Name: Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin, insan trofoblast hücrelerinin göç, işgal ve proliferasyon davranışlarını değerlendirmek için scratch, transwell ve hücre çoğalma testlerini. Bu yöntemler obstetrik sonuçları anlamak için görsel ve nicel analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr. Gil Mor Sw.71 hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir Albert McKern bilim adamı Ödülü S.W. tarafından desteklenmiştir

1. hücre hazırlık
<ol><li>T-75 şişeler 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem oranı, standart büyüme medyada hücreleri korumak. Not: Bu deneylerde kullanılan hücre ölümsüzleştirdi vardı birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 hücre DMEM/F-%12 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 1.0 mM sodyum pyruvate, 10 mM HEPES, 0.10 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100 adet/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş muhafaza. HTR-8/SVneo hücre RPMI-1640 %5 ile desteklenmiş saklanır ısı-inaktive FBS.</li>
	<li>90-%100 izdiham ulaşana kadar çoğaltmak hücreleri izin. Steril doku kültürü akışı kukuIeta kullanarak, steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 mL şişe ve yıkama hücrelerle medyadan Aspire edin.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve 1 (% 0.05) x 5 mL ekleyin Tripsin-EDTA hücreleri tripsin tarafından tutulduğundan emin yapma şişesi için. Tüm hücreleri şişeye (yaklaşık 5-10 dk) altından ayırdıktan kadar 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza laboratuvar kuluçka şişeye koyun.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 10 mL tripsin-EDTA devre dışı bırakmak için balonun ekleyin.</li>
</ol>2. sıfırdan tahlil
<ol><li>Adım 1.4, tohum % 100 izdiham 48 h ulaşmak için 24-şey plaka hücrelere uygun sayıda takip. Not: Kazı-kazan tahlil çeşitli farklı plaka düzenler ile gerçekleştirmek mümkündür. Kuyu yara maker aracı tarafından izin verilen en fazla sayısını bir 96-şey biçimidir.</li>
	<li>Ertesi gün (bir gün önce sıfırdan tahlil), medya ısı inaktive, kömür dextran elimden FBS dahil olmak üzere gerektiği gibi takıma fenol kırmızısı boş ortam için değiştirin. Not: Diğer çalışmalar düşük konsantrasyon FBS (örneğin, % 1) ile medya kullanımı tavsiye Bu iletişim kuralı11alternatif olarak kullanılan hücre çoğalması en aza indirmek için.</li>
	<li>Kazı-kazan tahlil günü, hücreler 30 dk için istenilen tedavi her şey medya ekleyerek pretreat. Anahattı hazırlanmış deneyler araç (1 x PBS) ve 1 x PBS içinde seyreltilmiş 100 nM deksametazon kullanılmaktadır.</li>
	<li>
Tek tip yaralar oluşturmak için steril 10 µL pipet ipucu yara maker aracı iğne yerleştirin. İpuçları Wells ilk satıra düşürebilir ve pipet ipuçları iyi diğer tarafına ulaşmak kadar plaka yara maker parça boyunca taşıyın.
