Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi
February 12th, 2019
Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.
35 S etiketli metiyonin ve sistein kullanılarak yapılan radyoaktif darbe takibi, canlı hücrelerde zamanla protein biyosentezini araştırmak için hala tek biyokimyasal yöntemdir. Protein biyosentezi hem çeviri, katlama ve montaj, hem de insan ticareti ve bozulmayı kapsar. Radyoaktif darbe kovalamacasının disülfür bağı oluşumu ve asetilasyon gibi ortak ve post-çeviri sonrası protein modifikasyonlarının analizi ile birleştirilmesi, proteinin inancını zamanla araştırmak için hassas ve nicel bir tahlil sağlar.
Bu işlem için iyi bir odaklanma ve deneysel kullanım gereklidir. İyi hazırlık tamponlar, radyoaktif çalışma alanı ve net bir program gibi çok önemlidir. Bu video radyoaktif darbe kovalamaca protokolüomuz görünümü üzerinde net sağlar.
Prosedürü gösteren Hui Ying Yeoh, bizim laboratuvar bir pHd adayı olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, tohum transfect ve kültür hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi. Nabız takibinden önce, hücrelerini mikroskoptan inceleyin.
Daha sonra, yıkama tampon iki mililitre ile bulaşıkları yıkayın. Ve hücrelere iki mililitre açlık orta ve 15 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde bulaşıkları yerleştirin. Nabız takibinizin düzenli olduğundan emin olun.
37 santigrat dereceönceden ısıtılmış su banyosunda raflara bulaşıkları aktarın. Bulaşıkların suyla temas halinde olduğundan emin olun, ancak yüzme. O zaman bir zamanlayıcı başlatın.
40 saniye, açlık ortamını aspire edin. Bir mikro pipet kullanarak, 600 mikrolitre darbe çözeltisi çizin. Tam bir dakika, yavaşça çanak merkezine darbe çözeltisi ekleyin.
Açlık ortamını ortadan kaldırmak ve kalan yemekler için darbe çözeltisini bir dakika aralıklarla ekleyerek bu işlemi tekrarlayın. Tam olarak 11 dakika ve tüm aşağıdaki yemekler için, nabız kovalamaca düzenine göre, sıfır dakika kovalamaca örneği dışında, doğrudan çanak kovalama orta iki mililitre ekleyin. Kovalama aracını aspire edin ve iki mililitre taze kovalamaca ortamı ile değiştirin.
Kalan tüm yemekler için bu işlemi bir dakika aralıklarla tekrarlayın. Zamanlayıcı tam olarak 16 dakika okuduğunda, etiketlemeyi durdurmak için doğrudan sıfır dakika kovalamaca kabına iki militer kovalamaca aracı ekleyin. Hemen orta aspire.
Bir soğutulmuş alüminyum plaka çanak aktarın ve buz soğuk stop tampon iki milis ekleyin. Diğer tüm tabakları 37 derecedebir kuvöze aktarın. Her kovalamaca yemeğini kuvözden su banyosuna aktarın.
Her yemek için tam kovalamaca zamanında, kovalama orta aspire ve soğutulmuş alüminyum plaka çanak aktarın. Buz soğuk dur tampon iki mililitre ekleyin. Tüm tabakları buzüzerinde bırakın ve hücreleri lyse zaman kadar tampon durdurmak.
Sonra stop çözeltisi aspire ve tüm bulaşıkları yıkayın. Üç aynı anda iki mililitre buz gibi soğuk dur çözeltisi. Durdurma çözeltisini tamamen aspire edin ve bir seferde iki tabak için 600 mikrolitre lysis tampon ekleyin.
Bir hücre kazıyıcı kullanarak, iyice çanak yüzeyini kazıyın, ama yavaşça lysate karıştırmak için. Her tabaktan taze 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. 15, 000-20, 000 G'de 4 derece santigrat derecede çekirdekleri 10 dakika boyunca santrifüj edin.
Süspansiyon hücreleri üzerinde nabız kovalamaca için bir 50 mililitrelik tüp zaman noktası başına beş milyon hücre toplama. Metinde açıklandığı gibi açlık yordamını gerçekleştirin. 15 dakika boyunca su banyosunda açlık işleminden sonra, zamanlayıcı başlatın.
Tam bir dakika, doğrudan hücreleri içeren tüp ve karıştırmak için girdap seyreltilmemiş etiket 275 mikrocuries ekleyin. Tam olarak 11 dakika, etiketlemedurdurmak için dört mililitre kovalamaca ortamı ekleyin. Ve hemen etiketlemedurdurmak için buz dokuz mililitre buz soğuk stop çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüp için bir mililitre aktarın.
Birbirini izleyen her kovalamaca zaman noktası için dokuz mililitre stop çözeltisi içeren bir tüpe bir mililitre kovalamaca aktarma işlemini tekrarlayın. İmmünyağıştan sonra son yıkamayı tamamen aspire edin. TE tampon ve girdap 20 mikrolitre boncuk yeniden askıya.
Azaltma maddesi olmadan iki X örnek arabellek 20 mikrolitre ekleyin. Örnekleri girdap ve sonra 95 derecede beş dakika ısıtın. Örnekleri tekrar girdap.
Bir dakika oda sıcaklığında 12, 000 kez G santrifüj. 19 mikrolitre azaltılmış olmayan supernatant'ı 500 milimolar DDT'lik bir mikrolitre içeren taze bir mikrosentrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse, numuneyi hızlı bir şekilde santrifüj edin, böylece tüm sıvılar en altta yer alabilsin.
Ve 95 derecede 5 dakika ısı. Azaltılmış örnek soğumasını bekleyin ve sonra girdap. Oda sıcaklığında 12,000 kat G'de hem azaltılmış hem de indirgenmeyen numuneleri bir dakika lığına santrifüj edin ve tüm numunelere bir azı nemu nem 1.1 mikrolitre ekleyin.
Bu çalışmada, bozulmamış hücrelerde protein katlama ve taşıma analiz etmek için radyoaktif darbe kovalamaca yaklaşımı kullanılır. Bir yapışkan nabız kovalamaca HIV bir GP120 katlama ve salgılanması burada gösterilmiştir. Non-azaltıcı jel GP120 oksidatif katlama gösterir.
Darbe etiketleme hemen sonra, jel daha yüksek bir diffüz bant olarak görünür. Kovalamaca ilerledikçe, grup gp120'de yerel olarak katlanmış temsil eden sıkı bantta birikene kadar jelden daha da yaygın katlanır ara maddelerle aşağı yaslanır. Bu disülfit bağlarıoluşumu proteinin kompaktlığını artırır gibi oluşur, tam azaltılmış protein daha hızlı göç neden.
Azaltıcı jelüzerinde, disülfit bağları ve tüm moleküller azaltılmış ve mobiilty etkilemez. Bu nedenle, hareketlilik farklılıkları sadece moleküler kütledeki değişikliklerin sonucu. Azaltılmış sinyal peptid amcaaved formu azaltılmış sinyal peptid yarık formu zaman içinde kayma GP120 post-translational sinyal peptit dekolte temsil eder.
Daha fazla protein yerli kıvrım ulaşmak ve sinyal peptid kaybetmek gibi kovalamaca sırasında artar sinyal peptid kaybı nedeniyle hareketlilik artar. Hem azaltmayan hem de azaltıcı jelde, GP120 salgısına bağlı olarak sinyal yaklaşık bir saatten itibaren azalmaya başlar. Bu, ortam analiz edilerek izlenebilir.
Bu yöntem organoid hücre modelleri de dahil olmak üzere herhangi bir hücre hattı için geçerlidir. Ama başarı büyük ölçüde ilgi protein ifade düzeyine bağlıdır. Bu yordamı başlamadan önce, bulaşıkları işaretleyin ve deney boyunca bu siparişi koruyun.
Açlık orta eklemeden önce her şeyi hazır olduğundan emin olun. Bu deneyin başlangıcı. Ve laboratuar zamanın arkadaşın, ama hazır olmadığın zaman en büyük düşmanın olabilir.
Bill'in kovalamacası, proteinlerin zamanla dolu malvarlığını araştırmak için sınırlı proteolysis ile birleştirilebilir. Ayrıca farklı seçilmiş dondurucular yöntemleri durulama veya rigormorization veya şarj farklılıkları analizi sağlayacaktır. Araştırmacıyı ve cihazı korumak için tüm yerel radyasyon güvenliği kurallarına uyulmalıdır.
Ve koruyucu önlemler protokole göre alınmalıdır. STH sayfanız için kullanılan akrilamidin nörotoksik olduğunu unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, canlı hücrelerde protein biyosentezini analiz etmek için 35S-etiketli metiyonin ve sistein kullanarak radyoaktif darbe-kovalama yöntemi için bir protokolü açıklamaktadır. Yöntem, protein katlanma, taşıma ve bozunmasına yönelik kinetik analizi sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Biyokimya
Arka Plan
- Protein biyosentezi, translasyon, katlanma, birleşme, taşıma ve bozulmayı içerir.
- Radyoaktif darbe-kovalama yöntemi hassas ve nicel bir analizdir.
- Disülfid bağı oluşumu ve asetilasyon gibi eşzamanlı ve sonrasal translasyon modifikasyonları analiz edilebilir.
- Başarılı bir uygulama için iyi deneysel işlem ve hazırlık kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde protein dinamiğini incelemek için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Zaman içinde protein biyosentezini anlamayı geliştirmek.
- Biyolojik araştırmalarda darbe-kovalama yönteminin uygulamasını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- 35S-metiyonin ve sistein kullanarak proteinlerin radyoaktif etiketlenmesi.
- Protein sentezi ve bozulmasını izlemek için darbe-kovalama tekniği.
- Biyosentez sırasında protein modifikasyonlarının analizi.
- Tamponlar ve radyoaktif çalışma alanı hazırlığı da dahil olmak üzere deneysel kurulum.
Ana Sonuçlar
- Canlı hücrelerde protein katlanma ve bozulmasının başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Protein modifikasyonlarını tespit etme yönteminin hassasiyetinin gösterilmesi.
- Video gösterimi yoluyla darbe-kovalama protokolünün net görselleştirilmesi.
- Protein biyosentez süreçlerinin kinetiklerine ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Radyoaktif darbe-kovalama yöntemi, protein dinamiğini incelemek için etkilidir.
- Başarılı deneysel sonuçlar için hazırlık ve odaklanma esastır.
- Bu protokol, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmacıları için değerli bir araç olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Radioactive pulse-chase analysis enables biopharma teams to dissect protein folding, trafficking, and degradation kinetics in live cells, providing critical insight into protein maturation and stability. This method supports predictive confidence in target validation by revealing the temporal sequence of post-translational modifications and conformational changes. Its adaptability across protein classes and cell systems positions it as a foundational tool for early discovery and mechanistic de-risking in biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables kinetic interrogation of protein folding and maturation in physiologically relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by mapping co- and post-translational modifications over time.
- Facilitates functional target validation by tracking protein fate from synthesis to degradation.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and triage of candidate targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of folding, trafficking, or degradation modulators.
- Delivers reproducible, time-resolved readouts for assay standardization and optimization.
- Enables quantitative assessment of protein processing suitable for high-content screening adaptation.
- Supports platform reuse across diverse protein classes and cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro folding and modification data with in-cellulo kinetics for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of protein stability and processing.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by revealing degradation pathways and secretion profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic studies with preclinical model validation for protein-based therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein maturation, trafficking, and degradation mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved measurements of folding intermediates and post-translational modifications.
- Translational Research: Enables alignment of cellular processing data with disease-relevant models when supported by expression systems.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a wide range of proteins and cell types, supporting portfolio-wide mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in protein maturation.
- Operational Value: Standardizes kinetic analysis of protein processing with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for protein therapeutics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biologic candidates based on folding and degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabeling, cell culture, and protein biochemistry.
- Demands access to radioactive handling infrastructure and compliance with safety protocols.
- Necessitates rigorous experimental preparation and timing for reproducibility.
- Adaptable to various cell lines, including organoid models, but dependent on protein expression levels.
- Limited by the need for conformation-specific antibodies and appropriate detection systems.
