Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Umut verici ve yeni gen terapisi yaklaşımlarının etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için, gen modifiye edilmiş hücrelerin invivo modellerinde kapsamlı bir şekilde test edilmesi çok önemlidir. İlgili hücre yüzeyi belirteçlerinin reaktiflerin çapraz reaktivitesinin korunması ve klinik parametreleri yakından taklit etmek için insan dışı primat modelleri boyunca hastalara uygulanan aynı destekleyici tedavileri uygulayabilme yeteneği. Prosedürü benimle birlikte gösteren Şey ani Perez, Dr.Hans-Peter Kiem'in laboratuvarından araştırma teknisyeni.

50 mililitre konik tüpler içine sağlıklı bir insan dışı primat donör izole kemik iliği 10 ila 12 mililitre aliquots ekleyerek başlayın. Tüpün hacmini hemolitik tamponla 50 mililitreye kadar getirin ve hücreleri oda sıcaklığında yedi dakikaya kadar kuluçkaya yatırın. Santrifüj ile hücre enkaz çıkarın ve supernatant son iki ila beş mililitre hariç tüm aspire.

Tüpü hareket ettirerek artık süpernatant hacmindeki peleti yeniden askıya alın ve kemik iliği süspansiyonlarını 70 mikrometrelik gözenek hücresi süzgeci kullanarak yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hacmi 50 mililitreye çıkarmak için taze hemolitik tampon ekleyin ve santrifüj ile toplanmadan önce hücreleri oda sıcaklığında beş dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant aspire ve maksimum tampon 10 mililitre hücreleri resuspend.

Başka bir 70 mikrometre gözenek süzgeci ile hücre süspansiyon filtreleme den önce, taze tampon 40 mililitre ile tüp durulayın ve hücre süspansiyon ile yıkama havuzu. STANDART manyetik destekli hücre sıralama protokollerine göre CD34 pozitif hücreler için zenginleştirdikten sonra, boncuk izole hücreleri 50 mililitreye kadar taze maksimum tamponda yıkayın ve HSPC ortamındaki peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, hücrelerin 10 ila 20 mililitresini havalandırmalı dokuya yerleştirin ve t75 şişelerini bir gecede kültürleri için 37 derece ve %5 karbondioksit inkübatöründe tedavi edin.

Kemik iliği hücre örneklerinin zenginleştirme öncesi ve sonrası saflığını değerlendirmek için uygun plots ve nüfus hiyerarşisi tüm olaylar dağılım, CD34 pozitif, hematopoetik kök hücreler, multipotent an-eritoid miyeloid ataları ve lenfo miyeloid ataları için tüm kapıları gösteren bir akış sitometri protokolü oluşturmak. Daha sonra, ileri ve yan dağılım parametreleri için voltajları ayarlamak için lekesiz, ön zenginleştirme, beyaz kan hücresi örneği çalıştırın ve komşu kanallar arasındaki telafiyi ayarlamak için tek lekeli kompansasyon boncukları takip eden tüm floresan kanalları. Cd34 zenginleştirme verimliliğini belgelemek için kalan tüm lekesiz ve lekeli numuneleri ayarlanmış ve telafi edilmiş protokolle çalıştırın.

Tüm tazminatlar ayarlandığında, CD34 alt kümelerinin tür saflaştırması için hücre ayırıcısını koloni oluşturan hücre tahlillerine yapılandırır ve lekeli CD34 zenginleştirilmiş örnek tüpünü sitometreye yükleyin. Sonra 2000-3000 olayları kaydedin ve sıra kapılarını sinyal gücüne ve hedef popülasyonlara uyacak şekilde ayarlayın. Kurulum tamamlandığında, akış hızını saniyede 500 ila 1000 hücreye ayarlayan ve dağılımdan 800 ila 1200 hücre yi, CD34 pozitif, hematopoetik kök hücre, çok güçlü an-eritoid miyeloid atası ve lenfo miyeloid atanın kapılarını hücre başına 3,6 mililitre lik ayrı tüpler içeren ayrı tüplere ayırarak elde edin.

Toplama tüpleri sıralama girdap sonunda, ve üç steril 3,5 santimetre hücre süspansiyon bir mililitre eklemek, doku dışı kültür 37 santigrat derece onların 10-14 gün kuluçka için hücre nüfusu başına bireysel 15 santimetre petri kapları içinde ayarlanmış petri yemekleri tedavi. Ertesi sabah, her şişenin altındaki yapışık hücreleri steril HBSS ile hafifçe durulamak ve hasat edilen hücreleri santrifüj le toplamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6.