	<ol>
<li>Plaka alt plaka kuyu çapı arasında yara bir sabit emin olmak için sürekli dokunmak pipet ipuçları izin başlangıç pozisyonuna geri taşıyın. Kaldırmak ve yerine steril 10 µL pipet ipuçları ve ipuçları wells sonraki satır düşük.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bütün wells çizik kadar 2.4 tekrarlayın. Not: Bir yara maker aracı yoksa, yaralar el ile wells 10 µL pipet ucu ile Merkezi kazıma oluşturulabilir.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde medya Aspire edin ve yavaşça hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Son bir yıkama desteklenmiştir fenol kırmızısı ücretsiz, soyulmuş ya da istenilen tedavi ya da (2.3. adımda belirtilen şekilde) araç düşük-FBS medya ekleyin. Not: 1 x PBS ile yıkama ayırmak hücreleri neden olur HTR-8/SVneo hücreleri desteklenmiştir fenol kırmızısı medya ile yıkanmalıdır.</li>
	<li>Otomatik, hızlandırılmış Imager içeren çizilmiş wells ( Tablo malzemelerigörmek) yer alan 24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza bir laboratuvar kuluçka yerleştirin. Hücreleri (örneğin, her 2 h için 72 h) yara iyileşmesi tamamlamak izin vermek için gerektiği gibi düzenli aralıklarla görüntü wells.</li>
	<li>Otomatik, hızlandırılmış Imager ile ilişkili yazılım tarafından yara yoğunluğu ve genişliği hesaplayın ( Tablo malzemelerigörmek). Yaranın boyutuna başlangıç yaranın büyüklüğüne göre yüzde değişim hesaplamak için yaranın genişliği 0 zamanında % 100 değerine ayarlayın. Sonraki her timepoint yara boyutunda yaranın büyüklüğüne göre 0 zamanında bölmek ve yüzdesi (şekil 1) elde etmek için 100 ile çarpmak.</li>
</ol>3. Invasion tahlil
<ol><li>Aşağıdaki adım 1.4, tohum hücre hücreleri % 90 izdiham içinde 48 h. koru hücreleri 37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem ayarlı bir laboratuvar kuluçka ulaşmak izin vermek için 6-şey tabak içine uygun bir sayı.</li>
	<li>Ertesi gün, medya ısı inaktive, kömür dextran elimden FBS dahil olmak üzere gerektiği gibi takıma fenol kırmızısı boş ortam için değiştirin. Not: Hücreleri bağlı olarak deneysel tasarım şu anda pretreated.</li>
	<li>Şu anda 10 mg/mL hücre dışı matriks şişe yerleştirin ( Tablo reçetesibakın) ve buz buzdolabında gecede çözülme izin.</li>
	<li>Ertesi gün, önceden serin işgali tahlil 24-şey plakaları yerleştirerek kaynakları, microcentrifuge tüpleri ve pipet İpuçları (4 ° C) buzdolabında en az 2 h önce hücre dışı matriks ile çalışan için hücre kültürü ekler.</li>
	<li>Doku kültürü mahallede soğutulmuş malzemeleri kullanarak, 10 mg/mL hücre dışı matriks fenol red ücretsiz, serum-Ücretsiz medya için 5 mg/mL nihai bir konsantrasyon ile 1:1 oranında seyreltin. Not: Her zaman hisse senedi ve seyreltilmiş hücre dışı matriks buz üzerinde tutun. Hücre dışı matriks medyaya oranını assay olarak kullanılan hücre satır özelliklerini göre ayarlanabilir.</li>
	<li>Doku kültürü mahallede soğutulmuş malzemeleri kullanarak, seyreltilmiş hücre dışı matriks 100 μL 24-şey plaka yerleştirilir ekler ( Tablo malzemelerigörmek) ekleyin. Matrix olmadan herhangi bir kabarcıklar düzeyi olduğundan emin olun. 24-şey plaka içeren matris kaplı yer kuluçka 37 ° C'de matris sertleşmesine izin vermek için ekler.</li>
	<li>Hücreleri istila tahlil için hazırlık için hücreleri 1 mL 1 x PBS ile yıkayın, PBS Aspire edin ve her şey için 1 x tripsin-EDTA 500 µL ekleyin. 6-şey plaka tüm hücreleri kalenin altından ayırdıktan kadar 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza laboratuvar kuluçka yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri ayırdıktan sonra fenol-kırmızı-free, serum-Ücretsiz medya 500 µL trypsinized hücreleri her şey için ekleyin.</li>
	<li>Microcentrifuge tüp ve aşağı spin vasıl 400 x g 4 ° C'de 5 min için 1.000 µL müstakil hücre transfer</li>
