Name: Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Keşfedin canlı hücrelerde protein biyosentezini analiz etmek için radyoaktif darbe-chase yöntemini. Bu hassas teknik, protein katlanması, taşıma ve bozulma kinetiğini zamana bağlı olarak incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar geçmiş Braakman Lab, tüm üye teşekkür ve, onların verimli tartışmalar için mevcut ve bu makalede sunulan yöntemleri geliştirmede yardımcı. Bu proje Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) N ° 235649 altında ve Hollanda organizasyon, bilimsel araştırma (NWO) ECHO programı N ° 711.012.008 altında fon aldı.

Tüm radyoaktif reaktifler ve yordamlar yerel Utrecht Üniversitesi radyasyon kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde ele.
1. darbe Chase
<ol><li>
Nabız Chase yapışık hücreleri için Not: burada verilen birimleri 60 mm hücre kültür yemekleri üzerinde temel alır. 35 mm veya 100 mm yemekleri için birimleri tarafından 1/2 ya da 2, sırasıyla çarpın. Bu iletişim kuralı 0, 15, 30, 60, 120 ve 240 min 10 dk ve chase kez darbe zamanı kullanır. Bunlar belirli proteinler (Aşağıda tartışılan) okudu bağlı olarak farklı olabilir.<ol>
<li>Böylece onlar olacak altı 60 mm hücre kültür yemekleri tohum yapışık hücreleri (Örneğin, HEK 293, HeLa, CHO) subconfluent (% 80-%90) nabız chase gününde. Zaman noktası ve/veya koşulu başına en az bir tabak kullanın.</li>
		<li>Gerekirse, üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan transfection reaktifler hücrelerle transfect; veya virally hücreleri ifade için uygun yapı ile nabız-chase önce 1 gün deneme8 transduce.</li>
		<li>Bulaşık yıkama arabelleği (Hank'in dengeli tuz solüsyonu [HBSS]) 2 mL ile açlık Orta (normal kültür metionin ve sistein ve fetal Sığır serum [FBS], metionin ve sistein olmadan en az gerekli orta [MEM] gibi eksik Orta 2 mL ekleyin Ama 10 mM HEPES, pH 7.4 ile) ve bulaşıkları bir 37 ° C oksijen kuluçka makinesi %5 CO2 ile 15 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Böylece onlar su ile temas ancak değil float bulaşıkları raflar prewarmed 37 ° C su banyosu içinde aktarın. Bir sayacı başlatmak.</li>
		<li>40 s, açlık orta Aspire edin, darbe çözüm (açlık medya + etiket, adım 1.1.1 önceki nota bakın 55 µCi/35 mm çanak) 600 µL kadar çizmek pipet içine ve yavaşça yemeğin ortasına doğru tam olarak 1 dakika tekrar bu adımı t için 1 dk aralıklarla ekleyin o kalan yemekleri. Denemeniz sırasında zaman kazanmak için en uzun kovalamaca örnek ile başlayın. Not: radyoaktif madde ele alırken, uygun önlemler ve yerel kurallar ve düzenlemeler kazayla maruz kalma ve/veya kontaminasyonu önlemek için takip için gerekli olduğunu.</li>
		<li>Tam olarak 11 dk ve 0 dk chase örnek dışında tüm aşağıdaki yemekleri için doğrudan yemek için chase Orta 2 mL ekleyin, bu Aspire edin ve tekrar, chase Orta 2 mL ekleyin. 1 dk aralıklarla kalan yemekler için bu adımı yineleyin. Tüm yemekler 37 ° C kuluçka aktarın.</li>
		<li>Tam olarak 16 dk chase Orta 2 mL ekleyin (normal kültür orta + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM sistein ve 5 mM metionin) 0 dk örnek yemek üstüne etiketleme; durdurmak için nabız orta için doğrudan o zaman, hemen Aspire edin, çanak için soğutmalı alüminyum plaka aktarmak ve buz gibi dur arabellek (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]) 2 mL ekleyin. Not: 0 dk chase örnek bu. Bu örnek için doğrudan 1.1.9 adım geçin.</li>
		<li>Her chase yemeğin geri su banyosu için 2 dk önce her chase zaman (Örneğin, bir 15dk chase için 24 dk) aktarmak ve, tam chase zaman (Örneğin, bir 15dk chase için 26 dk), chase medya Aspire edin (veya pr takip microcentrifuge tüp aktarmak Otein salgılanması) ve bir soğutulmuş alüminyum tabak çanak transfer. Buz gibi dur arabellek 2 mL ekleyin.</li>