Ve hücre kültürü kuluçka bir gecede kuluçka için 12 iyi plaka kaplı bir rekombinant fibronectin parçası bir kuyuda sahte kontrol için hücrelerin bir mililitre ekleyin. Sonra rekombinant fibronektin parçası kaplı T75 şişeleri içine kalan hücrelerin 10 mililitre aliquots ekleyin hücre kültürü kuluçka için 30 dakika kuluçka için kapaklar havalandırmalı. Kuluçka sırasında virüs şartlı orta örnekleri ve titre ve mililitre başına hücrelerin enfeksiyöz birimlerinin sayısına göre eklenecek virüs miktarını hesaplamak.

Masayı kuvözden alın ve hücreleri 37 derece ve %5 karbondioksite geri döndürmeden önce her şişeye uygun miktarda virüs şartlı orta ekleyin. Ertesi sabah şişedeki hücreleri tek tek 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri yıkama başına 50 mililitreye kadar HBSS'de yıkayın ve artık virüsü ortadan kaldırmak için bu adımı üç kez tekrarlayın.

Prostaglandin E2 ile desteklenen HSPC ortamlarında hücreleri iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra hücreleri yıkayın ve tüp başına% 2 otolog serum ile desteklenen HBSS 10 mililitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra 16,5 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 20 mililitrelik şırınga kullanarak hücre süspansiyonları aspire. Tüpün içini taze HBSS artı %2 otolog serumla yıkayın ve şırınganın içine aspire edin.

Hücre çözeltisini otolog bir konakiçine infüzyonuna kadar buza yerleştirmeden önce şırıngayı iğne kapağıyla dikkatlice kaplayın. Transekte hücrelerin gen modifikasyon verimliliğini belirlemek için, plaka 1 x 10 6 ayrılmış sahte veya hSPC ortamının mililitre başına transdüklenen hücreler doku kültürü olmayan tedavi plakaları üzerine. İkinci, beş ve on iki transdüksiyon sonrası günde hücreleri hasat edin ve sayın.

İkinci ve beşinci günlerde, taze HSPC ortamındaki hücrelerin %33'ünü mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6. İkinci, beş ve on iki gün, kantitatif gerçek zamanlı PCR için DNA ekstraksiyon tampon hücrelerinin% 33 dondurma, ve hematopoetik singeny henotypik bileşimi değerlendirmek için standart protokollere göre akış sitometri ile hücrelerin son% 33 analiz. Akış sitometrisi ile transgen ekspresyonunu ölçmek için üç ek yan dağılım vs ekleyin.

transgen çizimleri;ve hematopoetik kök hücreler üzerinde ilk arsa kapı, çok güçlü an-eritro miyeloid ataları üzerinde ikinci arsa, ve lenfo miyeloid ataları üzerinde üçüncü arsa, tüm vs transgene. Sonra 2000-3000 olayları kaydedin ve sıra kapılarını sinyal gücüne ve hedef popülasyonlara uyacak şekilde ayarlayın.

Bu protokolü kullanarak zenginleştirilmiş insan dışı primat CD34 pozitif HSPC sayısı genellikle giriş toplam beyaz kan hücresi sayısı ile orantılıdır. Daha önceki bulgular, toplam CD34 pozitif HSPC ürüngerçek uzun vadeli ve aşılama hematopoetik kök hücreleri olmayan hücreleri içerdiğini göstermiştir gibi, bu akış sitometri tabanlı ve koloni oluşturan hücre teknikleri güvenilir tanımlamak ve kararlı atajenlerden uzun vadeli hematopoetik kök hücreleri için zenginleştirilmiş alt kümeleri ayırt etmek için kullanılabilir. CD34 pozitif insan kök hücre zenginleştirilmiş hücreler verimli gen lentiviral vektörler kullanılarak değiştirilebilir.

Vektörün entegre olmayan bir kopyasını taşıyan hücreler 12 günlük sıvı kültür analizi döneminde seyreltilirler, oysa genomdaki kolik entegre vektörler tüm sinalara aktarılır. Koloni oluşturan hücre tahlillerinde vektörün ifadesi ile doğrulanmış. Bu preklinik yöntem genetiği değiştirilmiş insan dışı primat hematopoetik kök ve gen tedavisi için progenitor hücrelerini izole etmek için kullanılabilir.

Bu yöntem diğer türler, hematopoetik kök ve ata hücreleri, gen terapi araçları ve hastalıklar için kolayca adapte edilebilir. Bu iyice incelenmiş protokol çok sayıda insan hastalıkları için etkili tedavilerin modelleme için büyük umut vaat ediyor. İnsan olmayan primat dokuları ile çalışmanın kişisel koruyucu ekipmanlar da dahil olmak üzere gelişmiş güvenlik önlemleri gerektirdiğini unutmayın.