Name: Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Öğrenin, insan dışı primat kemik iliğinden CD34+ hücre izolasyonu ve lentiviral vektörlerle gen modifikasyonu yöntemini. Bu protokol gen tedavisi araştırmaları için güvenli ve verimli bir hazırlık sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Helen Crawford bu el yazması, grafik tasarım için Jim Woolace ve Veronica Nelson ve Devikha protokol gelişiminde katıldığınız için Chandrasekaran hazırlamak için teşekkür ederiz. Bu iletişim kuralı gelişimi NIH Ulusal alerji Enstitüsü ve bulaşıcı hastalıklar (R01 AI135953 ve AI138329 H.P.K. için) ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ve U19 gelen hibe tarafından desteklenmiştir HL129902 H.P.K. için), NIH P51 OD010425 yanı sıra ve kısmen NIH/ncı Kanser Merkezi destek hibe P30 CA015704 aracılığıyla. H.P.K. olduğunu Markey moleküler tıp araştırmacı ve alınan destek Jose Carreras/e Donnall Thomas donatılmış sandalye açılış alıcı olarak kanser araştırmaları ve Fred Hutch donatılmış sandalye için hücre ve gen tedavisi için.

<ol><li>Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+hematopoietic+stem+cell+population+for+rapid+multilineage+engraftment+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates.</a> Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. 333 (6039), 218-221 (2011).</li>
<li>Hoggatt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mobilization+reveals+a+highly+engraftable+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell.</a> Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).</li>
<li>Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+promising+nonmyeloablative+conditioning+regimens+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates.</a> Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+transplantation+model+to+evaluate+hematopoietic+stem+cell+gene+editing+strategies+for+beta-hemoglobinopathies.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy.</a> Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+transplantation+on+peripheral+and+tissue-associated+viral+reservoirs%3A+Implications+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy.</a> PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).</li>
<li>Zhen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+function+of+hematopoietic+stem+cell-derived+chimeric+antigen+receptor+T+cells+in+a+nonhuman+primate+model+of+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS.</a> PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753(2017).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit-and-run+programming+of+therapeutic+cytoreagents+using+mRNA+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers.</a> Nature Communications. 8 (1), 389(2017).</li>
<li>Burtner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+a+foamy+virus+vector+to+correct+canine+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1.</a> Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).</li>
<li>Evans, D. T., Silvestri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhuman+primate+models+in+AIDS+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Nonhuman primate models in AIDS research.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).</li>
<li>Taraseviciute, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li>
<li>McGary, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTLA-4%28%2B%29PD-1%28-%29+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+critically+contribute+to+viral+persistence+in+antiretroviral+therapy-suppressed%2C+SIV-infected+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques.</a> Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).</li>
<li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).</li>
<li>Zonari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ex+vivo+engineering+and+expansion+of+highly+purified+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+populations+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+expansion+of+long-term+engrafting+marrow+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+multilineage+engraftment+of+autologous+genome-edited+hematopoietic+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates.</a> Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+polyclonal+engraftment+of+Cal-1+gene-modified+cells+and+in+vivo+selection+after+SHIV+infection+in+a+nonhuman+primate+model+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007(2016).</li>
<li>Thompson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+in+patients+with+transfusion-dependent+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).</li>
<li>Eichler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem-cell+gene+therapy+for+cerebral+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).</li>
<li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enrichment+of+gene-modified+primary+T+cells+via+CCR5-targeted+integration+of+mutant+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Masiuk, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+gene+therapy+efficiency+through+the+enrichment+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).</li>
<li>Trobridge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pigtailed+macaque+hematopoietic+repopulating+cells+with+HIV-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors.</a> Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).</li>
<li>Beard, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+MGMT-mediated+selection+of+long-term+repopulating+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).</li>
<li>Horn, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+gene+transfer+to+canine+repopulating+cells+using+an+overnight+transduction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol.</a> Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).</li>
<li>Adair, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+closed+system+manufacturing+of+lentivirus+gene-modified+haematopoietic+stem+cells+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy.</a> Nature Communications. 7, 13173(2016).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Kiem, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gene+transfer+into+baboon+marrow+repopulating+cells+using+recombinant+human+fibronectin+fragment+CH-296+in+combination+with+interleukin-6%2C+stem+cell+factor%2C+FLT-3+ligand%2C+and+megakaryocyte+growth+and+development+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor.</a> Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).</li>
<li>Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chronic+restraint+of+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).</li>
<li>Noser, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine+increases+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector+transduction+of+primary+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells.</a> Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).</li>
<li>Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+human+hematopoietic+repopulating+cells+with+a+chimeric+HIV1-based+vector+including+SIV+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid.</a> Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).</li>
<li>Goerner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+granulocyte+colony-stimulating+factor+during+retroviral+transduction+on+fibronectin+fragment+CH-296+enhances+gene+transfer+into+hematopoietic+repopulating+cells+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs.</a> Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).</li>
<li>Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+fibronectin+maintains+regenerative+capacity+during+ex+vivo+culture+and+transduction+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+enhances+human+cord+blood+stem+cell+xenotransplants+and+shows+long-term+safety+in+preclinical+nonhuman+primate+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).</li>
<li>Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+immunodeficiency+through+HSC+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treating immunodeficiency through HSC gene therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).</li>
<li>Humbert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immune+reconstitution+of+SCID-X1+canines+after+G-CSF%2FAMD3100+mobilization+and+in+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy.</a> Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