		<li>Tüm yemekler buz durağı arabellek ≥5 min için kuluçkaya; o zaman, durmak eriyik Aspire edin ve buz gibi durmak eriyik 2 mL ile yıkayın. Yıkama Aspire edin ve yemekleri ile lizis arabelleği 600 µL parçalayıcı (fosfat tamponlu tuz [PBS] + nondenaturing deterjan [bkz: Malzemeler tablo] + proteaz inhibitörleri + 20 mM NEM). Bulaşıkları kantitatif lysed emin olmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
		<li>Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 15.000-20.000 x g , 10 min ve 4 ° C çekirdekleri cips.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nabız Chase süspansiyon hücreler için Not: verimli etiketleme emin olmak için hücreleri bir konsantrasyon 3 x 106 5 x 106 hücre/ml, Geniş puls ve chase birimleri 4 x nabız cilt olmalıdır. Aşağıdaki örnekte, 5 x 106 hücre 10 dk 1 ml hacminde Geniş puls, verim için beş saat chase puan (0, 15, 30, 60 ve 120 dk) 1 ml 1 x 106 hücreler her zaman noktası içeren. Tüm çözümler Bölüm 1.1 ile aynıdır.<ol>
<li>Böylece hücreleri yeterli sayıda deneme, zaman zaman başına en az 1 x 106 hücre üzerine gelin ve/veya durumu (Örneğin, 3T3, Jurkat) daha önce yayımlanan Protokolü9 göre süspansiyon hücre kültür.</li>
		<li>Gerekirse, üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan transfection reaktifler hücrelerle transfect veya virally hücreleri ifade için uygun yapı ile nabız-chase önce 1 gün deneme8 transduce.</li>
		<li>5 x 106 hücre başına 50 mL tüp durumda vasıl 250 x g oda sıcaklığında 5 min için cips, onları yıkamak ile açlık medya, 5 mL 1 x onları tekrar cips ve onları açlık medya 1 mL resuspend.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C su banyosu aktarmak ve alt kısmında yerleşme hücreleri önlemek için her 10-15 dk tüpler 10-25 dk. kışkırtmak için onları kuluçkaya.</li>
		<li>Sayacı başlatmak. Tam olarak 1 dk, hücreleri içeren tüp doğrudan 275 µCi (55 µCi/1 x 106 hücreler) su katılmamış etiket eklemek ve karıştırmak için girdap. Not: radyoaktif madde ele alırken, uygun önlemler ve yerel kurallar ve düzenlemeler kazayla maruz kalma ve/veya kontaminasyonu önlemek için takip için gerekli olduğunu.</li>
		<li>Tam olarak 11 dk chase medya 4 mL ekleyerek etiketleme durdurmak. Örnek karıştırın ve hemen 1 mL 15 mL tüp buz, buz gibi durmak eriyik 9 mL içeren transfer. Not: 0 dk chase örnek bu.</li>
		<li>Her bir her başarılı zaman nokta için bu adımları yineleyin. Bir kez tüm zaman puan topladı, 250 x g 4 ° C'de 5 dakika için hücreleri cips Orta Aspire edin (veya protein salgılanması takip için yeni bir 15 mL tüp aktarmak). 5 mL durak çözüm de hücrelerle yıkama ve 250 x g 4 ° C'de 5 dakika için hücreleri cips</li>
		<li>Durmak eriyik Aspire edin, tamamen buz gibi lizis arabelleği 300 µL içeren hücreleri parçalayıcı ve onları tam lizis sağlamak için buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 15.000-20.000 x g çekirdekleri cips için 4 ° c de 10 dakika.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunoprecipitation
<ol><li>Antikor birleştirmek (konuya bakın) ve 50 µL immunoprecipitation boncuk (örneğin, protein A-Sepharose) (% 10 süspansiyon [v/v] lizis arabellek + %0.25 Sığır serum albümin [BSA]) bir microcentrifuge içinde tüp ve onları 4 ° c ~ 30 dk bir shaker için kuluçkaya.</li>
	<li>Boncuk, 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için cips ve süpernatant Aspire edin. Lysate, 200 µL antikor-boncuk karışıma ekleyin ve bir shaker 1s veya baş-over 4 ° C'de immunoprecipitation gerektiriyorsa, kuluçkaya > 1 h.</li>
	<li>Boncuk, 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için cips. Süpernatant Aspire edin ve immunoprecipitation yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Bir shaker oda sıcaklığında 5 min için örnek bir yer.</li>
	<li>2.3. adımda açıklandığı gibi boncuk cips ve yıkama tekrar 1 x. Daha sonra süpernatant Aspire edin ve boncuk TE arabellek, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 20 µL içinde resuspend. Girdap örnek.</li>
	<li>2 örnek arabellek olmadan indirgeyici, x 20 µL eklemek girdap, 95 ° C ve girdap 5 min için tekrar ısı. Not: 500 mm DTT 2 µL azalan bakiyeli örnekleri hazırlama yalnızca, bu noktada eklenmelidir. O zaman, 2.7 adıma geçin.</li>
	<li>Boncuk 2.3 adımda anlatıldığı gibi cips. 500 mm DTT 1 µL içeren bir taze microcentrifuge tüp nonreduced süpernatant ile 19 µL aktarmak, örnek ve girdap santrifüj kapasitesi 95 ° C'de 5 min için tekrar ısıtma daha önce.</li>
	<li>Spin aşağı 12.000 x g, 1 dk. için örnek; azaltılmış örnek bu. Aşağı oda sıcaklığına kadar serin ve 1 m NEM 1.1 µL hem azalır ve nonreduced örnek ekleyin. Girdap ve örnekleri aşağı spin.</li>
</ol>3. SDS-SAYFA
<ol><li>Önce uygun SDS-sayfa çözme jel yüzdesini protein için faiz belirleyin. Örneğin, HIV-1 gp120, ne zaman deglycosylated, ~ 60 kDa çalışır ve % 7.5 jel içinde analiz edilir.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerine göre TEMED olmadan çözme jel karışım hazırlamak (% akrilamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] % 0,1 SDS [w/v], x ve % 0.05 amonyum Persülfat [APS] [w/v]) ve için vakum altında degas > 15 dak. Jel karışım gaz giderme iken, iyice jel cam plakanın % 70 etanol ve hav bırakmayan dokular ile temiz ve bir döküm aparatı koyun.</li>
	<li>TEMED (at %0,005 [v/v] son bir konsantrasyon) çözme jel karışımı ekleyin, iyice karıştırın ve cam plakanın istifleme jel için ~1.5 cm boşluk bırakarak arasında pipet. Dikkatle deiyonize H2O veya isopropanol ile jel kaplama ve polimerize için bırakın.</li>
	<li>Sonra çözme jel polimerli, yığın jel karışım hazırlamak (%4 akrilamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], % 0,1 SDS [w/v] ve % 0,025 APS [w/v]).</li>
	<li>Çözme jel deiyonize H2O ile üst floş ve tüm su kaldır. Not: filtre kağıdı son damla kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>TEMED yığın jel karışımı (%0,005 [v/v]) ekleyin, iyice karıştırın ve yığın jel ile çözme jel kaplama ve bir 15-iyi tarak yerleştirin. Yığın jel polimerli bir kez çalışan bir odasına aktarmak ve tampon çalıştıran ile alt ve üst odaları doldurmak (25 mM Tris-HCl, 192 mM glisin [pH 8.3] ve % 0.1 SDS [w/v]).</li>
	<li>Örnek 15-lane minigel şeritte başına 10 µL yükleyin. İlk örnekleri ve jel son Lane'de yüklenmesini önlemek ve nonreducing örnek arabellek grup gülümseyen engellemek için tüm boş şerit yük. Boya açık jel alt kısmında olana jelleri bir 25 mA/jel sabiti çalıştırın.</li>
	<li>Jelleri cam plakanın kaldırmak için çözüm protein boyama ile jelleri leke (% 10 asetik asit ve % 30 metanol H2O + %0.25 parlak mavi R250 [w/v]) ile ajitasyon, 5 min için ve sonra 30 dk (boyama çözüm destaining ile destain çözüm olmadan parlak mavi R250).</li>
	<li>Jelleri aşağı dönük bir plastik wrap ve görüntülenmemesini 0.4 mm Kromatografi kağıt üstünde tepe-in onları düzenleyin. Jel sandviç Kromatografi kağıt tarafında bir jel kurutma makinesi yerleştirin. Üreticinin yönergeleri izleyerek, 80 ° C'de 2 h için jeller Kuru</li>
	<li>Kurutulmuş jelleri bir kaset için transfer ve onları autoradiography film ya da fosfor ekran yerleşimi. Autoradiography film kullanıyorsanız, bu adımı karanlık bir odada gerçekleştirilmelidir.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Nabız-chase yöntemleri protein sağlam hücreleri katlama bilim adamlarının anlayış geliştirmek için gerekli olmuştur. Biz mümkün olduğu kadar genel bir yöntem sağlamak teşebbüs ederken, bu yaklaşım katlanır, taşıma ve yaşam proteinlerin hücre içinde sırasında oluşan çeşitli işlemleri incelemek neredeyse sınırsız varyasyonları için potansiyele sahiptir.
Yemekleri yapışık hücreleri kullanarak bir darbe takip gerçekleştirirken, aynı ayrı tabak olarak mümkün olduğu kadar her zaman noktası ve/veya k...

Hatta nispeten basit protein katlama birçok farklı katlama enzim, moleküler chaperones ve kovalent modifikasyon1içerir. Bu işlemler vitro tam bir sulandırma farklı bileşenleri dahil çok sayıda göz önüne alındığında pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, in vivo, canlı hücrelerde katlama protein çalışmaya son derece arzu edilir. Radyoaktif nabız-chase teknikleri sentezi, katlama, taşıma ve proteinlerin kendi doğal ortamlarında bozulma çalışmak için güçlü bir araç kanıtlamak.
Metabolik 35S etiketli metiyonin/Sistein ile kısa bir darbe sırasında proteinlerin etiketleme, radyoaktif bir etiket yokluğunda bir kovalamaca ardından, daha geniş hücresel ortamında yeni sentezlenmiş protein bir nüfusun belirli izlenmesini sağlar. Sonra hedef proteinler ve üzerinden SDS-sayfası veya diğer tekniklerle analiz izole yolu ile immunoprecipitation olabilir. Çoğu protein için onların yolculuk boyunca hücre SDS-sayfa jel üzerinde görülebilen değişiklikler tarafından işaretlenir. Örneğin, taşıma glikozile proteinlerin endoplazmik retikulum (ER) üzerinden Golgi kompleksi kez glukanlardir N bağlı değişiklikler veya ek O bağlantılı glukanlardir2,3tarafından eşlik ediyor. Bu değişiklikler büyük artışlar SDS-sayfa hareketlilik değişiklikler görülebilir belirgin molekül ağırlığı neden. Olgunlaşma, sinyal peptid bölünme veya pro-peptidler, değişiklikleri kolayca SDS-sayfa jel4üzerinde takip edilmesi belirgin molekül ağırlığı sonuçlanan kaldırılması gibi proteolitik kesim tarafından da işaretlenebilir. Radyoaktivite vardır sikloheksimit çarpma gibi karşılaştırılabilir teknikleri üzerinde önemli avantajlar olarak daha uzun tedaviler hücrelere zehirlidir ve büyük, kararlı durum proteinler çoğunluğu dışlamayın nerede roman protein sentezi, engellenir Analizi, bazı proteinler yarım-gün canlıdır. Proteinler nonreducing her ikisi de altında karşılaştırılması ve koşulları azaltmak sağlar analiz disülfit bağı oluşumu, birçok salgı proteinler4,5,6, katlanır önemli bir adım 7.
Burada biz bir radyoaktif nabız-chase yaklaşım kullanarak protein katlanması ve sağlam olan hücrelerde taşıma analizi için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi olarak sağlamak amaçlanmıştır iken mümkün olduğunca ayrıntılı protokol adaptasyon için neredeyse sınırsız bir potansiyele sahiptir ve optimizasyon her okuyucunun spesifik proteinlerin çalışmaya izin verir.
İki alternatif darbe-chase protokol, bir yapışık hücreleri (adım 1.1 burada sunulan Protokolü) ve süspansiyon hücreleri (adım 1.2 burada sunulan Protokolü) için sağlanır. Koşulun sağlanması halinde burada orta-yüksek ifade düzeyleri ile ifade edilen bir protein görselleştirmek yeterli vardır. Eğer okuyucu kötü ifade proteinler veya birden çok immunoprecipitations gibi çeşitli posttreatment koşulları ile çalışma çanak boyutunu artırın veya uygun şekilde sayı hücre gereklidir.
Süspansiyon darbe chase için her zaman noktada alınan chase örnekler tüm hücreleri tek bir tüp alınır. Darbe ihmal sonra yıkama adımları; Bunun yerine, daha fazla 35S birleşmesiyle etiketlenmemiş metionin ve sistein yüksek bir fazlalığı ile seyreltme tarafından engellenir.
Hücresel protein katlanması işlemlerini takip için radyoaktif 35S etiketli sistein ve metionin sunulan iletişim kurallarını kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri herhangi bir operatör ve radyoaktif Radyasyon ortamına maruz en aza indirmek ve belirlenmiş bir laboratuarda gerçekleştirilen uygun koruyucu önlemleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Nabız-chase teknik etiketleme kısa darbe zamanlarda nispeten verimsiz (< 15dk), radyoaktivite başlangıç miktarı % 1'i yeni sentezlenmiş protein dahil daha az. Üzerinden hedef protein immunoprecipitation zenginleştirme sonra radyoaktivite başlangıç miktarı daha az % 0.05 SDS-sayfa için örnek içerir.
35S metionin ve mix etiketleme sistein stabilize rağmen bazı ayrıştırma radyoaktif uçucu bileşikler, verimli, ortaya çıkar. Araştırmacı ve aparatı korumak için bazı önlemler alınmalıdır. Araştırmacı her zaman yerel radyasyon güvenlik kurallarına itaat etmelisin ve maske, önlük ve eldiven (Çift Kişilik) yanı sıra hemşirelik kömür olabilir. Hisse senedi şişeleri 35S metionin ve sistein ile her zaman bir duman başlıklı veya yerel aspirasyon noktası altında açılmalıdır. Bilinen laboratuvar kirlenme Santrifüjler Pipetler, su hamamlar, kuluçka ve shakers noktalardır. Bu alanların kirlenme pipet ipuçlarını kullanarak bir kömür filtre, pozitif-mühür microcentrifuge tüpler ( Tablo malzemelerigörmek), akvaryum kömür sünger nabız-chase yemekleri yapıştırılmış su banyoları, kömür filtre gazetelerde azalır, aspirasyon sistemi ve bulaşık kuluçka ve saklama kapları kömür tahıl içeren yerleşimini kömür muhafız.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL safeseal mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>buzlu asetik asit</td></tr><tr><td>BAS Depolama fosfor ekranı 20x25 cm</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Mavi</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR filmleri</td><td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü ortamı</td><td>Çeşitli</td><td>N/A</td><td>Kullanılan belirli hücre hatları için normal hücre kültürü</td></tr><tr><td>ortamı Hücre kültürü ortamı, metiyonin/sistein içermez</td><td>Çeşitli</td><td>N/A</td><td>Normal kültür ortamıyla aynı ortam formülasyonu, örneğin DMEM/MEM/RPMI, metiyonin ve sistein içermez</td></tr><tr><td>Kömür filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Kömür filtreli pipet uçları</td><td>Moleküler biyoürünler</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Kömür vakum koruyucu</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>elektroforez için</td></tr><tr><td>Sistein</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı, 500 mM stok yapın, -20&nbsp'de saklayın;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Protein Etiketleme Karışımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Kullanıma bağlı olarak diğer boyutta etiket grupları mevcuttur</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Jel kurutma ekipmanı</td><td>Çeşitli</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>3. sınıf kromatografi kağıdı</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes hassas görev mendilleri</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0490 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metiyonin</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı, 250 mM stok yapın, -20'de saklayın</td></tr><tr><td>Minigel döküm / koşu ekipmanı</td><td>Çeşitli</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>N-etilmaleimid</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı,% 100 etanolde 1M stok yapın, -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma'da</td> saklayın<td>P5368</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Protein-A Sefaroz hızlı akışlı boncuklar</td><td>GE sağlık hizmeti</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Trizma bazı (Tris)</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td>Typhoon</tr><tr><td>IP Biyomoleküler görüntüleyici</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire Test Tüpü Rafı 20 mm su banyosu için</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe chase tarafından bozulması analizi

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radyoaktif nabız-chase etiketleme eğitim konformasyon olgunlaşma, taşıma fonksiyonel hücresel konumlarını ve hedef proteinler canlı hücrelerde bozulma için güçlü bir araçtır. Kısa (darbe) radiolabeling kez kullanarak (< 30 dk) ve sıkı kontrol chase kere, toplam protein havuzu yalnızca küçük bir kısmını etiket ve onun katlama izleyin mümkündür. Nonreducing/azaltılması SDS-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve immunoprecipitation (özel biçimi) antikorları ile birleştirildiğinde, süreçleri katlama ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu sistem özellikleri çözünür protein, tekli ve çoklu geçiş transmembran proteinler, ağır N ve O glikozile proteinler gibi büyük bir varyasyon ile protein ve protein ve geniş disülfür olmadan Katlama çözümlemek için kullanılan bağ. Nabız-chase yöntemleri co ve ardından değişiklikleri, Oligomerizasyonda ve polimerizasyonu, temelde analiz bir protein doğumdan ölüme izin dahil olmak üzere ek özellikleri bir dizi içine kinetik çalışmalar temelidir. Nabız-chase çalışmalar protein katlanması üzerinde çalışmak için proteinler vitro artan zamansal çözünürlük ve fizyolojik bilgi sağlayarak diğer Biyokimya ve biyofizik yöntemleri ile tamamlayıcı niteliktedir. Bu kağıt içinde açıklandığı gibi yöntemleri kolayca neredeyse memeli ya da böcek-hücre sistemlerinde ifade edilebilir herhangi bir protein katlama çalışmaya adapte.

Katlama ve HIV-1 gp120 bir yapisan darbe chase üzerinden salgılanmasını Şekil 2' de gösterildiği. Nonreducing jel (şekilde hücreleri NR) oksidatif gp120 katlama gösterir. Nabız hemen sonra 5 dk (0 dak chase) gp120 etiketleme diffüz grup jel içinde daha yüksek olarak görünür ve chase ilerledikçe grup jel ile aşağı daha da sıkı grup (NT) birikir kadar ara ürün (BT) katlanır yayılmış geçirir Yerel olarak katlanmış gp120 temsil eder. Disülfür bağları oluşumu tam ...

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

35 S etiketli metiyonin ve sistein kullanılarak yapılan radyoaktif darbe takibi, canlı hücrelerde zamanla protein biyosentezini araştırmak için hala tek biyokimyasal yöntemdir. Protein biyosentezi hem çeviri, katlama ve montaj, hem de insan ticareti ve bozulmayı kapsar. Radyoaktif darbe kovalamacasının disülfür bağı oluşumu ve asetilasyon gibi ortak ve post-çeviri sonrası protein modifikasyonlarının analizi ile birleştirilmesi, proteinin inancını zamanla araştırmak için hassas ve nicel bir tahlil sağlar.Bu işlem için iyi bir odaklanma ve deneysel kullanım gereklidir. İyi hazırlık tamponlar, radyoaktif çalışma alanı ve net bir program gibi çok önemlidir. Bu video radyoaktif darbe kovalamaca protokolüomuz görünümü üzerinde net sağlar.Prosedürü gösteren Hui Ying Yeoh, bizim laboratuvar bir pHd adayı olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, tohum transfect ve kültür hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi. Nabız takibinden önce, hücrelerini mikroskoptan inceleyin.Daha sonra, yıkama tampon iki mililitre ile bulaşıkları yıkayın. Ve hücrelere iki mililitre açlık orta ve 15 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde bulaşıkları yerleştirin. Nabız takibinizin düzenli olduğundan emin olun.37 santigrat dereceönceden ısıtılmış su banyosunda raflara bulaşıkları aktarın. Bulaşıkların suyla temas halinde olduğundan emin olun, ancak yüzme. O zaman bir zamanlayıcı başlatın.40 saniye, açlık ortamını aspire edin. Bir mikro pipet kullanarak, 600 mikrolitre darbe çözeltisi çizin. Tam bir dakika, yavaşça çanak merkezine darbe çözeltisi ekleyin.Açlık ortamını ortadan kaldırmak ve kalan yemekler için darbe çözeltisini bir dakika aralıklarla ekleyerek bu işlemi tekrarlayın. Tam olarak 11 dakika ve tüm aşağıdaki yemekler için, nabız kovalamaca düzenine göre, sıfır dakika kovalamaca örneği dışında, doğrudan çanak kovalama orta iki mililitre ekleyin. Kovalama aracını aspire edin ve iki mililitre taze kovalamaca ortamı ile değiştirin.Kalan tüm yemekler için bu işlemi bir dakika aralıklarla tekrarlayın. Zamanlayıcı tam olarak 16 dakika okuduğunda, etiketlemeyi durdurmak için doğrudan sıfır dakika kovalamaca kabına iki militer kovalamaca aracı ekleyin. Hemen orta aspire.Bir soğutulmuş alüminyum plaka çanak aktarın ve buz soğuk stop tampon iki milis ekleyin. Diğer tüm tabakları 37 derecedebir kuvöze aktarın. Her kovalamaca yemeğini kuvözden su banyosuna aktarın.Her yemek için tam kovalamaca zamanında, kovalama orta aspire ve soğutulmuş alüminyum plaka çanak aktarın. Buz soğuk dur tampon iki mililitre ekleyin. Tüm tabakları buzüzerinde bırakın ve hücreleri lyse zaman kadar tampon durdurmak.Sonra stop çözeltisi aspire ve tüm bulaşıkları yıkayın. Üç aynı anda iki mililitre buz gibi soğuk dur çözeltisi. Durdurma çözeltisini tamamen aspire edin ve bir seferde iki tabak için 600 mikrolitre lysis tampon ekleyin.Bir hücre kazıyıcı kullanarak, iyice çanak yüzeyini kazıyın, ama yavaşça lysate karıştırmak için. Her tabaktan taze 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. 15, 000-20, 000 G'de 4 derece santigrat derecede çekirdekleri 10 dakika boyunca santrifüj edin.Süspansiyon hücreleri üzerinde nabız kovalamaca için bir 50 mililitrelik tüp zaman noktası başına beş milyon hücre toplama. Metinde açıklandığı gibi açlık yordamını gerçekleştirin. 15 dakika boyunca su banyosunda açlık işleminden sonra, zamanlayıcı başlatın.Tam bir dakika, doğrudan hücreleri içeren tüp ve karıştırmak için girdap seyreltilmemiş etiket 275 mikrocuries ekleyin. Tam olarak 11 dakika, etiketlemedurdurmak için dört mililitre kovalamaca ortamı ekleyin. Ve hemen etiketlemedurdurmak için buz dokuz mililitre buz soğuk stop çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüp için bir mililitre aktarın.Birbirini izleyen her kovalamaca zaman noktası için dokuz mililitre stop çözeltisi içeren bir tüpe bir mililitre kovalamaca aktarma işlemini tekrarlayın. İmmünyağıştan sonra son yıkamayı tamamen aspire edin. TE tampon ve girdap 20 mikrolitre boncuk yeniden askıya.Azaltma maddesi olmadan iki X örnek arabellek 20 mikrolitre ekleyin. Örnekleri girdap ve sonra 95 derecede beş dakika ısıtın. Örnekleri tekrar girdap.Bir dakika oda sıcaklığında 12, 000 kez G santrifüj. 19 mikrolitre azaltılmış olmayan supernatant'ı 500 milimolar DDT'lik bir mikrolitre içeren taze bir mikrosentrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse, numuneyi hızlı bir şekilde santrifüj edin, böylece tüm sıvılar en altta yer alabilsin.Ve 95 derecede 5 dakika ısı. Azaltılmış örnek soğumasını bekleyin ve sonra girdap. Oda sıcaklığında 12,000 kat G'de hem azaltılmış hem de indirgenmeyen numuneleri bir dakika lığına santrifüj edin ve tüm numunelere bir azı nemu nem 1.1 mikrolitre ekleyin.Bu çalışmada, bozulmamış hücrelerde protein katlama ve taşıma analiz etmek için radyoaktif darbe kovalamaca yaklaşımı kullanılır. Bir yapışkan nabız kovalamaca HIV bir GP120 katlama ve salgılanması burada gösterilmiştir. Non-azaltıcı jel GP120 oksidatif katlama gösterir.Darbe etiketleme hemen sonra, jel daha yüksek bir diffüz bant olarak görünür. Kovalamaca ilerledikçe, grup gp120'de yerel olarak katlanmış temsil eden sıkı bantta birikene kadar jelden daha da yaygın katlanır ara maddelerle aşağı yaslanır. Bu disülfit bağlarıoluşumu proteinin kompaktlığını artırır gibi oluşur, tam azaltılmış protein daha hızlı göç neden.Azaltıcı jelüzerinde, disülfit bağları ve tüm moleküller azaltılmış ve mobiilty etkilemez. Bu nedenle, hareketlilik farklılıkları sadece moleküler kütledeki değişikliklerin sonucu. Azaltılmış sinyal peptid amcaaved formu azaltılmış sinyal peptid yarık formu zaman içinde kayma GP120 post-translational sinyal peptit dekolte temsil eder.Daha fazla protein yerli kıvrım ulaşmak ve sinyal peptid kaybetmek gibi kovalamaca sırasında artar sinyal peptid kaybı nedeniyle hareketlilik artar. Hem azaltmayan hem de azaltıcı jelde, GP120 salgısına bağlı olarak sinyal yaklaşık bir saatten itibaren azalmaya başlar. Bu, ortam analiz edilerek izlenebilir.Bu yöntem organoid hücre modelleri de dahil olmak üzere herhangi bir hücre hattı için geçerlidir. Ama başarı büyük ölçüde ilgi protein ifade düzeyine bağlıdır. Bu yordamı başlamadan önce, bulaşıkları işaretleyin ve deney boyunca bu siparişi koruyun.Açlık orta eklemeden önce her şeyi hazır olduğundan emin olun. Bu deneyin başlangıcı. Ve laboratuar zamanın arkadaşın, ama hazır olmadığın zaman en büyük düşmanın olabilir.Bill'in kovalamacası, proteinlerin zamanla dolu malvarlığını araştırmak için sınırlı proteolysis ile birleştirilebilir. Ayrıca farklı seçilmiş dondurucular yöntemleri durulama veya rigormorization veya şarj farklılıkları analizi sağlayacaktır. Araştırmacıyı ve cihazı korumak için tüm yerel radyasyon güvenliği kurallarına uyulmalıdır.Ve koruyucu önlemler protokole göre alınmalıdır. STH sayfanız için kullanılan akrilamidin nörotoksik olduğunu unutmayın.

analysis-protein-folding-transport-degradation-living-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır...

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, transfekte edilmiş memeli hücrelerinin çekirdeğinde eksprese edilen floresan etiketli yanlış katlanmış lusiferaz mutant proteinin bozunma kinetiğini incelemek için in vitro floresan bazlı bir mikroplaka testi açıklanmaktadır. Test, yanlış katlanmış proteinin proteazom aracılı bozunmasını değerlendirmek için floresan mutant proteini eksprese eden hücrelerin bir translasyon inhibitörü ve bir proteazom inhibitörü ile işlenmesini içerir.

Floresan Mikroplaka Bazlı Sikloheksimid Takip Testi: Floresan Nükleer Yanlış Katlanmış Proteinlerin Bozunma Kinetiğini İzlemek İçin Bir Teknik

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Klasik bölgeye yönelik mutagenezin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, spesifik modifikasyonlara sahip prolin analogları birkaç floresan proteinine dahil edildi. Hidrojenin flor ile veya prolin kalıntılarındaki tekli çift bağlarla ("moleküler cerrahi") değiştirilmesinin, katlanmaları ve ışıkla etkileşimleri de dahil olmak üzere temel protein özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Floresan Proteinlerde Prolin Analogları ile Prolinin Kalıntıya Özgü Değişimi: Omurganın "Moleküler Cerrahisi" Katlanma ve Stabiliteyi Nasıl Etkiler?

Keşfedin canlı hücrelerde protein biyosentezini analiz etmek için radyoaktif darbe-chase yöntemini. Bu hassas teknik, protein katlanması, taşıma ve bozulma kinetiğini zamana bağlı olarak incelemenizi sağlar.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Daha fazla video keşfet