	<li>Medya Aspire edin ve fenol red ücretsiz, serum-Ücretsiz medya hücrelerde resuspend (birim hücre konsantrasyonu bağlı olacaktır). Otomatik bir hücre kullanarak hücreleri hesaplama ( Tablo malzemelerigörmek) counter ve hücre süspansiyon için 5 x 10 mL başına5 hücre son bir konsantrasyon seviyesini ayarlamak. Not: Bir hemasitometre ve mikroskop hücreleri saymak için kullanılabilir.</li>
	<li>Tam büyüme ortamının 600 μL işgali tahlil için kullanılacak olan 24-şey plaka kuyu ekleyin. Not: Ek chemoattractants veya tedavi tam büyüme orta iyi (alt Kamara) eklenebilir. Anahattı hazırlanmış deneyler araç (1 x PBS) veya 1 x PBS alt odasına içinde seyreltilmiş 100 nM deksametazon eklendi.</li>
	<li>Yer önceden kaplanmış işgali tahlil için kullanılacak tam büyüme orta içeren her şey eklemek. Daha sonra hücre üstünde tepe-in her önceden kaplanmış hücre ekleme (üst Kamara) 1 x 105 hücreleri olmak üzere toplam 200 μL ekleyin. Not: Bu tahlil için bir negatif kontrol, fenol-kırmızı-Alerjik, serum-özgür medya (olmadan hücreleri) eşit bir hacmi üst odasına eklenebilir.</li>
	<li>24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO2ve 24 saat için % 95 nem muhafaza laboratuvar kuluçka yerleştirin. Not: 24 saat kuluçka dönemi ölümsüzleştirdi birinci üç aylık dönem Trofoblast hücreleri için optimize edildi ve daha fazla testler diğer hücre hatlarında gerekli kuluçka süresi belirlemek için gerekli.</li>
	<li>Gecede kuluçka alt ve üst odası kalan ortamdan hücre dışı matriks bozmadan emme gerek. Sonra dikkatli bir şekilde işgal olmayan hücreleri ve hücre dışı matriks INSERT hücre dışı matriks kaldırmak için gereken birçok kez ev temizliği bir pamuklu çubukla ile üst bölümünü kaldırın.</li>
	<li>Yıkama her 3 x 1 x PBS, her iki üst ve alt odaları iyi için PBS ekleme ile ekleyin. PBS her yıkama sonra Aspire edin.</li>
	<li>Ekler için % 100 buz gibi metanol 4 ° C'de 30 dk için içine ekler yerleştirerek bağlı hücreleri tamir Final yıkadıktan sonra yıkama 3 x 1 x PBS ve Kaldır PBS ile ekler. % 20 etanol içinde % 0,2 kristal violet ile 10 min için ekler bağlı hücreler leke.</li>
	<li>3 x deiyonize suyla durulayın ve deiyonize suyla sonra son yıkama Aspire edin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için ekler kuruması. Forseps ve jilet kullanarak, ucun alt membran dikkatle kesin ve alt yüzü yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerinde monte. Montaj medya oda sıcaklığında kurumasını sağlar.</li>
	<li>20 x amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak örnek başına baskına hücrelerin en az 4 benzersiz görüntü elde. Her görüntü hücrelerde toplam sayısını ve örnekleri kontrol etmek ve verileri (Şekil 2) çizmek hücre sayısı normale.</li>
</ol>4. nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
<ol><li>Aşağıdaki adım 1.4, bir otomatik hücre sayaç balonun üzerinden trypsinized hücreleri saymak ve 6-şey plakaları standart büyüme medya bir kuyu başına 2 x 105 hücre yoğunluğu, içine tohum.</li>
	<li>Yer hücreleri 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem hücreleri kadar veya 4 h için tutulan bir laboratuvar kuluçka yapıştırılır.</li>
	<li>Fenol kırmızısı renginde değişiklik ortama ısı inaktive, kömür dextran elimden FBS dahil olmak üzere özgür gerektiği gibi desteklenen medya ve istenilen tedavi ekleyin. Anahattı hazırlanmış deneyler araç (1 x PBS) veya 1 x PBS içinde seyreltilmiş 100 nM deksametazon eklendi. 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza bir laboratuvar kuluçka 6-şey tabak koyun.</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve yeni medya ve tedavi ile her 48 h değiştirin.</li>
	<li>24, 48 ya da 72 h tedavi sonra hücreleri 1 mL 1 x PBS ile yıkayın ve tripsin-EDTA 500 µL her şey için ekleyin. Hücreleri tabaktan ayırdıktan kadar 6-şey plaka kuluçka makinesine koyun.</li>