LV vektör Mühendisliği gen-hücre tipleri CD34 gibi değiştirmek için en iyi karakterize yöntemdir+ HSPCs, sonraki nakli içinde vivo için. Burada açıklanan protokol vivo uzun vadeli kalıcı gen-modified HSPCs sayısını en üst düzeye çıkarmak ve klinik faydaları hastalara çeşitli malign, bulaşıcı ve genetik hastalıklar ile sağlamak için tasarlanmıştır. Gen-düzenleme stratejileri son on yılda ortaya çıkmıştır, LV-modified hücreleri en iyi olmakla birlikte, tüp bebek, hayvan modelleri ve hasta1</sup...

Kök hücre gen terapisi insan patolojiler geniş bir yelpazede çözmek için güçlü bir araçtır. HSPC gen tedavisi hastaların, bu hücreler toplama i) göreli kolaylığı II) ile ilgili hücre yüzey fenotipleri ve ex vivo kültür parametreler kullanılabilir ve alan olarak genişleten bilgi zenginliği nedeniyle özellikle çekici bir yaklaşımdır, Çünkü III) gen değişikliği stratejilerinin ilgi çeşitli hastalıklar için özel olarak tasarlanmış bir artan toolbox ile bilim adamları sunar. Aktif HSPC gen terapisi yaklaşımlardan temel bilim HSPC biyoloji, gen-modified HSPCs preklinik içinde vivo modellerinde engraftment ve ilgili hasta nüfus uygulamaya dahil olmak üzere çoklu açıları araştırıyoruz. Biz ve diğer hücre yüzey fenotip işlevsel olarak farklı HSPC alt kümeleri1,2,3, seferberlik ve HSPC verim ve en aza indirirken engraftment en üst düzeye çıkarmak Klima rejimleri nitelendirmiştir toksisite4,5ve Gen değiştirme ve bir geniş yelpazede malign, genetik ve bulaşıcı hastalıklar6,7,8, özel gen düzenleme stratejileri 9,10. İşlev ve engraftment HSPCs gen-modified, küçük ve büyük-hayvan - modelleri, fareler, köpekler ve NHPs de dahil olmak üzere bir dizi olarak değerlendirilebilir. Özellikle, çünkü birçok reaktifler, örneğin, antikorlar HSPC hücre yüzey proteinleri CD34 ve CD90, gibi belirli insan ve NHP hücreler birbirinin yerine kullanılabilir NHP modelleri avantajlı. Ayrıca, fare aksine, NHPs gibi büyük hayvanlar gen değişikliği ölçeğini daha yakın bir yaklaşım klinik etkinlik için gerekli izin. Son olarak, NHPs HIV-1 enfeksiyonu11 gibi insan patolojiler modellenmesi için altın standart ve aday antikanser ve anti-HIV immunotherapies12,13için gelişmekte olan bir modeli sistemi vardır.
Bu iletişim kuralı için arındırıcı, genetik değiştirerek ve NHP HSPC infüzyon ürünleri hazırlama yöntemleri anahat amacıdır. Bu iletişim kuralının kapsamı dışında biz daha önce bu ürünler otolog NHP konaklarda engraft göstermiştir rağmen tüm hematopoetik soy ortaya çıkmasına ve hastalık modelleri1geniş bir terapötik etkinlik sağlar. Ayrıca engrafting HSPCs clonality ile karakterize ve kinetik, ticareti ve bireysel HSPCs ve onların Döl, aşağıdaki otolog transplantasyon1,14fenotip izlemek için bir platform inşa. Burada sunulan yöntemleri aşağıdaki hedefleri ile geliştirilmiştir: i) son derece saf HSPCs ve uzun vadeli engrafting HSC alt kümeleri, II) sırasında ilkel HSCs ex vivo kültürü korumak için ve verimli bir şekilde her iki toplu HSPCs gen değiştirmek III) için izole etmek için ya da uzun vadeli engrafting HSC