Name: Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Keşfedin hücrelerin kardiyomiyojenik potansiyelini artırmak için elektromekanik stimülasyon yöntemini. Bu teknik eşzamanlı elektrik ve mekanik uyarı uygulayarak hücre olgunlaşmasını iyileştirir ve hücre terapisi ile ilaç taramalarında uygulama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar ICREC araştırma programı (IGTP, Badalona) ve elektronik ve Biyomedikal araçları grubu (UPC, Barcelona), özellikle Prof. J. niepyszny-Ferrer üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, yazarlar kabul kök hücre translasyonel Tıp Dergisi ve AlphaMed daha önce yayımlanan rakamlar (Llucià-Valldeperas, et al. uyarlaması izin vermek için basın 30). bu prototip geliştirme ve tasarım iletişim kuralının "gayri resmi" de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), "gayri resmi" de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen 7. Çerçeve Programı () RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) ve Fundacion para la Innovación y la Prospectiva tr Salud tr España (FIPSE; 06-00001396-15).

Bu çalışmada hasta örneklerinden insan kalp ATDPCs kullanır. Bunların kullanımı Yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve tüm hastalar onay verdi. Çalışma protokolü Helsinki Bildirgesi içinde özetlenen ilkelere uygun olur.
1. hazırlıkları
<ol><li>Otoklav iki cımbız, elektrik stimülasyonu için 12 platin PTFE elektrotlar ve 20 dk için 121 ° C'de biraz kağıt havlu.</li>
	<li>
12 PDMS ısmarlama yapıları (Şekil 1A) sterilize.
	<ol>
<li>15 dakika oda sıcaklığında 5 mL steril, distile su ile manyetik ajitasyon sahip her yapı yıkayın.</li>
		<li>5 min için oda sıcaklığında 1 x 5 mL % 70 etanol manyetik ajitasyon ile de ile yıkayın.</li>
		<li>Alkollü kalıntıları çıkarmak için yıkama, başına 10 dakika oda sıcaklığında 5 x 5 mL manyetik ajitasyon ile steril, distile su ile yıkayın.</li>
		<li>Akış kabine gecede içinde steril kağıt havlu üzerinde yapıları kuru.</li>
		<li>Onları kullanmak kadar steril 50 mL santrifüj tüplerde saklamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre (gün -1) tohum
<ol><li>Hücre, tohum önce temizlenmiş PDMS yapıları steril tabakaları bana aktarın ve onları komple sterilizasyon sağlamak 5 min için ultraviyole ışığa maruz.</li>
	<li>Her yapı bir 35 mm hücre kültür plaka veya hemen hücre tohum için 6-şey plaka aktarın.</li>
	<li>
Kalp ATDPCs bir konfluent T75 şişesi trypsinize.
	<ol>
<li>1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 5 mL ile T75 şişeye yıka.</li>
		<li>1 mL % 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Tripsin-EDTA devre dışı bırakabilirsiniz için tam orta 5 mL ekleyin.</li>
		<li>Toplamak tüm hücreleri 15 mL tüp ve yıkama şişeye 2 x 5 mL de kalan hücreleri toplamak için PBS ile.</li>
		<li>Vasıl 230 x g 22 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve onları hemasitometre odası ile saymak için tam orta 2 mL hücrelerde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kardiyak ATDPCs (2. 5 x 105 hücre/mL) 200 µL 12 PDMS yapıları (~ %80 kaplı tohumlama yüzey sağlamak içinŞekil 1A, B), hücre havuza hücreleri tarafından ertesi gün tohum ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya. Not: 2-4 h sonra hücreleri iliştirilmesi gerekir. Hücre inoculum hücre boyutu ve büyüme göre hazırlanır. Daha küçük hücreler için tohum yoğunluğu artırılmalıdır.</li>
	<li>Yavaşça prewarmed tam orta (α-MEM % 10 fetal Sığır serum, %1 L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) 2 mL plaka ekleyin.</li>
	<li>Yapıları kültür koşulları (genellikle 37 ° C ve % 5 CO2) adlı gecede kuluçkaya.</li>
</ol>3. elektromekanik stimülasyon kurulum (0 gün)
<ol><li>Yordamına başlamadan önce elektromekanik uyarılması için altı yapıları ve altı nonstimulated denetimleri olarak al. Stimülasyon başına az altı tabak ile aynı orta ses ile boş yapıları uygun elektrik alanı stimülasyon emin olmak için kullanın.</li>