	<li>Hücreleri plaka ayırdıktan sonra 500 µL tripsin devre dışı bırakmak için ilave fenol kırmızısı Ücretsiz medya ekleyin.</li>
	<li>Trypsinized hücre 5 µL için ayrı bir tüp Trypan mavi 5 µL ve pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç kullanarak yinelenen her kuyudan hücreleri saymak.</li>
	<li>Evet, her zaman nokta ve arsa başına hücre sayısı zaman (şekil 3) bir fonksiyonu ortalama.</li>
</ol>

<ol><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester%3A+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li>
<li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+implantation+and+placentation%3A+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li>
<li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li>
<li>Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li>
<li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8%2FSVneo+Trophoblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li>
<li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li>
<li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li>
<li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line%2C+Swan+71%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li>
<li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yordamı geçiş ve işgal kullanımı deneyleri hücre çoğalması Trofoblast hücre hareketi ölçülen farklılıkları için potansiyel bir katkı olarak değeri oluşturur. Birlikte bu tüp bebek deneyleri Trofoblast geçişi düzenleyen hücresel yolları tanımlamak için kullanılan basit ve etkili yöntem kullanılır. Yukarıda açıklandığı gibi Trofoblast hücreleri hormonlar, sitokinler, büyüme faktörleri veya Trofoblast hareket üzerindeki etkilerini belirlemek için diğer molekülleri ile tedavi edilebilir. Alternatif olarak, hedef proteinle...

Plasental geliştirme gebelik, maternal ve fetal sağlığı etkileyen kurulması çok önemli bir adımdır. Ancak, bu işlem tarafından oluştuğu mekanik olarak tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre göç kurulması ve plasenta fonksiyonları için hamilelik sırasında yaptığı katkının önemli bir biyolojik süreçtir. Blastosist implantasyonu, Korionik villus yüzeyine kapak ve gaz ve besin değişimi dahil olan, villous trophoblasts, ve dışarı villus göç extravillous trophoblasts (EVTs), trophectoderm ayırır ve anne decidua ve damarlara1istila. EVTs geçirilmesi anne spiral arterler remodeling ve fetal büyüme2desteklemek için uteroplacental dolaşım kurulması için esastır. Yetersiz Trofoblast işgali sırasında gebelik gebelik komplikasyonları preeklampsi, Gestasyonel hipertansiyon, intra uterin büyüme kısıtlama ve erken doğum3gibi katkıda ve anormal plasental geliştirme sonuçları, 4. Bu nedenle, Trofoblast hareketliliği etkileyen faktörleri anlamak için normal placentation gerekli yollar belirlemek için önemlidir.
Trofoblast geçiş sinyal molekülleri, büyüme faktörleri, sitokinler, hormonlar ve anjiogenik faktörler5de dahil olmak üzere karmaşık bir ağı tarafından kontrol edilir. Plasenta içinde vivo eğitim sınırlamaları nedeniyle, tüp bebek deneyleri kullanan insan Trofoblast hücre hatları Trofoblast hareketliliği için katkıda faktörleri belirlemek için çok önemli olmuştur ölümsüzleştirdi. Sıfırdan ve işgal deneyleri kapsamlı kantitatif Trofoblast hücre göç6,7,8bireysel moleküllerin rolünü değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, tandem nasıl geçiş değişiklikleri değişiklikleri tarafından hücre invasiveness neden olabilir araştırmak için yararlı iken bu iki deneyleri değişmiş hücre geçiş oranları için katkıda bulunabilir ek mekanizmaları için hesap değil. Örneğin, hücre çoğalması oranının indirimleri daha az hücrelerde geçirmek kullanılabilir neden olabilir.