alt kümeleri. Biz yanı sıra floresans aktif hücre (phenotypically/işlevsel ayrı HSPC nüfus, birçok gruplar2,15, yöntemleri ile tutarlı yalıtmak için FACS), sıralama manyetik destekli cep-sıralama (Mac), istihdam 16. İlkel HSCs kültür bakımından (yani, bu hücreler farklılaşma içine tam olarak çıkmasına taahhüt ataları minimize lenfoid ve myeloid alt kümeleri ayırt) burada açıklanan protokol önemli bir yönüdür. Daha önce HSPCs bir ilkel fenotip17,18, burada, koruyarak genişletmek için yaklaşımlar nitelendirmiştir rağmen bir çok az (48 h) HSCs korumak üzerinde odaklanır ve ex vivo kültür tanımlanan protokol açıklar.
HSPCs ve HSC verimli değişiklik alt kümeleri bu iletişim merkezi bir hedeftir. Biz bildirdin çeşitli yaklaşımlar arasında iki farkla en içinde incelenen klinik denemeler vardır: LV-aracılı gen değişikliği ve nükleaz aracılı gen1,6,19düzenleme. Gen-düzenleme stratejileri bir nükleaz platformlar bir dizi özellikle ilgi hedeflenen bir gen değiştirmek için kullanın, örneğin, C-C kemokin reseptör tip 5 (CCR5) HIV enfeksiyonu7,19 veya Bcl11A tedavisi için tedavi için Hemoglobinopati6/. Burada, hangi transgenik yükleri entegre semirandomly genom1,8,20LV-aracılı gen değişikliği ele. LV yaklaşımları önemli bir avantajı yeteneği (en fazla 8-9 kilobases) genetik malzeme büyük miktarlarda sunmak için var. Gen-düzenleme stratejileri yalnızca belirtilen bir odağı entegre ilgi bir transgene hedeflemek için donör Homolog rekombinasyon (HDR) tarafından geliştirilmekte olan rağmen bu yöntemler geliştirme tüp bebek ve küçük hayvan modellerinde daha fazla gerektirir. Buna ek olarak, LV vektörel çizimler NHPs ve hastaların21,22yaygın olarak kullanılmıştır. Önemlisi, hangi kullanır BM başlangıç HSPC kaynağı olarak kullanıma hazır, burada açıklanan protokol kolayca ve geniş, örneğin, PBSCs yalıtmak için adapte edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi her iki tür için tabidir reaktifler kullanmak için NHPs ve insan arasındaki genetik benzerlik yüksek derecede avantajlarından yararlanın. Son olarak, bu yaklaşım hematopoetik diğer alt kümeleri, yani T hücreleri12,23,24değiştirmek için adapte; etkili T hücreli immünoterapi yaklaşımlar gelişiyle ağır bu protokol için kullanılan aynı LV platformda güvendi. Bu yöntemlerin herhangi bir araştırmacı HSPC biyoloji veya LV-aracılı gen değişikliği ilgilenen uygundur. Örneğin, burada sunulan HSPC arıtma Protokolü HSC zenginleştirilmiş roman alt kümeleri tanımlamak için kullanılan1,15,25daha önce açıklandığı gibi. Aynı şekilde, burada sunulan yöntemleri benzer şekilde olabilir LV iletim uygulanan ve daha çok sayıda diğer hücre tipleri ve deneysel soruları, tüp bebek ve içinde vivo modellerinde her ikisi tarafından geliştirilmiştir.
Özetle, biz yöntemleri yalıtmak ve genetik olarak NHP HSPCs değiştirmek için mevcut. Bu yöntemler diğer türler ve HSPCs ile ilgili diğer kaynakları için kolayca adapte edilebilir. İyice incelenmesi bu iletişim kuralı çok sayıda insan hastalıkları için etkili tedaviler modellenmesi büyük söz gösterir.

