için kapakları parafin filmile kapatın.

Hazırlanan dağılım ile 1,5 mililitrelik plastik tüp üzerinde polistiren mikroboncuklar ile kap koyarak reconstitution karışımı içine polistiren mikroboncuklar ilk 50 miligram ekleyin. Sonra tüpün altına mikroboncuklar getirmek için birkaç saniye için kısa bir spin gerçekleştirin. Polistiren mikroboncukların yüzey aktif maddeyi 30 dakika emmesini sağlamak için süspansiyonu bir silindir karıştırıcıüzerinde dört derecede kuluçkaya yatırın.

Polistiren mikroboncukve kuluçka eklemelerini aşağıdaki gibi tekrarlayın. Kuluçka 60 dakika için mikroboncuklar 50 miligram ekleyin. Sonra kuluçka 60 dakika için mikroboncuklar 100 miligram ekleyin.

Ve son olarak, 120 dakikalık kuluçka için 100 miligram mikroboncuk ekleyin. İnce uçlu bir mikropipet kullanarak proteolipozom solüsyonu polistiren mikroboncuklardan ayırın. TI 45 ultracentrifuge tüp MOPS tampon 90 mililitre dağılım seyreltin.

Ultracentrifuge 125 bir tip 45 TI rotor kullanarak dağılım, bir saat için 000 kez G proteolipossomes pelet. Ultracentrifugation'ı takiben, supernatant'ı atın ve peleti yeniden sulandırmadan MOPS arabelleğiyle durula. Durulama tamponu attıktan sonra, süspansiyonu 1,5 mililitrelik plastik tüpe aktarmadan önce ince uçlu bir mikropipe tutarak 500 mikrolitre MOPS tamponundaki proteolipozomları yeniden askıya alın.

12,000 kez G'de beş dakika santrifüjden sonra, yeniden oluşturulan proteoliposomes olan süpernatantı yeni bir şişeye aktarın. İki bileşenli düşük floresan epoksi kullanarak buharlaşan bir altın yüzeyinüzerine dokuz cam kapak kayar yapıştırın. Tutkalı 80 derecede dört saat boyunca tedavi edin.

Kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı modifikasyondan hemen önce, cam kapağı silikon gofretlerden bir bıçakla ayırın. Kapak kaymalarının inceliğinden dolayı, cam kaymaları kırmamak veya kırmamak için kapak kaymalarını çıkarırken dikkatli olmaya dikkat edin. Yeni ayrılmış altın kaplı kapağı 6-marcaptohexanol çözeltisine batırın ve kendi kendine monte edilmiş mono-tabakayı oluşturmak için bir gecede 20 ila 25 derece bekletin.

Ertesi gün, çözeltiden altın kaplı kapak fişleri çıkarın ve su veya metanol ile kısa bir süre yıkayın ve daha sonra isopropanol ile. Hafif bir gaz akışı altında altın kaplı kapak fişleri kurulayın. Metin protokolünde diyagramlanan altın kaplı kapak fişini bir spektro-elektrokimyasal hücrede birleştirin.

Kauçuk bir O-halkası ile tanımlanan bir alanın dışında düz bir tel ile altın temas ve sıkıca üstündeki elektrokimyasal hücre aşağı vida. Elektrolit tampon çözeltisinin iki mililitresini ekleyin ve referans ve yardımcı elektrotları hücreye yerleştirin. Kendi kendine biraraya getirilen mono katmanın kalitesini kontrol etmeye devam edin ve metin protokolünde açıklandığı gibi boşlukları çalıştırın.

Mililitre son lipid konsantrasyonu başına 0,5 miligram elektrokimyasal hücreye proteoliposomes ekleyin ve bir pipet ile biraz karıştırın. Elektrot yüzeyinde proteolipozomların emilimi bitene kadar oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika bekleyin. Tampon çözeltisini en az 10 kez değiştirerek hücreyi yıkayın, ancak elektrot yüzeyini tamamen kuru bırakmaktan kaçının.