	<li>% 70 etanol ile stimülasyon Üniteyi temizlemeden ve akış içinde kabine yerleştirin.</li>
	<li>Steril elektrotlar ve cımbız akışı kabine içinde getir.</li>
	<li>Medya % 90'ı kolayca elektrotlar ve yapıları işlemek için kültür plaka kaldırın. PDMS yapıları hem sabit hem de mobil mıknatıslar arasındaki manyetik çekim (PDMS deplasman mıknatıs doğru kültür plaka içinde) sağlamak için doğru konumda birincilik. Daha sonra platin tel elektrot bağlayıcılar ve belirlenen alanı PDMS seçenekli PTFE bölümünde bağlayın.</li>
	<li>Taze prewarmed tam orta 2.5 mL her yapı için ekleyin. Not: Kısırlık prosedürü boyunca korumak ve bir defada bir yapı üzerinde işlem yapar. Yapıları kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 kalan kadar kullanmak korumak.</li>
	<li>Tüm PDMS yapıları yerleştirilir ve elektrikle platforma bağlı, platform da kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2içine geri getir.</li>
	<li>Elektrik ve mekanik kaynağına bağlanmak.</li>
	<li>
Stimülasyon programı yapılandırın. Elektrik ve mekanik stimülasyon rejimler elektrik uyarıcı ve mekanik stimülasyon denetleyen uygulama, Kullanıcı arabirimleri üzerinden belirtin. Senkronizasyon aşağıdaki gibi ayarlayın.
	<ol>
<li>Elektrik Stimülatörü geçin. Ana menü ekranda görünmesini bekleyin.<ol>
<li>O zaman, seçme seçenek 2: düzenlemek sıra + Enter.</li>
			<li>Sıra menü aşağıdaki gibi düzenleyin.<ol>
<li>Voltaj veya geçerli seçmek için modu sekmesini kullanın. + Tıklatarak geçerli seçin ve Entertuşuna basın.</li>
				<li>Genlik sekme için 1 (mA) +/- ile seçin ve Entertuşuna basın.</li>
				<li>Süre (T), 1000 (ms) +/- ile seçin ve Entertuşuna basın.</li>
				<li>+/- İle 2 (ms) için darbe süresi (Tw) belirleyin ve Entertuşuna basın.</li>
				<li>Tetik modu sekme için yazılım tarafından dış seçin ve Entertuşuna basın.</li>
				<li>Ana menüde seçin seçenek 4: sıra oluşturmak ve Entertuşuna basın. Not: seri bağlantı noktası üzerinden mekanik Stimülatörü uygulamasından bir harekete geçirme komutu alıncaya kadar bekleme modundayken elektrik uyarıcı dayanmaktadır.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Denetim uygulama masası (Şekil 2C) mekanik stimülasyon bölümünde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.<ol>
<li>1000 (ms) Darbe dönemi metin denetimindeki yazmak.</li>
			<li>500 (ms) mekanik darbe süresi ayarlamak için ON time (Tw) metin denetimindeki yazmak.</li>
			<li>Yazma 2.000 (% 10 Yapı uzama sunmak için AU) gezi metin denetimine. Bu adımları doğrusal kontrol motor sayısıdır. Not: burada uygulanan stimülasyon Protokolü alternatif akım 2 ms monophasic kare dalga bakliyat 50 mV/cm 1 Hz ve 7 gün boyunca uzanan % 10 oluşur. Mekanik darbe yükselişi ve sonbahar zamanlarında 100 ms kabaca kalp basıncı Nabız şeklini taklit için ayarlanır. Ayrıca, tekrarlama modu sürekli için ayarlanır ve bakliyat sayısını gösteren bir sayaç.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medya 2 x bir hafta (Pazartesi ve Perşembe öğleden sonra) değiştirin. Önce eski medya kaldırın; sonra sıcak ortam PDMS destek, asla doğrudan hücre havuzu tarafına ekleyin. Not: Hücrelerde bir yüksek büyüme oranı varsa, medya değişen 3 x hafta (örneğin, Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) olmalıdır. Tüm kabloları yeniden takın ve kesin gereklidir, ama kültür plakaları ve elektrot onların yerden kaldırmak için gerek yoktur.</li>
	<li>Deneme işlemi sonucunda örnekler toplamak.</li>
</ol>4. örnek koleksiyon deneme (7 gün) sonunda
<ol><li>
RNA analizleri için
	<ol>
<li>Yapı yıkama 2 x 1 x PBS oda sıcaklığında 5 min için 3 mL ile.</li>
		<li>3 mL % 0.05 tripsin-EDTA her plaka (tüm yapı karşılamak için yeterli) ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika bekleyin</li>
