Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Bu protokol, mikrobiyoreaktörlerden elde edilen sınırlı numunelerin analizini ele alarak ürünlerin kritik kalite özellikleri hakkında hayati bilgiler edinimi ele almıştır. Bu tekniklerin bir diğer avantajı da, üretilen ürünün kalite parametrelerini belirleyen temel öznitelikleri belirlemek için en az analiz süreleri kullanmalarıdır. Gösteri prosedürü David Powers, Talia Faison ve Phillip Angart olacak.

Arıtma sistemine bağlı yazılım açarak ve saflaştırılmış antikor eluate ve 50 mililitre konik tüpler fraksiyon toplayıcı içine yüksek tuz yıkama sırasında akış toplamak için toplamak için 15 mililitre konik tüpler yerleştirerek başlayın. Daha sonra, 0.22 mikrometre gözenek filtrelenmiş hücre kültür sıvısı kapaklı bir meme ile boş bir 12 mililitreşlik şırınga ekleyin. Kapağı çıkardıktan sonra, şırınga nozülünü arıtma sisteminin manuel enjeksiyon noktasına takın.

Şırıngayı yerinde sıkmak için bükün ve numunenin tüm hacmi enjekte edilene ve ekli 10 mililitrelik büyük hacimli numune döngüsünde görünene kadar pistonu bastırın. Kaydedilen yöntemi seçin ve enstrüman yazılımı tarafından istendiğinde Çalıştır'ı tıklatın. Tüm antikor atlatıldığında, saflaştırılmış proteini bir azı tris tabanı yla hemen nötralize ederek yaklaşık 5,5 pH'ya indirin.

Arınmış antikorsantrikasyon ile konsantre etmek için, filtrasyon toplama tüpleri içine 100 kilodalton filtreler yerleştirin. Filtreleri 500 mikrolitre çift distile su ile yıkayın, sonra santrifüj. Filtreyıkamayı iki kez tekrarlayın.

İkinci yıkamadan sonra, filtrasyon atın ve yeni santrifüj tüpleriçin durulanmış filtreler aktarın. Ardından, santrifüj için her filtreye 500 mikrolitre numune ekleyin. Döndürmenin sonunda, son bir santrifüj le konsantre numuneyi elde etmek için filtreyi yeni bir toplama tüpüne ters çevirin.

N-glikan etiketleme ve izolasyon için, her konsantre antikor örneğinin 7,5 mikrolitre seyreltin. 15.3 mikrolitre sıvı kromatografi kütle spektrometresi veya lCMS dereceli su ile bir mililitretüpler kit, ve dennature antikorlar ile bir enzim dostu ve kütle spektrometresi dostu yüzey aktif üç dakika için 90 santigrat derece bir enzim dostu ve kütle spektrometresi dostu bir% 5 çözeltisi altı mikrolitre ile antikorlar. Denatürasyon sonunda, 50 santigrat derecede beş dakikalık bir kuluçka için peptid N-glikosidaz F 1.2 mikrolitre eklemeden önce üç dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Numuneleri oda sıcaklığına kadar üç dakika soğuttuktan sonra, numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca susuz dimetilformamid içinde çözünmüş 12 mikrolitre floresan etiketleme reaktifi ile etiketleyin. Kuluçka sonunda, etiketli N-glikan karışımını 358 mikrolitre asetonitil ile seyreltin ve bir hidrofilik etkileşim kromatografi plakasını şimler ve atık tepsisi ile bir vakum manifolduna yerleştirin. Sıvının hidrofilik etkileşim kromatografi rekarnesinin geçmesi 15 ila 30 saniye sürer emin olmak için vakum 10 ila 15 kilopascals ayarlanmış vakum ile 200 mikrolitre su ile kuyular koşul.

Her bir kuyuya her bir glikan karışımının 400 mikrolitresini yüklemeden önce 15 ila 30 saniye boyunca %85 asetonitile 200 mikrolitre ile kuyuları dengeleyin ve her yeni sıvı eklendikten sonra vakum uyguluyor. Tüm numuneler eklendiğinde, reçineyi 600 mikrolitre 1%formik asit ve yıkama başına %90 asetonitit ile iki kez yıkayın ve atık tepsisini 600 mikrolitrelik toplama tüpleri ile değiştirin. Daha sonra üç adet 30 mikrolitrelik spektrometre elüsyonu tamponu ile etiketlenmiş N-glikanlardan elude ve havuz seyreltmelerini 310 mikrolitre dimetilformamid ile seyreltin.

Bir floresan dedektörü ve uçuş kütlesi spektrometre dört zaman birleştiğinde bir ultraperformance sıvı kromatografi sistemi üzerinde etiketli N-glisan elution örnekleri analiz etmek için, mobil aşamaları için 50 milimolar amonyum formatı ve% 100 LCMS dereceatontrile kullanın. Başlangıç akış hızını dakikada 0,4 mililitreye ayarlayın ve LC gradyanı elüsyon aşamasında artan amonyum formatı sağlar. Floresan dedektörünü 265 nanometre uyarma ve iki hertz örnekleme hızıile 425 nanometre lik bir emisyon ölçmek için ayarlayın.

100-2, 000 Dalton arasında bir kütle aralığı, 0,25 saniyelik bir tetkik süresi ve sürekli veri toplama ile MS1-pozitif iyon duyarlılık moduna dört kez uçuş süresini ayarlayın. Ardından örnekleri 10 santigrat dereceye ayarlanmış otomatik numune ye yükleyin ve yüklenen yöntemi çalıştırın. Şarj varyant analizi için bir numuneyi tuzdan arındırmak için, 0,5 mililitrelik tuzsuzlama sütununun alt stoperini koparın, üst stopergevşetin ve tuzsuzlama sütununu 1,7 mililitrelik centrifuge tüpüne yerleştirin.

Yeni kolonu yeni bir mikrosentrifüj tüpüne aktarın ve sütunun üst kısmına mililitre antikor çözeltisi başına 3,5 miligramlık 80 mikrolitre ekleyin. Sütunu özgün yönlendirmeye hizalayın ve sütunu santrifüj edin. Daha sonra tuzsuzma sütununa atın ve konsantre numuneyi iyice karıştırın.

Numuneyi 96 kuyulu bir plakanın tek bir kuyusunda 25 mikrolitre ultrasaf suda mililitre başına iki miligram konsantrasyona seyreltin ve kuyuya beş mikrolitre etiketleme tamponu ve beş mikrolitre etiketleme reaktifi ekleyin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, 60 mikrolitre reaktif dereceli suyu numuneyle karıştırın ve plakayı santrifüj için bir plaka mührü ile kaplayın. Şarj varyant yongasını hazırlamak için depolama çözümünü çıkarın ve 1, üç, dört, yedi, sekiz ve 10 numaralı kuyuları suyla yıkayın.

Suyu pH 7.2 çalışan tampon ile değiştirin ve tampon tüpüne 750 mikrolitre çalışan tampon ekleyin. Cihaz kullanıcı arabirimindeki Plakayı Boşalt'a basın ve mührü 96 kuyuluk plakadan çıkarın. Plakayı ve tampon tüpü GX2 numune tepsisindeki belirtilen noktalara takın ve Yük Plakası'na basın.

Çipi talaş odasına yerleştirin, kapağı talaş odasına kapatın, istendiğinde HT protein şarj ı varyant tonu'nu seçin ve Çalıştır'ı tıklatın. Hasat edilen hücre kültürü örneğinin otomatik mikro ölçekli biyoreaktörden hızlı protein sıvı kromatografisi ile saflaştırılması, saflaştırılmış proteinlerin kritik kalite niteliklerinin çeşitli aşağı analitik yöntemlerle karakterizasyonuna olanak sağlar. Kitle spektrometresi ile işlenen Çin hamster yumurtalık üretilen monoklonal antikorlar N-glikan verileri bu temsili kromatogramlar benzer görünmelidir.

Antikorların toplama profilini ve molekül ağırlığını değerlendirmek için boyut dışlama kromatografisi çoklu açı ışık saçılımı kullanılabilir. Numunenin küçük miktarı ve agregasyonun önemi, bu tekniği otomatik mikrobiyoreaktör sistemi için son derece değerli bir tamamlayıcı analitik araç haline getirmek için kritik kalite özellikleridir. Mikro kapiller zon elektroforez sonucu bir elektroferogram ve bir monoklonal antikor için şarj varyant profili göstermek için kullanılabilir, faaliyet pH son derece duyarlı olan incelenen protein için benzersiz bir imza.

Amino asit tüketimi de tükenmesi antikor kritik kalite özellikleri değişikliklere neden olup olmadığını belirlemek için izlenebilir. Analitik adımlar sadece düzgün saflaştırılmış bir protein ile gerçekleştirilebilir gibi, üretilen ürünün düzgün ve verimli bir saflaştırma sağlamak için önemlidir. Ürün ayrıca peptit haritalama ve stabilite testine tabi tutulabilir.

Ama bir kez protein bir karakterizasyon yöntemi için kullanılan, genellikle başka bir için kullanılamaz. Bu teknikler, biyoişleme parametrelerinin ürün kalitesi üzerindeki etkisini anlamak için küçük hacimli, yüksek üretim biyoişleme tarama platformlarından üretilen ürünlerin analizini sağlar. Bu tekniklerden bazıları konsantre perklorik asit, formik asit, N-dimethylformamide, hepsi tehlikelidir ve uygun koruyucu ekipman giyerken dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.