<table><tbody><tr><td>Stemspam SFEM II ("HSPC") Medya</td><td>StemCell</td><td>09655</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100</td><td></td></tr><tr><td>% 100 Etanol</td><td>Decon</td><td>laboratuvarları M18027161M</td><td></td></tr><tr><td>Siklosporin</td><td>Sigma</td><td>30024-25MG</td><td></td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Edilmiş Fetal Sığır</td><td>Serumu Sigma Aldrich</td><td>PS-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>CH-296 / RetroNektin (2.5 mL, 1 & mikro; g/&mikro; L)</td><td>TaKaRA</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A7906-100g</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H9897</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare IgM manyetik boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-047-301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan Kök Hücre Faktörü (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan Trombopoietin (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FMS benzeri tirozin kinaz 3 (FLT-3)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Sigma</td><td>P-4505</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Boru</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Koloni Jeli 1402</td><td>ReachBio</td><td>1402</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Ayırıcılar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS L25 Sütunları</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>10 mM PGE2</td><td>Cayman Chemical</td><td>14753-5mg</td><td></td></tr><tr><td>TC ile muamele edilmiş T-75 şişeleri</td><td>Bioexpress</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>TC ile muamele edilmemiş T-75 şişeleri</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13680-57</td><td></td></tr><tr><td>20 mL şırıngalar</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>16.5 G iğneler</td><td>BD Hassas</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Ucu Kapağı</td><td>BD Biosciences</td><td>305819</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Çözeltisi</td><td>Merkez üssü</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>8 tüplü şerit kapaklı PCR Tüpleri</td><td>ABD bilimsel</td><td>1402-2708</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Thermocycler</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Ön Ayırma filtreleri</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Süzgeç, hücre; BD Şahin; Steril; Naylon ağ; Kafes boyutu: 70um; Renk: beyaz; 50/CS</td><td>fisher scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Ultracomp ebeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tüp Döndürücü</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Luer-Lock Şırınga</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm hücre kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm hücre kültürü kabı</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>430196 150 mm x 25 mm hücre kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>TC ile muamele edilmemiş şişeler</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNA ekstraksiyonu</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-İnsan CD90 (Thy1) Klon: 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Fare Anti-İnsan CD34 Klon: 563</td><td>BD ufuk</td><td>562449</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 Fare Anti-İnsan CD45RA Klonu: 5H9</td><td>BD Pharmingen</td><td>561212</td><td></td></tr><tr><td>V450 Fare Anti-NHP CD45 Klonu: d058-1283</td><td>BD Biosciences</td><td>561291</td><td></td></tr><tr><td>Otolog Serum</td><td>Otolog konakçıdan toplanmış ve CD34 + HSPC'lerin mobilizasyonu ve toplanmasından önce kriyoprezervasyon</td><td>Yok</td><td>Sakal, M.Ö. ve ark. İnsan olmayan primatlarda uzun süreli yeniden çoğalan kök hücrelerin verimli ve stabil MGMT aracılı seçimi. Klinik Araştırma Dergisi. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Virüse Bağlı Medya (VCM)</td><td>Kiem Lab, FHCRC Hematolojide Mükemmeliyet Kooperatif Merkezi (CCEH)</td><td>N/A</td><td>Beard, B. C. et al. İnsan olmayan primatlarda uzun süreli yeniden çoğalan kök hücrelerin verimli ve stabil MGMT aracılı seçimi. Klinik Araştırma Dergisi. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Anti-CD34 antikoru, Klon 12.8</td><td>Kiem Lab</td><td>N/A</td><td>Sakal, B. C. ve ark. İnsan olmayan primatlarda uzun süreli yeniden çoğalan kök hücrelerin verimli ve stabil MGMT aracılı seçimi. Klinik Araştırma Dergisi. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Lenti F astarı: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. Cal-1 geni modifiye edilmiş hücrelerin çok soylu poliklonal aşılanması ve insan dışı bir AIDS primat modelinde SHIV enfeksiyonundan sonra in vivo seçim. Mol Ther Yöntemleri, Klinik Dev. 3, 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Lenti R astarı: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. ve ark. İnsan dışı bir AIDS primat modelinde Cal-1 geni modifiye edilmiş hücrelerin çok soylu poliklonal aşılanması ve in vivo seleksiyonu SHIV enfeksiyonu sonrası. Mol Ther Yöntemleri, Klinik Dev. 3, 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Aktin F astarı: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. ve ark. İnsan olmayan bir AIDS primat modelinde Cal-1 geni modifiye edilmiş hücrelerin çok soylu poliklonal aşılanması ve in vivo seleksiyonu SHIV enfeksiyonundan sonra. Mol Ther Yöntemleri, Klinik Dev. 3, 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Aktin R astarı: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. ve ark. İnsan olmayan bir AIDS primat modelinde Cal-1 geni modifiye edilmiş hücrelerin çok soylu poliklonal aşılanması ve SHIV enfeksiyonundan sonra in vivo seçim. Mol Ther Yöntemleri, Klinik Dev. 3, 16007, (2016).</td></tr></tbody></table>