		<li>Sonra hücreleri ayrılır, tripsin-EDTA devre dışı bırakabilirsiniz için tam orta 2 mL ekleyin.</li>
		<li>Toplamak tüm hücrelerde 15 mL tüp ve yapı yıka 2 x 3 mL kalan hücreleri toplamak için PBS ile.</li>
		<li>22 ° C'de 5 min için 230 x g , santrifüj</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS 1 mL resuspend.</li>
		<li>Hücre çözümü 1,5 mL tüp ve 5 min için 230 x g , santrifüj aktarın.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve lizis reaktif daha da RNA izolasyonu için 700 µL Pelet-80 ° C'de depolayın.</li>
		<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek ticari bir seti kullanarak RNA yalıtmak.</li>
		<li>Ters-uyarlamak teçhizat ve üreticinin protokolüne göre rasgele hexamers kullanarak izole RNA.</li>
		<li>Küçük RNA konsantrasyonları için preamplify ve sonraki gerçek zamanlı Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmadan önce sonra 1:5 RNase free suyla seyreltik. Standart iletişim kuralı ile gerçek zamanlı RT-PCR için devam etmek ve ana kalp işaretleri kontrol edin. Not: Erken ve geç işaretleri farklı kategorilerden, kardiyak transkripsiyon faktörleri gibi tipik kalp işaretleri oluşturan (myocyte özgü artırıcı bir faktör 2A [MEF2A], GATA-bağlayıcı protein 4 [GATA-4]) ve yapısal (kardiyak troponin ı [cTnI], kardiyak Troponin T [cTnT], α-Aktinin) ve kalsiyum Yönetmeliği (Connexin43 [Cx43], sarco-/ endoplazmik retikulum Ca2 +-ATPaz [SERCA2])30. Protein yalıtım da gerekirse gerçekleştirilebilir. Eşzamanlı RNA ve protein yalıtım örnek miktarı az ise kitleri (Malzemeler tablo) ve piyasada bulunan reaktifler kullanarak aynı örnek ile gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmmunostainings için Not: Bu doğrudan PDMS yapısı hücre havuzuna bağlı hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. Bu nedenle, 1 cm x 1 cm parafin film hücre havuzu, plaka dışında üst kapak ne zaman, kuluçka çözümleri buharlaşma en aza indirmek için yerleştirerek, öneririz.<ol>
<li>Yapı yıkama 2 x PBS 3 mL oda sıcaklığında 5 min için ile.</li>
		<li>2 mL % 10 formalin 15 dakika oda sıcaklığında sahip yapı bağlı hücreleri tamir.</li>
		<li>3 hücreleri yıkama x PBS 3 mL oda sıcaklığında 5 min için ile. Uzun süreli depolama için 4 ° C'de % 0,1 Sodyum azid PBS içinde örnekleri bırakın</li>
		<li>PBS + %0.5 deterjan 3 mL hücrelerle permeabilize (3 x, her zaman oda sıcaklığında 5-10 dk.).</li>
		<li>Spesifik olmayan antikor bağlama engellemek için PBS + % 10 at serum + % 0,2 deterjan + %1 sığır serum albümin, oda sıcaklığında 1 h için 100 µL hücrelerle kuluçkaya.</li>
		<li>PBS + % 10 at serum + % 0,2 deterjan + %1 sığır serum albümin + 1 h için oda sıcaklığında birincil antikor 100 µL hücrelerle kuluçkaya. Örneğin, birincil antikorlar Cx43 karşı 1: (100) sarcomeric α-Aktinin (1: 100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25) ve SERCA2 (1:50).</li>
		<li>3 x 5 min için oda sıcaklığında PBS 3 mL ile yıkayın.</li>
		<li>PBS + 1 h için karanlıkta oda sıcaklığında ikincil antikor 100 µL hücrelerle kuluçkaya. Not: İkincil antikorlar ile farklı fluorophores Birleşik ve counterstaining bir ajan kullanılmıştır.</li>
		<li>Onları yıkamak PBS 3 mL 5 min için karanlıkta oda sıcaklığında ile 3 x.</li>
		<li>Nükleer (0.1 µg/mL) boyama 100 µL hücrelerle PBS içinde 15 dakika karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Onları yıkamak PBS 3 mL 5 min için karanlıkta oda sıcaklığında ile 3 x.</li>
		<li>Örnekleri PBS 3 mL % 0,1 Sodyum azid 4 ° c ile satın kadar saklayın. Not: Yapı kalınlığı 0,5 mm olduğu için mikroskop satın alma üzerinde ters floresan ve confocal mikroskoplar uzun çalışma mesafe hedefleri ile mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Stimülasyon aygıt ve iletişim kuralı daha önce patentli dışında (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1) yazarlar ifşa etmek hiçbir şey var.