Şimdi, elektrokimyasal empedans spektroskopisini açık hücre potansiyeline göre çalıştırın ve altın elektrotüzerindeki kendi kendine birleştirilmiş mono-tabakanın değişmediğini doğrulayın. Elektrokimyasal kinon redüksiyonunun başlangıç potansiyellerinde sitokrom BO3 tarafından katalatik ubinol oksidasyonu ve oksijen azaltımı gözlemlemek için saniyede 10 ve 100 milivolt tbmkif hızları ile döngüsel voltammogram çalıştırın. Daha önce olduğu gibi altın elektrot değiştirin ama mililitre proteoliposomes başına beş mikrogram kullanarak.

Tek enzim çalışmaları için sitokrom BO3 lipid oranını 0.1 ve 0.2% arasında daldırma yağı bir damla yerleştirin ve daha sonra ters floresan mikroskop 60 kez yağ hedefi elektrokimyasal hücre azaltmak. FDLL floresan için uygun filtreleri kullanarak elektrot yüzeyine odaklanın. Tek lipozomlar mikroskop hedefinin kırınım sınırında parlak noktalar olarak görünmelidir.

FDLL floresans bir görüntü alın. HTPS floresansının arka plandan açıkça görülebilen ve ayırt edilebilir olduğunu doğrulamak için mikroskoptaki HPTS floresan filtre setlerinden birine geçin. Durum böyle değilse ışık yoğunluğunu artırın.

İki HTPS filtre kümesini değiştirerek zamanlanmış görüntü edinimi gerçekleştirmek için mikroskop yazılımını programla. Bunu yapmak için, bir saniye pozlama ayarlayın ve ardından menü uygulamalarına gidin. Ardından ND Kazanım'ı tanımlayın/çalıştırın ve iki HTPS kanalı seçin.

Görüntü edinmeler arasındaki gecikmeyi en az olarak ayarlayın. Bu denemede 0,3 saniye gecikme ve beş dakikalık toplam süre kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi görüntü edinimi sırasındaki potansiyeli değiştirmek için potansiyostat ayarlarını ayarlayın.

Şimdi, aynı anda mikroskop üzerinde zamanlanmış görüntü edinimi ve potansiyostat üzerinde potansiyel dizi elle aynı anda her iki ölçüm başlatarak çalıştırın. Burada gösterilen üç farklı kapsama elektrotlar emilen lipozomların floresan görüntüleri vardır. Lipozomiçeren boya, görüntülerde parlak noktalar olarak görülebilir.

Resmin orta kısmı arka plan floresan düzeyini ortaya çıkarmak için fotoğraf ağartılmış oldu. İki HTPS kanalındaki görüntüler, iki kanal arasındaki oranın bu deneyde kullanılan 7,4 pH'a karşılık geldiği süper bir durumdeğildir. Daha fazla sayıda lipozom FDLL kanalı ile görülebilir, hangi hiçbir HPTS kapsüllü lipozomların varlığını gösterir.

HPTS ve FDLL kanalları arasındaki fark daha yüksek kapsama larda daha belirgindir. Muhtemelen yüksek lipozom kapsama, lipozomlar patlama veya yüzeyde sigorta olasılığı daha yüksektir çünkü. Burada, iki HTPS kanalında lipozom floresan değişimi, denemenin 300 saniyesi boyunca ilgili alanın 3Boyutlu yüzey çizimi olarak gösterilir.

İndirgeme potansiyeli 60 saniye ile 180 saniye arasında uygulandı. İki HPTS kanalının zamana göre hacim metrik yoğunluk oranının karşılık gelen çizimi gösterilir. Burada gösterilen sitokrom BO3 içeriği % 1.3 olduğunda tek bir görüntü içinde tüm vezikül pH değişikliklerinin ortancaları 0.1 ve 0.3 volt arasında bir potansiyel uygulandığında pH artışı açıkça görülebilir.

Sitokrom BO3 içeriği %0,1'lik çok daha düşük bir değer olduğunda, ortanca eğriler boş lipozomlardan neredeyse ayırt edilemez hale gelir. Artıklar lipozomların protonlara geçirgenliğini artırabileceğinden, sürfaktanların lipozom dispanserlerden tamamen çıkarılmasını sağlamak önemlidir. Bu yöntemler bize genellikle kullanılan suda çözünen kinon analogları aksine doğal lipophilic quinone substrat belirli sorular sormak için izin verir.

Dahası, tek enzim deneyleri, proteinin protonların serbestçe geriye doğru aktığı bir proton kanalı olarak hareket ettiği daha önce bilinmeyen bir sızıntı durumunu belirletmis.