Burada, çizik, hücre çoğalması ve hücre işgali deneyleri kullanarak Trofoblast geçişi değerlendirmek için kantitatif tüp bebek yöntemleri açıklanmaktadır. Sıfırdan tahlil tek tip bir yara bir hücre monolayer oluşturulur ve geçiş hücre boşluğu doldurmak için otomatik, hızlandırılmış görüntüleme yara boyutu ve yoğunluğu yara içindeki hücreleri tarafından ölçülür. Hücre çoğalması tahlil hücreler hücreleri bilinen başlangıç miktarı karşılaştırıldığında her zaman noktasında oranını hesaplamak üzerinde temel alır. Cep işgali tahlil hücreleri bir hücre dışı matriks kaplı hücre kültür Ekle Odası (örneğin Transwell) tohumlari ve yanıt olarak kemoterapi-cezbedici hücre dışı matriks ile istila hücre sayısı dikkate alınır.
Kazı-kazan tahlil ne kadar farklı çevre koşulları belirlemek için kullanılan basit ve etkili bir araç etkileyen hücre geçiş olduğunu. Nükleer silahların yayılmasına karşı ve işgal deneyleri daha sonra hücre çoğalması ve invasiveness hücre göç genel değişikliklere katkısını belirlemek için kullanılır. Toplu olarak, bu deneyleri hücre hareketliliği için katkıda bulunabilir biyolojik süreçlerin sağlam ölçümler sağlamak. İki ölümsüzleştirdi birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre satır açıklanan deneyleri, Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10kullanılmıştır. Ancak, bu deneyleri de hücre göç ve işgal anahtar modülatörler tanımlamak için diğer hücre tipleri kullanmak için optimize.

<table><tbody><tr><td>% 0.4 Tripan mavi leke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM sodyum piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka transwell ekleri</td><td>Corning</td><td>3422</td><td>8 & mu'lu polikarbonat filtreler içerir; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>Kömür dekstran soyulmuş FBS</td><td>İkizler Biyo-Ürünler</td><td>100-119</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Menekşe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alfa;-floro-16&alfa;-metil-11&beta;, 17, 21-triol-3, 20-dion; &ge; % 98 TLC)</td> <td>Steraloidler</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Jambon' s F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 24 oyuklu ImageLock Plakaları</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>IncuCyte Zoom görüntüleme sistemini kullanıyorsanız, hücreleri IncuCyte ImageLock Plakalarına tohumlayın. Bu plakaların, plakanın alt kısmında, sabit bir görüş alanında tekrar görüntüleme için referans olarak kullanılan referans işaretleyiciler bulunur.</td></tr><tr><td>IncuCyte yazılımı</td><td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM sistemi</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td>Scratch test görüntüleri yakalandı ve ön ayar kullanılarak analiz edildi " Çizik Yarası" IncuCyte ZOOM sistemindeki parametreler. Diğer hızlandırılmış mikroskoplar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Matrigel Membran Matrisi</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>Büyüme faktörü azaltılmış, fenol kırmızısı içermez</td></tr><tr><td>Mikro Slaytlar</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin (10.000 birim/mL)/streptomisin (10.000 & mikro; g/mL)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı içermeyen DMEM/Ham's F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Yarı otomatik yara yapıcı alet</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Hücre hareketi bir kritik trophoblasts plasental geliştirme ve erken gebelik sırasında özelliğidir. Uygun Trofoblast göç ve işgal önemini anne damarlara yetersiz Trofoblast işgali ile ilişkili olan gebelik bozuklukları öncesi eklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlama gibi gösterilmiştir. Ne yazık ki, anlayışımızı mekanizmaları hangi plasenta tarafından geliştirir geçiş--dan trophoblasts sınırlıdır. Hücre göç sıfırdan tahlil ile in vitro analiz Trofoblast göçmen kapasitesini düzenleyen etkenler belirlenmesinde yararlı bir araçtır. Ancak, bu tahlil yalnız değişmiş hücre göç neden olabilir hücresel değişikliklerin tanımlamaz. Bu iletişim kuralı topluca Trofoblast hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan üç farklı tüp bebek deneyleri açıklar: sıfırdan tahlil, istila tahlil ve nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil. Burada açıklanan protokoller de bizi canlı tutan hücre hareketinde ölçmek için diğer hücre hatlarında kullanılmak değiştirilebilir. Bu yöntemler müfettişler bireysel faktörler hücre hareketine katkıda bulunmak ve potansiyel mekanizmaları hücre göç belirgin değişiklikler temel alınan bir muayene sağlar tanımlamak olanak sağlar.

Ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları Sw.71 ve HTR-8/SVneo bu deneylerde glukokortikoid Trofoblast hücre geçiş12rolünü belirlemek için kullanılmıştır. Ne alternatif tedaviler kullanılan12olabilir onlar son zamanlarda Trofoblast işlevler, alter gösterilmiştir gibi sebepler bu deneylerde kullanılıyordu. Her iki hücre hatları araç (1 x PBS) veya 100 ile tedavi edilen tüm deneyler için sentetik glukokortikoid deks...

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Bu yöntemler, büyük advers obstetrik sonuçlara ışık tutabilecek trofoplast invazyonunu etkileyen faktörleri belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajı, proliferasyon ve göç de dahil olmak üzere trofoplast invazyonu etkileyebilecek çeşitli faktörlerin görsel ve nicel analizini sağlamasıdır. Çizik teşbine başlamak için, 48 saat içinde %100 biraraya gelmek için uygun sayıda hücreyi 24 kuyulu bir plakaya yerleştirin.Ertesi gün, fenol kırmızı serbest medya ısı inaktive kömür dextran ile desteklenen medya değiştirmek FBS sıyrılmış. Çizik gününde, 30 dakika boyunca hücreleri pretreat her kuyuda ortama istenilen tedavi ekleyin. Düzgün yaralar oluşturmak için, yara makinesi aracının pimlerine steril 10 mikrolitrelik pipet uçları yerleştirin.Uçları kuyuların ilk sırasına indirin ve pipet uçları kuyunun diğer tarafına ulaşana kadar plakayı yara makinesinin izini hareket ettirin. Daha sonra kuyunun çapı boyunca sürekli bir yara sağlamak için plakayı başlangıç pozisyonuna geri taşıyın. İpuçlarını bir sonraki kuyu sırasına indirin ve tüm kuyular çizilene kadar tekrarlayın.Bir mikroskop altında plaka gözlemleyerek çizik kuyunun genişliğini kapsadığını onaylayın. Daha sonra, ortama dikkatlice aspire edin ve hücreleri iki kez 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Son bir yıkama sonrasında, istenilen bir tedavi ile takviye fenol kırmızı ücretsiz sıyrılmış veya düşük FBS medya ekleyin.Daha sonra, 37 derece santigrat sıcaklık ve% 95 nem atmosferinde% 5 karbondioksit içeren bir kuluçka içinde bulunan otomatik bir timelapse görüntüleyici içinde çizik kuyular ile plaka yerleştirin. Hücrelerin yara iyileşmesini tamamlamasını sağlamak için hücreleri gerektiği gibi düzenli aralıklarla görüntüleyin. İstila sınamaya başlamak için, uygun sayıda hücreyi 37 santigrat derece sıcaklık ve %95 nem atmosferinde %5 karbondioksit koruyan bir kuluçka makinesinde altı kuyulu plakaya yerleştirin.Hücrelerin 48 saat içinde %90'a ulaşmasına izin verin. Ertesi gün, fenol kırmızı serbest medya ısı inaktive kömür dextran ile desteklenen medya değiştirmek FBS sıyrılmış. Bir buz üzerinde bir buzdolabı na mililitre ekstrasellüler matris başına 10 miligram bir şişe yerleştirin ve bir gecede çözülmeye izin.Ertesi gün, mililitre başına 10 miligram mililitre başına fenol kırmızıserbest serum serbest medya ile mililitre başına beş miligram son konsantrasyonu için soğutulmuş pipet ipuçları kullanın. Daha sonra soğutulmuş 24 kuyulu plaka yerleştirilmiş soğutulmuş ekler için seyreltilmiş ekstrasellüler matris 100 mililitre ekleyin. Matrisin sertleşebilmesi için plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.