Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde

Plazma hücreleri, anatomik yerlerde, özellikle de insanda tam biyolojik karakterizasyonu bozan 30 farklılaşma evresi olan nadir hücrelerdir. In vitro B2 plazma hücre farklılaşma modelimiz, in vivo in differentorganlarda oluşan sıralı hücre farklılaşmasını ve olgunlaşmasını yeniden üretir. Bu in vitro model, in vivo saptanabilen farklı B2 plazma hücre aşamalarının eşgüdümlü transkripsiyonel değişikliklerini ve fenotipini özetler.

Ayrıca plazma hücresi farklılaşması ile ilgili keşif verilerinden en önemli bilgileri analiz etmek için açık erişimli biyoinformatik araçlar inşa ettik. Prosedürü gösteren Hugues de Boussac, laboratuvarımdan bir doktora sonrası. Başlamak için, bellek B hücre arınması için sağlıklı gönüllülerden periferik kan hücreleri elde.

RPMI 1640 orta 24,5 mililitre ile kan seyreltin 7.5 mililitre. Daha sonra, steril 50 mililitrelik konik tüpe 12,5 mililitre oda sıcaklığında yoğunluk degradesi ekleyin. Yoğunluk degradesini seyreltilmiş kanın 32 mililitrelik kısmıyla hafifçe üst üst etektin, iki fazın karışmasını en aza indirgediğinden emin olun.

20 dakika boyunca 500 kat yer çekiminde fren kapalı. Seyreltilmiş plazma ve yoğunluk gradyan arabiriminden periferik kan mononükleer hücreleri toplayın. Hücreleri steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hank'in Dengeli Tuz Çözümü ile tüpü 45 mililitreye kadar doldurun.

5 dakika boyunca 500 kat daha fazla yer çekiminde santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve pelet tutun. Sonra, RPMI 45 mililitre ekleyin 1640 orta, ile birlikte 10%FCS.

5 dakika boyunca 500 kat daha fazla yer çekiminde santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve pelet tutun. PBS 30 mililitre ekleyin, 2% FCS ile desteklenmektedir.

Bir hedef hücre için dört boncuk ekleyerek CD2 pozitif hücreleri kaldırmak için anti-CD manyetik boncuklar kullanın. 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. Hücre ayırma uygulaması için bir mıknatıs kullanarak, boncuk bağlı hücreleri bağlanmamış hücrelerden ayırın.

Bağlanmamış hücreleri toplayın ve dört santigrat derecede on beş dakika boyunca anti-CD19 APC ve anti-CD27 PE antikorları ile kuluçkaya yatırın. %10 keçi serumu içeren PBS'de hücreleri iki kez yıkayın. Daha sonra, bellek B hücrelerini %95 saflıkta arındırmak için hücre ayırıcısını kullanın.

Bundan sonra, bellek B hücre aktivasyonu için çözünür CD40 ligand ve anti-polihistidin monoklonal antikor ekleyin. Purified memory B hücrelerini interlökin-2, interlökin-10 ve interlökin-15 ile dört gün boyunca altı kuyulu kültür plakalarında plakalayın. Gen ekspresyonu profilleme için, cd38-negatif CD20-negatif preplasmablasts dördüncü gün arındırmak için bir hücre ayırıcı kullanın.

Dördüncü gün, hücreleri sayın ve her kuyuya iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyerek mililitre başına 250,000 hücre yoğunluğunda 12 kuyulu kültür plakalarına yerleştirin. Farklılaşmayı teşvik etmek için, CpG oligonükleotidleri ve çözünür CD40 ligand'ı çıkarın ve interlökin-2, interlökin-6, interlökin-10 ve interlökin-15 dahil olmak üzere yeni bir sitokin kokteyli içeren yeni kültür ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede üç gün boyunca hücreleri kültür.

Gen ekspresyonu profilleme için, yedinci gün CD38-pozitif, CD20-negatif plazmablastları arındırmak için bir hücre ayırıcıkullanın. Yedinci günde hücreleri say. Her kuyuya iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri 500,000 hücrelik bir hücre yoğunluğuna yerleştirin.

Plazmablastları interlökin-6, interlökin-15 ve interferon-alfa içeren taze kültür ortamını kullanarak 37 santigrat derecede üç gün boyunca erken plazma hücrelerine ayırın. Gen ekspresyonu profilleme için, 10. İlk olarak, kültür stromal hücreleri kültür ortamı ile beş gün boyunca.