hazırlık ve nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) transplantasyonu lösemi için bir temel taşı tedavisi ve diğer kanserler için neredeyse yarım asır oldu, insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) enfeksiyon tek bilinen tedavisi altında yatan ve büyük söz gösterir beta talasemi gibi genetik hastalıkların tedavisinde. Bizim Grup modeli HSPC gen terapisi insan dışı primatlar (NHPs), bir iletişim kuralına bilim adamları birçok aynı reaktifler ve klinikte uygulanan teknikleri optimize etmek izin geliştirmiştir. Burada, CD34 arıtma yöntemleri tarif+ HSPCs ve uzun vadeli kalıcı hematopoetik kök hücre (HSC) alt kümeleri astarlanmalıdır kemik iliği (BM) üzerinden. Aynı teknikleri diğer HSPC kaynakları (örneğin, seferber periferik kan kök hücreleri [PBSCs]) arıtma için istihdam edilebilir. Özetlenen hangi hücrelerin saf, kültürlü, lentivirus (LV) ile modifiye ve otolog ana geri içine infüzyon için hazırlanan bir 2 gün iletişim kuralıdır. Başarının anahtar veriler dahil CD34 saflığı+ HSPC nüfus, saf HSPCs morfolojik farklı koloniler halinde semisolid medya ve en önemlisi, gen değişiklik verimliliği formu yeteneği. Anahtar HSPC gen tedavisi için tüm hematopoietik hücre tipleri için ortaya çıkmasına uzun ömürlü hücre bir kaynak sağlama yeteneği avantajdır. Bu nedenle, bu yöntemler modeli tedavilere kanser, genetik hastalıklar ve bulaşıcı hastalıklar için kullanılmıştır. Her durumda, kırmızı kan hücreleri, T hücreleri, B hücreleri ve/veya miyeloid alt kümeleri dahil olmak üzere farklı HSPC Döl fonksiyonu güçlendirerek terapötik etkinlik kurulur. İzole etmek için yöntemleri değiştirmek ve HSPC hazırlamak ürünleri doğrudan uygulanabilir ve çevrilebilir insan hasta birden çok hastalık.