Elektromekanik stimülasyon hücreleri için düşman bir kardiyak ortamı hazırlama ve kardiyak bağlılıklarını artırılması için güvenli bir alternatif gibi görünüyor. Burada, kardiyak progenitör hücrelerin ana kalp işaretleri ifade ve oldu için açıklanan bir protokol hazır fare Miyokardiyum30sonraki onların Uygulanılmasından için yararlı olacağı bildirildi. Genel olarak, elektromekanik uyarılmış kardiyak ATDPCs genler ile ilgili erken, yapısal ve asla önceki elektriksel veya mekanik elektrodlar ile tek...

Kalp fonksiyonu elektrik uyarma ve mekanik daralma kaplin temel alır. Kısaca, cardiomyocyte hücreler arası kavşak neredeyse zaman uyumlu kasılma kalbin pompa kan sistemik ve pulmoner sistemi aracılığıyla üretmek için elektrik sinyali yayma izin verir. Kalp hücreleri, bu nedenle, gen ifade ve hücresel fonksiyon düzenleyen elektrik ve mekanik Kuvvetleri tabi. Buna göre birçok grup mekanik ve elektrik stimülasyon kalp geliştirme, işlev ve olgunlaşma rolünü anlamak için kardiyak fizyolojik ortamı taklit kültür platformları geliştirilmesi için çalıştılar. Vitro elektrik ve mekanik elektrodlar tek tek kapsamlı işlevsel özellikleri geliştirmek, hücre olgunlaşma artırmak veya hücre-hücre kaplin ve kalsiyum1 işleme geliştirmek için kalp doku mühendisliği uygulanan , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. yine de, zaman uyumlu elektromekanik Klima gelişmekte olan bir uyarıcı ve protokol bir meydan okuma ve zorunlu optimizasyonu22yüzünden unexploited kalır.
Ön çalışma olarak bir arada elektriksel stimülasyon ve medya perfüzyon elektromekanik stimülasyon hitaben; Ancak, akışı zorlanma tabanlı deformasyon ventriküler dolum23,24,25/ tipik anlamına gelmez. Daha sonra daha fazla fizyolojik yaklaşımlar elektriksel uyaranlar fiziksel deformasyon ya da isovolumetric kasılma26,27,28,29,30 taklit etmek için streç ile birlikte ,31. Feng vd açıklanan Gelişmiş cardiomyocyte boyut ve contractile özelliklerini26raporlama 2005 yılında elektromekanik uyarım ilk gösteri. Wang vd mezenkimal kök hücre ile 5-azacytidine ön işleme ve aynı anda elektrik ve mekanik Klima, recellularization, hücre canlılığı, kardiyak farklılaşma ve27remodeling doku iyileştirilmesi uygulanan. Bu yayınlar beri daha fazla grup hücre monolayers elektromekanik uyarılması bildirilen veya doku (örneğin, siyah28, Vunjak-Novakovic29,31ve bizim grup30) ile mühendislik ilk şartına hücreleri içinde vivo30test. Kısaca, Morgan ve siyah gecikmeli kombine elektromekanik stimülasyon en iyi sonuçları28vermiştir çünkü elektrodlar arasındaki zamanlama çok önemli raporlama elektrik ve mekanik uyaranlara, birkaç kombinasyon test. Ardından, Godier-Furnémont ve ortak bir elektromekanik stimülasyon Protokolü mühendislik kalp kas yapıları yenidoğan sıçan kalp hücreleri için en iyi duruma getirilmiş ve elde, ilk kez bir pozitif güç frekanslı ilişki29. Daha sonra bizim grup ana kalp işaretleri vitro ifade elektromekanik preconditioned hücreleri artmış ve geniş yararlı içinde vivo etkileri, kardiyak fonksiyon gibi geliştirilmiş veya enfarktüsü gemi yoğunluğu artmış bildirdi sınır bölgesi30. En son yayın kök hücre kaynaklı cardiomyocytes kardiyak dokulardan bir olgunlaşma düzeyi yakın insan yetişkin kalp yapısı ve fonksiyonu31ulaştı elektromekanik Klima tabi gösterdi. Buna ek olarak, alternatif üç boyutlu stimülasyon platformları sağlamak elektrik, mekanik electroactive iskele oluşturan ve32topografik cues hücrelere bağlı. Ayrıca, mekanik deformasyon (hücre monolayer germe ve sıkıştırma) ayrıca normal fizyolojik şartlarda yanı sıra dışı koşullarda33taklit gerilebilir elektrotlar ile indüklenen.
Bu nedenle, mantığı fizyolojik koşullara göre tüp bebek elektromekanik uyaranlara bir hücre cardiomyogenic potansiyelini geliştirmek. Gerçekten de, bu uyarımı daha fazla klinik senaryosunda Miyokardiyum içine terapötik hücre entegrasyonlar parası veya doku olgunlaşma uyuşturucu-perdeleme uygulamaları için-artırmak.