Stromal hücre koşullu orta elde etmek ve kullanıma hazır olana kadar dondurmak için stromal hücre kültürünü süpernatant filtrelemek için 0.2-mikrolitre filtre kullanın. Sonra, kültür 12-iyi kültür plakaları erken plazma hücreleri, interlökin-6 ve NISAN ile daha önce elde edilen stromal hücre orta kullanarak 500, 000 hücre başına bir hücre yoğunluğu, her kuyuya hücre süspansiyon iki mililitre ekleyerek. 37 santigrat derecede kuluçka, stromal hücre klimalı orta her hafta yenileniyor.

Daha sonra, akış sitometri sıralanmış plazma hücrelerinden immünglobulin salgısını ölçün. Kültür plazma hücreleri 24 saat boyunca mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda ve kültür supernatant hasat. Bir ELISA kiti kullanarak, immünglobulin G ölçmek, ve immünglobulin A.First, GenomicScape açık erişim biyoinformatik web aracı başlatın.

Gözatma veri menüsünde, plazma hücrelerine insan B hücreleri adlı veri kümesini seçin. Analiz Araçlarında İfade/Ko-İfade Raporu aracı kullanılarak benzersiz bir genin veya gen listesinin gen ekspresyonu profilinin görselleştirilmesi mevcuttur. Ardından, SAM aracını yüklemek için Çözümleme Araçları webSAM'ı seçin.

Plazma hücreleri veri seti için insan B hücrelerini seçin ve karşılaştırmak için örnek grubunu seçin. İlgi çekici filtreleme seçeneklerini uygulamak için kullanılabilen farklı filtreleri kullanın. Gen ekspresyonu profillerini SAM aracıyla karşılaştırmak için, kat değişimi, permütasyon sayısı, yanlış bulma hızı ve karşılaştırma türü gibi filtreleme seçeneklerini değiştirin.

Yazılım analizi hesaplamak ve farklı seçilen gruplar arasında ifade genleri sağlayacaktır. Bu çalışmada normal plazma hücre farklılaşmasında epigenetik faktörlerin ekspresyon değişiklikleri araştırılmıştır. Çok sınıflı SAM analizini kullanarak, 71 genin bellek B hücreleri, preplasmablastlar, plazmablastlar, erken plazma hücreleri ve kemik iliği plazma hücreleri arasında anlamlı olarak farklı olarak ifade ettiği görülür ve %5'in altında yanlış bir keşif hızına sahip olan bellek B hücre evresi histone asetiltransferazların %39.13'ü, histoneli metillerin %30.43'ü dahil olmak üzere 23 epigenetik oyuncu geninaşırı ile karakterizedir. Histone demethylazların %21.74'ü, metil bağlayıcı proteinlerin %4.35'i ve histon deasetilazlarının %4.35'i.

14 epigenetik oyuncu geni preplasmablast evresinde histone metitransferazların %50'si, DNA metiltransferazlarının %14.28'i, histon deasetilazlarının %21.43'ü, histon demetilazlarının %7.14'ü ve histone asetiltransferazların %17.14'ü olmak üzere anlamlı olarak aşırı ifade edilir. Bu prosedürütaki b2 plazma hücre farklılaşması sırasında kromatin yapısı ve mimarisindeki değişiklikleri tanımlamak ve anlamak için çeşitli analizler yapılabilir. Bu in vitro diferansiyasyon modeli, b2 plazma hücre farklılaşması sırasında hem bu modellemede yer alan yolları hem de aşağı transkripsiyonel etkilerini ortaya çıkarmak için bu moleküler analizi tamamlamak için yeterli hücre oluşturmayı sağlayacaktır.

Bu araştırmadan elde edilen bu bilgi, daha iyi prognoz ve geliştirilmiş tedavi stratejilerinin kritik derecede gerekli olduğu multipl miyelom, kesin bir tedavi olmaksızın bir kanser gibi plazma hücre bozuklukları için tanı salsal ve tedavi stratejileri hakkında bilgi verebilir ve öğretebilir. B2 plazma hücre farklılaşması sırasında kromatini etkileyen epigenetik remodeling yapısal ve mimari değişikliklerin karakterizasyonu ve anlaşılması özellikle ilgi çekici olacaktır. Bu gen sıralaması kullanılarak yapılabilir, ERRBS, ATAC sıralama, IC, ve RNA sıralama.

Bellek B hücre arınması için kullanılan sağlıklı donör kanına bağlı olarak aktive B hücreleri, preplasmablastlar, plazmablastlar ve plazma hücrelerinin yüzdesinde Orta derecede bir heterojenlik görülebilir.