Yukarıda açıklanan protokol yalıtmak ve gen NHP CD34 değiştirmek için tasarlanmış+ HSPCs, daha sonra geri otolog ev sahibi (resim 1 ve Şekil 2) infüzyon. Bu protokol sonrası, biz genellikle ilâ 8 x 109 dan helezon makak astarlanmalıdır BM ile toplam WBCs alın ve, bazen, bu tutardan rhesus makak çift. Her iki tür, CD34 sayısı+ biz zenginleştirmek HSPCs toplam WBC sayısı (Şekil ...

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Umut verici ve yeni gen terapisi yaklaşımlarının etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için, gen modifiye edilmiş hücrelerin invivo modellerinde kapsamlı bir şekilde test edilmesi çok önemlidir. İlgili hücre yüzeyi belirteçlerinin reaktiflerin çapraz reaktivitesinin korunması ve klinik parametreleri yakından taklit etmek için insan dışı primat modelleri boyunca hastalara uygulanan aynı destekleyici tedavileri uygulayabilme yeteneği. Prosedürü benimle birlikte gösteren Şey ani Perez, Dr.Hans-Peter Kiem'in laboratuvarından araştırma teknisyeni.50 mililitre konik tüpler içine sağlıklı bir insan dışı primat donör izole kemik iliği 10 ila 12 mililitre aliquots ekleyerek başlayın. Tüpün hacmini hemolitik tamponla 50 mililitreye kadar getirin ve hücreleri oda sıcaklığında yedi dakikaya kadar kuluçkaya yatırın. Santrifüj ile hücre enkaz çıkarın ve supernatant son iki ila beş mililitre hariç tüm aspire.Tüpü hareket ettirerek artık süpernatant hacmindeki peleti yeniden askıya alın ve kemik iliği süspansiyonlarını 70 mikrometrelik gözenek hücresi süzgeci kullanarak yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hacmi 50 mililitreye çıkarmak için taze hemolitik tampon ekleyin ve santrifüj ile toplanmadan önce hücreleri oda sıcaklığında beş dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant aspire ve maksimum tampon 10 mililitre hücreleri resuspend.Başka bir 70 mikrometre gözenek süzgeci ile hücre süspansiyon filtreleme den önce, taze tampon 40 mililitre ile tüp durulayın ve hücre süspansiyon ile yıkama havuzu. STANDART manyetik destekli hücre sıralama protokollerine göre CD34 pozitif hücreler için zenginleştirdikten sonra, boncuk izole hücreleri 50 mililitreye kadar taze maksimum tamponda yıkayın ve HSPC ortamındaki peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, hücrelerin 10 ila 20 mililitresini havalandırmalı dokuya yerleştirin ve t75 şişelerini bir gecede kültürleri için 37 derece ve %5 karbondioksit inkübatöründe tedavi edin.Kemik iliği hücre örneklerinin zenginleştirme öncesi ve sonrası saflığını değerlendirmek için uygun plots ve nüfus hiyerarşisi tüm olaylar dağılım, CD34 pozitif, hematopoetik kök hücreler, multipotent an-eritoid miyeloid ataları ve lenfo miyeloid ataları için tüm kapıları gösteren bir akış sitometri protokolü oluşturmak. Daha sonra, ileri ve yan dağılım parametreleri için voltajları ayarlamak için lekesiz, ön zenginleştirme, beyaz kan hücresi örneği çalıştırın ve komşu kanallar arasındaki telafiyi ayarlamak için tek lekeli kompansasyon boncukları takip eden tüm floresan kanalları. Cd34 zenginleştirme verimliliğini belgelemek için kalan tüm lekesiz ve lekeli numuneleri ayarlanmış ve telafi edilmiş protokolle çalıştırın.Tüm tazminatlar ayarlandığında, CD34 alt kümelerinin tür saflaştırması için hücre ayırıcısını koloni oluşturan hücre tahlillerine yapılandırır ve lekeli CD34 zenginleştirilmiş örnek tüpünü sitometreye yükleyin. Sonra 2000-3000 olayları kaydedin ve sıra kapılarını sinyal gücüne ve hedef popülasyonlara uyacak şekilde ayarlayın. Kurulum tamamlandığında, akış hızını saniyede 500 ila 1000 hücreye ayarlayan ve dağılımdan 800 ila 1200 hücre yi, CD34 pozitif, hematopoetik kök hücre, çok güçlü an-eritoid miyeloid atası ve lenfo miyeloid atanın kapılarını hücre başına 3,6 mililitre lik ayrı tüpler içeren ayrı tüplere ayırarak elde edin.Toplama tüpleri sıralama girdap sonunda, ve üç steril 3,5 santimetre hücre süspansiyon bir mililitre eklemek, doku dışı kültür 37 santigrat derece onların 10-14 gün kuluçka için hücre nüfusu başına bireysel 15 santimetre petri kapları içinde ayarlanmış petri yemekleri tedavi. Ertesi sabah, her şişenin altındaki