İnvazyon tadına göre hücreleri hazırlamak için hücreleri bir mililitre 1x PBS ile yıkayın. Sonra PBS aspire ve her kuyuya 1x Trypsin EDTA 500 mikrolitre ekleyin. Tüm hücreler tabağın altından ayrılana kadar 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit %95 nem atmosferine sahip olan altı kuyulu plakayı kuvöze yerleştirin.Hücreler ayrıldıktan sonra, tripzinli hücrelerin her kuyuya 500 mikrolitre fenol kırmızısı serbest serumsuz ortam ekleyin. Sonra 1,000 mikrolitre müstakil hücreyi mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika aşağı doğru döndürün. Daha sonra, medya aspire ve fenol kırmızı serbest serum serbest ortamda hücreleri yeniden askıya.Hücreleri otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve mililitre başına 0,5 milyon hücrelik son konsantrasyon için hücre süspansiyonunun hacmini ayarlayın. 24 kuyulu plakanın her kuyuya tam büyüme ortamının 600 mikrolitresini ekleyin ve önceden kaplanmış kesici kesici yi içine yerleştirin. Daha sonra, toplam 0,1 milyon hücre için önceden kaplanmış her hücre ucunun üzerine 200 mikrolitre hücre ekleyin.24-iyi plaka 24 saat boyunca% 95 nem atmosferinde 37 derece santigrat sıcaklık ve% 5 karbondioksit korur kuvöz yerleştirin. Gece kuluçkasını takiben, kalan ortamı hücre dışı matrisi bozmadan üst ve alt odalardan emdirin. Daha sonra hücre dışı matrisi ve işgal edilmeyen hücreleri bir pamuklu bezle kesici uçların üst kısmından dikkatlice çıkarın.Kuyunun hem üst hem de alt odalarına 1x PBS ekleyerek her kesici ucu üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra PBS aspire edin. Kesici uçlara bağlı hücreleri onarmak için kesici uçları 30 dakika boyunca 4 derece lik buz gibi metanolün içine yerleştirin.Kesici uçları 1x PBS ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra PBS'yi çıkarın. 10 dakika boyunca% 20 etanol% 0.2 kristal menekşe ile eklere bağlı hücreleri leke. Son yıkamadan sonra deiyonize su ile üç kez durulayın ve deiyonize su aspire edin.Oda sıcaklığında bir saat boyunca hava kuru ekler. Son olarak, forceps ve jilet kullanarak, dikkatle kesici uç alt membran kesilmiş ve alt tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine monte. 20X hedefi olan bir ışık mikroskobu kullanarak, numune başına işgal edilen hücrelerin en az dört benzersiz görüntüsünü elde edin.Proliferasyon ttahminine başlamak için, şişedeki trypsed hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Tohum hücreleri standart büyüme ortamlarında her biri 0,2 milyon hücre yoğunluğunda altı kuyulu plakalara dönüşür. Daha sonra hücreleri, 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit imuhafaza eden hücreleri dört saat boyunca veya hücreler yapışana kadar %95 nem atmosferinde yerleştirin.Daha sonra, ısı inaktive kömür dextran fbs ve istenen tedavi sıyrılmış ile desteklenen fenol kırmızı serbest medya için medya değiştirin. %95 nem atmosferinde 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit tutan altı kuyulu plakayı kuvöze yerleştirin. Daha sonra her 48 saatte bir istenilen tedavi ile desteklenen taze medya ile medya değiştirin.24, 48 veya 72 saatlik tedaviden sonra hücreleri bir mililitre 1x PBS ile yıkayın ve her kuyuya 500 mikrolitre