Buna ek olarak, izole ve kardiyak insan Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücrelerin nüfusu ile karakterize kökenli (kardiyak ATDPCs)34. Bu hücreler epicardial yağında bulunur. Bu hücreler miyokard infarktüsü tedavisinde yararlı histopatolojik ve fonksiyonel etkileri görüntülemek ve ayrıca kalp ve endotel farklılaşması potansiyel korumak. 30 , 35. bu faydaları sonra biyofizik stimülasyon artıracak ki biz onaylanmadığına karar.
Sonuç olarak, biz bir aygıt ve stimülasyon rejimi hücre nüfus ilgi için geliştirilen ve etkileri araştırıldı. Elektromekanik bu iletişim kuralı etkin hücrenin steril bir şekilde uzanan ikna etmek için yeni bir strateji ve noninvazif önceki yayınları36, elektrik alanı stimülasyon ile birlikte karşılaştırıldığında. Rapor burada teknik cihaz ve hücreleri elektrik, mekanik ve elektromekanik uyarılması için kullanılan yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Bu cihaz elektrik ve mekanik stimülasyon, bağımsız olarak veya aynı anda sağlar. Stimülasyon presterilized hücre destek, bir standart kültür plaka ve mekanik ve elektrik Kuvvetleri (Şekil 1) indükler bir platform yerleştirilen elektrotlar noninvaziv ve aseptik yeni bir yaklaşım ile gerçekleştirilir.
Platform ilâ altı kültür tabaklar ve bir sandviç yapı lazerle kesilmiş poly(methyl methacrylate) ve baskılı devre kartı parçaları oluşur tutabilir. Platform prototip bir monophasic programlanabilir bilgisayar kontrollü elektrikli uyarıcı, baskılı devre kartı elektrotlar ve yer altı 10 mm x 10 mm x 5 mm nikel kaplama Neodimyum sabit mıknatıslar sağlam bağlantı için bir arada kullanır bir tarafı kültür plakaların. Bir alüminyum çubuğu kültür plakaları öbür önüne yerleştirilir ve doğrusal bir rediktördür ile taşındı altı itici mıknatıslar (aynı modeli) da vardır. Motor bir RS-232 portu üzerinden ticari yazılım tarafından işletilen bir motor kontrolörü tarafından tahrik edilmektedir ( Tablo reçetesigörmek). Kullanıcı arabirimi ve programlanabilir Stimülatörü elektrik yoğunluğu, darbe süresi ve sıklığı, mekanik stimülasyon, onun iş hacmi, bakliyat, darbe genlik (mıknatıs gezi), sayısı sıklığını programlamak mümkün olduğunu ve yamaç.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Resim 1 : Elektromekanik Stimülatörü. Hücre Klima için kullanılır (A) PDMS yapısı. (B) elektrodları ve mıknatıslar gibi PDMS yapı çiziminin. Elektromekanik Klima gerçekleştirmek için kullanılan baskılı devre kartı (platform) (C) detay. Bu panel Llucià-Valldeperas değiştirildi vd.30. (D) resmi elektromekanik stimülasyon platform ve Kullanıcı arabirimi (bilgisayar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Uyarıcı ve elektromekanik Klima için yöntemi tam olarak iki uluslararası patent, WO-2013185818-A137 ve WO-2017125159-A138anlatılmıştır.
Hücreler, elektrotlar ve mıknatıslar için yapısal destek sağlamak üzere tasarlanmıştır yapıları olmuştur biyouyumlu silikon daha önce açıklanan10,21. Kısaca, kalıp ve fizyolojik düzeyleri yakın 1.3 MPa, bir Young katsayısı ile Oda sıcaklığında tedavi polydimethylsiloxane (PDMS) oluşur. İki iç enine yuvaları elektrotlar tutmak için ve iki 6 x 2 mm x 4 mm nikel kaplama Neodimyum mıknatıslar gömülü, bir hücre kültür Havuzu (10 x 10 x 2 mm) esnek bir alanda inşa içerir. Elektrotlar bir 2 x 3 mm x 12 mm politetrafloroetilin (PTFE) etrafında bükülmüş mm platin tel elektrot, yaklaşık 23 döner her (21 cm) bar çekirdek ve ters tarafı ikna için bir elektrik alanı oluşturmak için esnek çevrenin yer 0,2 ile inşa edilir elektriksel stimülasyon. Mekanik germe çekmek içinde gömülü mıknatıslar ve yanındaki kültür plaka ve hareketli alüminyum kol üzerine yerleştirilmiş dış mıknatıslar arasındaki manyetik çekim yoluyla elde edilir. Bu şekilde, cep destek steril bariyer bozmadan genişletilebilir. Bu yaklaşım bir hücre monolayer için uygundur ama üç boyutlu yapıları için de adapte.
Buna ek olarak, düzenli bir desen çizgili bir kırınım ızgara (1,250 oluklar/mm) kullanarak nerede hücreleri tohumlari, baskılı olabilir. Aydınlık alan ve floresan mikroskoplar altında PDMS yapı üzerinde kültürlü hücreleri doğrudan görselleştirme olan şeffaflık ve 0,5 mm kalınlığı nedeniyle mümkündür. Geçerli durumda dikey bir yüzey deseni, dik dik hücrelere hücre boyunca elektrik alanı degrade en aza indirir elektrik alanı hizalamak için germe kuvvetleri, PDMS kültür havuzu vardır.
Şekil 1 yapı ve stimülasyon için kullanılan aygıt ayrıntılı bir açıklamasını gösterir. PDMS oluşturmak ve özellikleri (Şekil 1A, B) uzanan hücre için optimize edilmiştir. Uyarıcı geliştirilen ve istenen elektrik ve mekanik stimülasyon PDMS yapı bağlı hücrelere etkili uygulanması için doğrulanmış. Bu işlem yazılım arabirimi (Şekil 1 c, D) iyi bağlantı ve Kullanıcı işlerliğini sağlamak içerir.
Bu özel cihaz kullanarak hücre uyarılması için yordam Protokolü bölümünde anlatılan.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Uyarıcı< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nikel kaplı neodimyum mıknatıslar</td><td>Süpermagnet</td><td>Q-10-10-05-N</td><td></td></tr><tr><td>nikel kaplı neodimyum mıknatıslar</td><td>Süpermagnet</td><td>Q-06-04-02-HN</td><td></td></tr><tr><td>polidimetilsiloksan (PDMS) SYLGAR 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning Corp</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>kurallı kırınım ızgarası (1250 oluk / mm)</td> <td>Newport</td><td>05RG150-1250-2</td><td></td></tr><tr><td>Motor kontrolörü</td><td>Faulhaber</td><td>MCLM-3006-S</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>Ulusal Aletler</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Hücre kültürü< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>70013-065</td><td></td></tr>% <tr><td>0.05 tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>35 mm hücre kültürü kabı</td><td>BD Falcon</td><td>45353001</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM, 100x</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomisin, 10.000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Minimum esansiyel orta kartal (alfa-MEM)</td><td>Sigma</td><td>M4526-24x500ML</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Protein & RNA analizleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol Lizis Reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep RNA/Protein Kiti</td><td>Qiagen</td><td>50980404</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Üniversal Problar Tek Adımlı Kit</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>172-5140</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele heksamerler</td><td>Qiagen</td><td>79236</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp MasterMix 2x</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR MasterMix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4324018<</td><td></td></tr><tr><td>güçlü>Immunostaining</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%10 formalin</td><td>Sigma</td><td>HT-501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>at serumu</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albüminası (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S8032-100g</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Connexin-43 tavşan birincil antikoru</td><td>Sigma</td><td>C6219 lot # 061M4823</td><td></td></tr><tr><td>sarkomerik & alfa;-aktinin fare birincil antikoru</td><td>Sigma</td><td>A7811 lot # 080M4864</td><td></td></tr><tr><td>GATA-4 keçi birincil antikoru</td><td>R& D</td><td>AF2606 VAZ0515101</td><td></td></tr><tr><td>MEF2 tavşan birincil antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-313 lot#E0611</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2 keçi birincil antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8095 lot#D2709</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 ikincil antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 ikincil antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 ikincil antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 ikincil antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-225-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 ikincil antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 ikincil antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-225-147</td><td></td></tr></tbody></table>

hücrelerin cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Kalp-damar hastalıkları gelişmiş ülkelerde ölüm önde gelen nedenidir. Sonuç olarak, etkili kardiyak hücre tedavileri için talep araştırmacılar kök hücre ve Biyomühendislik alanlarında vitro yüksek sadakat insan Miyokardiyum temel araştırma ve klinik uygulamaları geliştirmek için motive vardır. Ancak, kalp hücrelerinin olgunlaşmamış fenotip işlevsel olarak esas olarak mekanik ve elektrik sinyalleri tarafından karakterize yetişkin Miyokardiyum taklit doku alma konusunda bir kısıtlamadır. Böylece, bu iletişim kuralını amacı hazırlamak ve fizyolojik parametreler recapitulating hedef hücre nüfus ile elektromekanik stimülasyon, Olgun etmektir. Kalp doku mühendisliği daha fazla biyolojik yaklaşımlar doğru gelişen ve biyofiziksel uyaranlara üzerinde böylece, temel stratejileri ivme kazanmaktadır. Bu amaçla geliştirilen cihaz benzersiz ve özenle karakterize ve doğrulanmış bireysel ya da aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon sağlar. Buna ek olarak, metodoloji Bu uyarıcı ve belirli hücre nüfus için optimize edilmiş olsa da, bu kolayca diğer aygıtlar ve hücre hatları için adapte edilebilir. Sonuçları buraya elektromekanik stimülasyon sonra hücre nüfusunun artan kalp taahhüt kanıtı sunuyoruz. Elektromekanik teşvik hücreleri artan bir ifade ana kardiyak Marker, erken, yapısal ve kalsiyum düzenleyen genler de dahil olmak üzere gösterir. Bu hücre Klima daha da rejeneratif hücre tedavisi, hastalık modelleme ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için yararlı olabilir.

Şekil 2 hücre uyarılması için takip genel şemayı temsil eder. Kısaca, hücreleri PDMS yapı tohumlari ve elektromekanik uyarılması için haftada iki kez gerçekleştirilen bir medya değişiklikle tabi. Nonstimulated hücreleri için elektromekanik Klima bir denetim olarak kullanılmıştır. Ayrıca, deneme için bir ilave kontrol eklendi ve subkutan ATDPCs kardiyak ATDPCs için bir denetim olarak kullanılmıştır. Subkutan ATDPCs kardiyak ATDPCs33geli...

Burada elektrik ve mekanik uyaranlara kardiyak Fizyoloji taklit kullanan bir hücre kesimin eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu elektromekanik stimülasyon işlem görmüş hücreleri cardiomyogenic potansiyelini artırır ve daha fazla hücre tedavisi, hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması için umut verici bir stratejidir.

Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Bu hücrelere elektromekanik stimülasyon uygulamak için bir yöntemdir. Bir hücre popülasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için birden fazla uygulaması vardır, in vivo doğum için ön eğitim, ve hücre olgunlaşması. Bunun avantajı, steril viral bozulmadan tutarken aynı cihazla tek tek veya aynı anda elektriksel ve mekanik uyaranların uygulanabilmesidir.Bu teknik tedavimize dolaylı bir yaklaşımdır. Hücre tedavisi elektromekanik uyarılmış hücreler intro-miyokardiyum tedavisinde ilginç bir hücre popülasyonu olabilir kabul edilir. Bu yöntem genellikle kardiyovasküler alana ait, ama aynı zamanda sinir sistemine uygulanabilir.Bu sabır gerektiren kolay bir tekniktir. En zor kısmı, küçük parçalar ile çalışan olacak ve boyunca sterilite tutmak. Manipülasyon un açıklaması zor olan küçük ayrıntılar vardır, bu nedenle görsel gösteri gerçekten yararlıdır.12 temizlenmiş PDMS yapısını steril 10 santimetre plakaya aktararak başlayın. Tam sterilizasyon sağlamak için plakaları beş dakika UV ışığına maruz bırakın. Sonra ayrı bir 35 milimetrelik hücre kültür plakası, ya da hemen hücre tohumlama için 6-iyi plakalar her yapı aktarın.Hücre tohumlamaya başlamak için, ilk 1x PBS beş mililitre ile kardiyak AT

simultaneous-electrical-mechanical-stimulation-to-enhance-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacaktır.

Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler

Bu el yazması, yüzey işaretleyici ekspresyonu ve hücre sıralaması kullanılarak tanımlanmış tasarlanmış kardiyak dokuların oluşturulmasını açıklar. Tanımlanan dokular daha sonra insan kalbinin işlevsel, ancak kontrollü bir model sistemini sağlamak için kardiyak hücre tedavisi mekanizmalarını araştırmak için çok dokulu bir biyoreaktörde kullanılabilir.

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Kalp biowire platformu elektrik stimülasyonu ile üç boyutlu hücre ekimi birleştirerek, insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde (hPSC-CM) olgun için kullanılan bir in vitro yöntem olup. Bu el yazması kardiyak biowire platformunun ayrıntılı kurulum sunar.

Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.

Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Bu protokolde, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kardiyomiyosit farklılaşma ve arıtma için nasıl kullanılacağı ve daha fazla, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü ile transplantasyon verimliliğini nasıl iyileştirebileceğini gösteriyoruz. bir fare miyokard infarktüsü modelinde ön tedavi.

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Keşfedin hücrelerin kardiyomiyojenik potansiyelini artırmak için elektromekanik stimülasyon yöntemini. Bu teknik eşzamanlı elektrik ve mekanik uyarı uygulayarak hücre olgunlaşmasını iyileştirir ve hücre terapisi ile ilaç taramalarında uygulama sağlar.

Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

Daha fazla video keşfet