yapışık hücreleri steril HBSS ile hafifçe durulamak ve hasat edilen hücreleri santrifüj le toplamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6.Ve hücre kültürü kuluçka bir gecede kuluçka için 12 iyi plaka kaplı bir rekombinant fibronectin parçası bir kuyuda sahte kontrol için hücrelerin bir mililitre ekleyin. Sonra rekombinant fibronektin parçası kaplı T75 şişeleri içine kalan hücrelerin 10 mililitre aliquots ekleyin hücre kültürü kuluçka için 30 dakika kuluçka için kapaklar havalandırmalı. Kuluçka sırasında virüs şartlı orta örnekleri ve titre ve mililitre başına hücrelerin enfeksiyöz birimlerinin sayısına göre eklenecek virüs miktarını hesaplamak.Masayı kuvözden alın ve hücreleri 37 derece ve %5 karbondioksite geri döndürmeden önce her şişeye uygun miktarda virüs şartlı orta ekleyin. Ertesi sabah şişedeki hücreleri tek tek 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri yıkama başına 50 mililitreye kadar HBSS'de yıkayın ve artık virüsü ortadan kaldırmak için bu adımı üç kez tekrarlayın.Prostaglandin E2 ile desteklenen HSPC ortamlarında hücreleri iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra hücreleri yıkayın ve tüp başına% 2 otolog serum ile desteklenen HBSS 10 mililitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra 16,5 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 20 mililitrelik şırınga kullanarak hücre süspansiyonları aspire. Tüpün içini taze HBSS artı %2 otolog serumla yıkayın ve şırınganın içine aspire edin.Hücre çözeltisini otolog bir konakiçine infüzyonuna kadar buza yerleştirmeden önce şırıngayı iğne kapağıyla dikkatlice kaplayın. Transekte hücrelerin gen modifikasyon verimliliğini belirlemek için, plaka 1 x 10 6 ayrılmış sahte veya hSPC ortamının mililitre başına transdüklenen hücreler doku kültürü olmayan tedavi plakaları üzerine. İkinci, beş ve on iki transdüksiyon sonrası günde hücreleri hasat edin ve sayın.İkinci ve beşinci günlerde, taze HSPC ortamındaki hücrelerin %33'ünü mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6. İkinci, beş ve on iki gün, kantitatif gerçek zamanlı PCR için DNA ekstraksiyon tampon hücrelerinin% 33 dondurma, ve hematopoetik singeny henotypik bileşimi değerlendirmek için standart protokollere göre akış sitometri ile hücrelerin son% 33 analiz. Akış sitometrisi ile transgen ekspresyonunu ölçmek için üç ek yan dağılım vs ekleyin.transgen çizimleri;ve hematopoetik kök hücreler üzerinde ilk arsa kapı, çok güçlü an-eritro miyeloid ataları üzerinde ikinci arsa, ve lenfo miyeloid ataları üzerinde üçüncü arsa, tüm vs transgene. Sonra 2000-3000 olayları kaydedin ve sıra kapılarını sinyal gücüne ve hedef popülasyonlara uyacak şekilde ayarlayın.Bu protokolü kullanarak zenginleştirilmiş insan dışı primat CD34 pozitif HSPC sayısı genellikle giriş toplam beyaz kan hücresi sayısı ile orantılıdır. Daha önceki bulgular, toplam CD34 pozitif HSPC ürüngerçek uzun vadeli ve aşılama hematopoetik kök hücreleri olmayan hücreleri içerdiğini göstermiştir gibi, bu akış sitometri tabanlı ve koloni oluşturan hücre teknikleri güvenilir tanımlamak ve kararlı atajenlerden uzun vadeli hematopoetik kök hücreleri için zenginleştirilmiş alt kümeleri ayırt etmek için kullanılabilir. CD34 pozitif insan kök hücre zenginleştirilmiş hücreler verimli gen lentiviral vektörler kullanılarak değiştirilebilir.Vektörün entegre olmayan bir kopyasını taşıyan hücreler 12 günlük sıvı kültür analizi döneminde seyreltilirler, oysa genomdaki kolik entegre vektörler tüm sinalara aktarılır. Koloni oluşturan hücre tahlillerinde vektörün ifadesi ile doğrulanmış. Bu preklinik yöntem genetiği değiştirilmiş insan dışı primat hematopoetik kök ve gen tedavisi için progenitor hücrelerini izole etmek için kullanılabilir.Bu yöntem diğer türler, hematopoetik kök ve ata hücreleri, gen terapi araçları ve hastalıklar için kolayca adapte edilebilir. Bu iyice incelenmiş protokol çok sayıda insan hastalıkları için etkili tedavilerin modelleme için büyük umut vaat ediyor. İnsan olmayan primat dokuları ile çalışmanın kişisel koruyucu ekipmanlar da dahil olmak üzere gelişmiş güvenlik önlemleri gerektirdiğini unutmayın.

preparation-gene-modification-nonhuman-primate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Bu iletişim kuralı CD133 değiştirmek için güvenli ve verimli bir yordam gösterilmektedir+ hematopoietik kök hücre. Sunulan viral sigara, manyetik polyplex dayalı yaklaşım temel terapötik kök hücre etkileri de manyetik rezonans görüntüleme üzerinden yönetilen hücre ürün izleme gelince optimizasyonu için sağlayabilir.

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

Burada, biz eski tarif CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi vivo+ hücreleri göbek kordon kanı türetilmiş bir sitokin kokteyl ve VPA kombinasyonu ile tedavi. Bu yöntem eski ilkel HSCs vivo genişlemesi için de önemli bir ölçüde yol açar klinik veya laboratuvar uygulamaları.

EX Vivo insan göbek kordon kanı elde edilen CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi+ hücreleri kullanarak Valproik asit

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

B hücre tedavilerinin incelenmesi için CRISPR / Cas9 ve rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 6 kullanarak primer rhesus makak B hücrelerinin kültürlenmesi ve gen düzenlenmesi için bir yöntem sunuyoruz.

Primer Rhesus Macaque B Hücrelerinin Gen Düzenlemesi

Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Öğrenin, insan dışı primat kemik iliğinden CD34+ hücre izolasyonu ve lentiviral vektörlerle gen modifikasyonu yöntemini. Bu protokol gen tedavisi araştırmaları için güvenli ve verimli bir hazırlık sunar.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Daha fazla video keşfet