Trypsin EDTA ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar altı kuyuluk bir plakayı kuvöze yerleştirin. Hücreler plakadan ayrıldıktan sonra, Trypsin'i devre dışı bırakmak için eklenmiş fenol kırmızısı serbest ortam500 mikrolitre ekleyin.Son olarak, trypsed hücrelerin beş mikrolitre trypan Mavi ayrı bir tüp içinde beş mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Yinelenen her kuyudaki hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Ölümsüzleştirilmiş insan ilk trimester trophoblast Kuğu.Sıfır, sekiz ve 18 saat boyunca sıfır, sekiz ve 18 saat boyunca, sıfır da sayılma da sentetik glukokortikoid deksametazon 100 mikromolar ile tedavi edildi. Kuğu'daki yara büyüklüğünün ve yara yoğunluğunun ölçümü. 71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç veya 100 nanomolar deks ile tedavi glukokortikoidlerin hücre göçlerini inhibe edebileceğini gösteren yara kapatma oranını azalttığını göstermiştir.İstila yıprandısonra, glukokortikoid tedavisi, işgal edilen Kuğu sayısında %15'lik bir azalma ile gösterildiği gibi hücre invazivliğini azalttı. 71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç ile tedavi edilen hücrelere göre 24 saat boyunca 100 nanomolar deks ile tedavi edilir. Hücre proliferasyon sabunu sonrasında, glukokortikoid tedavisi daha az Kuğu tarafından belirtildiği gibi hücre çoğalmasını azalttı.71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç ile tedavi edilen hücrelere göre 100 nanomolar deks ile tedavi edilir. Hücre ölümünü değerlendirme yöntemleri, apoptoz veya nekrozun değiştirilmiş trofoblast fonksiyonlarına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için bu prosedürle birlikte kullanılabilir. Biz benzersiz trophoblast fonksiyonunun çalışması için rutin kanser biyolojisinde kullanılan standart tekniklerin kullanımını benimsemiştir.Bu yöntemlerle ilişkili herhangi bir tehlike yoktur. İzleyicilerin alması gereken tek önlem doku kültürü için steril teknik kullanmaktır.

in-vitro-assays-to-evaluate-migration-invasion-proliferation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Geleneksel iki boyutlu hücre kültür teknikleri genellikle farklılaşma belirteçleri, sitokinler ve büyüme faktörleri açısından değişmiş özellikleri. Extravillous trofoblast hücre hattı ile burada gösterildiği gibi dönen hücre kültür sistemi Üç boyutlu hücre kültürü (RCC), bu faktörlerin çoğunun ifade yeniden kurar.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Mevcut protokol, trofoblast hücreleri gibi hücrelerin, hücre dışı bazal membran matrisinin bir tabakası üzerinde kılcal benzeri yapılar halinde organize olduğu klasik in vitro anjiyogenez-tüp oluşum testinde oluşan tüp benzeri yapıların geri kazanılmasına izin verir. Geri kazanılan yapılar, çeşitli biyokimyasal analizler için RNA ve protein izolasyonu için kullanılır.

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Öğrenin, insan trofoblast hücrelerinin göç, işgal ve proliferasyon davranışlarını değerlendirmek için scratch, transwell ve hücre çoğalma testlerini. Bu yöntemler obstetrik sonuçları anlamak için görsel ve nicel analiz sağlar.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet