Name: Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Keşfedin ultra uzun DNA dizileme yöntemini genomik analiz ve yapısal varyasyon karakterizasyonu için. Nanopor tabanlı bu teknik, kısa okuma yaklaşımlarının sınırlamalarını aşarak klinik tanı ve hassas tıpta devrim yaratır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Y. Zhu el yazması üzerine onun yorum için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P30CA034196 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

<ol><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing platforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+at+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing at 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structural+variation+discovery+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome structural variation discovery and genotyping.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+impact+of+genomic+structural+variation%3A+insights+from+and+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).</li>
<li>Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+reads%3A+their+purpose+and+place%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long reads: their purpose and place.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).</li>
<li>Cretu Stancu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+phasing+of+structural+variation+in+patient+genomes+using+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing.</a> Nature Communications. 8 (1), 1326(2017).</li>
<li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picky+comprehensively+detects+high-resolution+structural+variants+in+nanopore+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads.</a> Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).</li>
<li>Sedlazeck, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+detection+of+complex+structural+variations+using+single-molecule+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing.</a> Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+data+analysis+for+the+MinION+nanopore+sequencer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer.</a> Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).</li>
<li>Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+decades+of+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Three decades of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).</li>
<li>Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oxford+Nanopore+MinION%3A+delivery+of+nanopore+sequencing+to+the+genomics+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.</a> Genome Biology. 17 (1), 239(2016).</li>
<li>Editorial, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+view+on+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The long view on sequencing.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 287(2018).</li>
<li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+assembly+of+a+human+centromere+on+the+Y+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimap2%3A+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).</li>
<li>De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoPack%3A+visualizing+and+processing+long-read+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.</a> Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).</li>
<li>Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+macromolecular+crowding+on+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of macromolecular crowding on DNA replication.</a> Nature Communications. 4, 1615(2013).</li>
<li>Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Assisted+Targeting+of+CHromosome+segments+%28CATCH%29+for+targeted+nanopore+sequencing+and+optical+genome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Gabrieli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+nanopore+sequencing+of+human+BRCA1+by+Cas9-assisted+targeting+of+chromosome+segments+%28CATCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Prensip olarak, nanopore sıralama uzunluğu11,12,13megabase okuma için 100 kb oluşturmak yapabiliyor. Dört önemli faktörler sıralama çalışma ve veri kalitesi performansını etkiler: 1) etkin gözenek numaraları ve etkinliği ile gözenekleri; 2) motor protein, DNA nanopore geçerken hızını kontrol eder; 3) DNA şablonu (uzunluk, saflık, kalite, kitle); 4) giriş örnek kullanışlı DNA'dan belirleyen sıralaması bağdaştırıcısı ligasyonu verimlilik. İlk iki faktör akışı hücre ve üretici tarafından sağlanan sıralama kiti sürümü bağlıdır. Bu iletişim kuralı (HMW DNA ekstraksiyon, Yamultma ve tüp ligasyonu) kritik adımlarda ikinci iki faktörlerdir.
Bu iletişim kuralı uygulama ve sabır gerektirir. HMW DNA kalitesini olağanüstü uzun DNA kitaplıkları6için önemlidir. Protokol ile yüksek canlılık toplanan hücre ile başlar (> % 85 uygun hücre tercih), ölü hücreleri bozulmuş DNA'dan sınırlama. Tazminat (örneğin, güçlü rahatsız, sallayarak, girdap, birden çok pipetting, yinelenen dondurma ve çözme) DNA'yı tanıştırabilir miyim sert herhangi bir işlemde kaçınılmalıdır. Protokol tasarımında, DNA ekstraksiyon tüm sürecinde pipetting atlayın. Pipetting mekanik Kütüphane inşaat sırasında kesme ve sıralamanın sonra gerekli olduğunda kullanılacak geniş geçişli ipuçları gerekir. Nanopores odası arabellek12kimyaları duyarlı olduğundan, olmalı az kalıntı kirletici maddeler (örneğin, deterjanlar, yüzey aktif maddeleri, fenol, etanol, proteinler RNA'ların, vb) mümkün olduğunca DNA'sı. Uzunluğu ve verim göz önüne alındığında, fenol ayıklama yöntemi şimdiye kadar test birden çok farklı çıkarma yöntemleri ile karşılaştırıldığında en iyi ve en tekrarlanabilir sonuçlar gösterir.
Uzun okunur diziler üretmek için yetenek bu protokol rağmen hala bazı sınırlamaları kalır. İlk olarak, bu iletişim kuralını nanopore sıralama cihaz yayın sırasında kullanılabilir göre optimize edildi; Böylece, seçici nanopore tabanlı sıralama kimya sınırlıdır ve başka tür uzun okunur sıralama cihazların gerçekleştirildiğinde suboptimal olabilir. İkinci olarak, sonuç son derece başlangıç malzemeden (doku veya hücreleri) çıkarılan DNA kalitesine bağlıdır. Başlangıç DNA zaten bozulmuş veya bozuk okunur uzunluğu tehlikeye girer. Üçüncü olarak, her ne kadar birden fazla QC adım DNA kalite kontrol etmek için iletişim kuralında dahil edilmiştir, son verim ve uzunluğu, okuma akışı hücre tarafından etkilenebilir ve değişken nanopore sıralama platformu bu erken aşamada olabilir etkinlik, gözenek geliştirme.
Açıklanan protokol burada DNA ekstraksiyon için insan süspansiyon hücre satırı örnekleri kullanır. Kesme, HMW DNA oranı transposase ve açıklanan sonuçlar üretmek için ligasyonu zaman iğne geçen zamanlarda en iyi duruma. Protokol dört şekilde genişletilebilir. İlk olarak, kullanıcı-ebilmek başlamak ile kültürlü diğer memeli hücreleri ve hücre, doku, klinik örnekler veya diğer organizmaların farklı miktarda. Lizis kuluçka süresi, tepki birim ve Santrifüjü üzerinde daha fazla optimizasyon gerekli olacaktır. İkinci olarak, olağanüstü uzun okuma sıralama için hedef boyutunu tahmin etmek zordur. Okuma uzunlukları beklenenden daha kısa ise, kullanıcılar geçen zamanlarda mekanik kesme tabanlı yöntemi ayarlamak veya transposase transposase parçalanma tabanlı yöntemi için HMW DNA oranını değiştirin. HMW DNA çok yapışkan olduğundan daha uzun bağlama ve elüsyon zaman temizleme adımları sırasında yararlıdır. Üçüncü olarak, farklı nanopore sıralama cihazlar ile bir miktar ve birim DNA Sekanslama ölçütlerine ayarlayabilirsiniz. Dördüncü olarak, sadece sıralaması bağdaştırıcısı için bakmaksızın DNA sıralı. Tüp ligasyonu verimliliği daha da geliştirmek için bir bağdaştırıcı ve ligaz konsantrasyonları titre deneyebilirsiniz. Değiştirilmiş ligasyonu zaman ve moleküler kalabalık ajanlar PEG18 gibi gelecekte uygulanabilir. CRISPR19,20 ile birlikte olağanüstü uzun DNA sıralama iletişim kuralı hedef zenginleştirme sıralama için etkili bir araç sunabilir.

Son on yıl içinde kitlesel paralel ve son derece hassas ikinci nesil yüksek üretilen iş sıralama teknolojileri bir patlama Biyomedikal keşif ve teknolojik yenilik1,2,3tahrik var. Teknik gelişmeler rağmen ikinci nesil platformları tarafından oluşturulan veri kısa okuma karmaşık genomik bölgeleri çözümünde etkisiz ve hangi insan önemli rol oynarlar yapısal genomik türevleri (SVs), tespiti sınırlıdır Evrim ve hastalıklar4,5. Ayrıca, veri kısa okuma tekrarlama varyasyon gideremezseniz ve genetik varyantların6/ haplogrubundan phasing yüksek beklentileri karşılayan uygun olmayan.
Son tek molekül sıralama Teklifler önemli ölçüde uzun sürüyor okuma SVs7,8,9tam spektrum ve teklifler doğru ve eksiksiz derleme kompleks tespiti kolaylaştırabilir uzunluğu mikrobiyal ve memeli genleri6,10. Nanopore platformu doğrudan gözenekleri11,12,13geçitle DNA tarafından aracılı geçerli değişiklikleri ölçerek tek molekül sıralama gerçekleştirir. Herhangi bir varolan DNA sıralama kimya, nanopore sıralama uzun (on binlerce kilobases) okuma gerçek zamanlı polimeraz Kinetik güvenerek olmadan yapay içinde oluşturabileceğiniz veya amplifikasyon DNA örneği. Bu nedenle, nanopore uzun-(NLR-seq) tutan büyük söz özellikle düşük karmaşıklık veya tekrar-zengin Ultra uzun okuma uzunlukları büyük ölçüde genomik ve Biyomedikal analizleri14ilerlemek, 100 kb ötesinde oluşturmak için sıralama okuma genleri15bölgelerinde.
Özelliği nanopore sıralama, uzun oluşturmak için potansiyel bir teorik uzunluğu sınırlama olmaksızın okuyan yöntemdir. Bu nedenle, okuma uzunluğu DNA bütünlüğü ve sıralamanın şablon kalitesi ile doğrudan etkilenen DNA fiziksel uzunluğu bağlıdır. Ayrıca, manipülasyon ve adımları dahil, pipetting kuvvetler ve çıkarma koşulları gibi ölçüde bağlı olarak, DNA'ın kalite son derece değişkendir. Bu nedenle, bir uzun okuma sadece standart DNA ekstraksiyon protokolleri ve üretici sağlanan Kütüphane inşaat yöntemleri uygulayarak verim meydan okuyor. Bu amaçla doğru sağlam geliştirdiğimiz yöntemi olağanüstü uzun oluşturmak için hasat hücre çökeltilerini başlayarak sıralama veri (kilobases yüzlerce) okuyun. DNA ekstraksiyon ve Kütüphane hazırlama yordamları birden fazla iyileştirmeler evlat edindik. Biz DNA bozulması ve hasar neden gereksiz yordamlar dışlamak için protokol aerodinamik. Bu iletişim kuralı yüksek molekül ağırlığı (HMW) oluşan DNA ekstraksiyon, olağanüstü uzun DNA Kütüphane inşaat ve sıralama nanopore platformu üzerinde. İyi eğitimli bir moleküler biyolog, genellikle HMW DNA ekstraksiyon, 90 dakika veya kütüphane inşaat yamultma yöntemine bağlı olarak ve bir daha da 48 h DNA sıralama için en fazla 8 h tamamlanması için hasat hücreden 6 h alır. Protokolü'nün kullanılmasına genom karmaşıklık anlayışımızı geliştirmek ve insan hastalıkları genom varyasyon yeni bir anlayış kazanmak genomik topluluk güçlendirmek.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mutlak etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XPbeads</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td>manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>BD konvansiyonel iğneleri</td><td>temizlemek için Becton Dickinson</td><td>305136</td><td>27G, mekanik kesme için</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>Mekanik</td><td>kesme için</td>309628</tr><tr><td>Künt / TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>Hücre sayımı için</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td></tr><tr><td>Akış Hücresi</td><td>Oxford Nanopore Teknolojileri</td><td>FLO-MIN106</td><td>R9.4.1</td></tr><tr><td>HG00773 hücreleri</td><td>Coriell Bu</td><td>protokolde kullanılan</td>enstitü <td>HG00733</td> hücreleri</tr><tr><td>Ligasyon Sıralama Kiti 1D</td><td>Oxford Nanopor Teknolojileri</td><td>SQK-LSK108</td><td>nanopor ligasyon kiti</td></tr><tr><td>MaXtract Yüksek Yoğunluklu tüpler</td><td>Qiagen</td><td>129073</td><td>jel tüpleri</td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Onarım Karışımı</td><td>NEB</td><td>M6630S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Uç Onarımı/dA-Kuyruk Modülü</td><td>NEB</td><td>M7546S</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td>70011044 10X, pH 7.4</td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: IAA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>20 mg / mL</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Test Kiti</td><td>DNA kantitasyonu için</td> <td>Invitrogen</td><td>Q32850</td> florometre testleri</tr><tr><td>Hızlı Sıralama Kiti</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RAD004</td><td>nanopor transpozaz kiti</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td>%10 (ağırlık/hacim)</td></tr><tr><td>Sodyum klorür çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>AM9759</td><td>5.0 M</td></tr><tr><td>TE tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td>pH 8.0, 1 M</td></tr><tr><td>Triton X-100 çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td> <td>~% 10</td></tr> <tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td> <td> Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196EDU</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22628180</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Hücre</td><td>sayımı için</td><td>AMQAF1000</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıs</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>12321D</td><td>manyetik raf</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>inkübasyon için</td></tr><tr><td>Dondurucu</td><td>LabRepCo</td><td>LHP-5-UFMB</td><td></td></tr><tr><td>GridION</td><td>Oxford Nanopore Teknolojileri</td><td>Bu protokolde kullanılan</td><td>GridION X5</td> nanopor cihazı</tr><tr><td>HulaMixer Numune Karıştırıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td><td>döndürücü karıştırıcı</td></tr><tr><td>MicroSantrifüj</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UV okuma için ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Nabız</td><td>Adaçayı Bilim</td><td>PPI0200</td><td>darbeli alan jel elektroforez aleti</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>florometre</td></tr><tr><td>Buzdolabı</td><td>LabRepCo</td><td>LABHP-5-URBSS</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>VWR</td><td>89501-464</td><td></td></tr></tbody></table>

bütün genomik dna analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Üçüncü nesil tek molekül DNA sıralama teknolojileri artık bu önemli ölçüde teklif okuma karmaşık genleri ve karmaşık yapısal değişik analizini Meclisi kolaylaştırabilir uzunluğu. Nanopore platform tek molekül sıralama doğrudan gözenekleri geçitle DNA tarafından aracılı geçerli değişiklikleri ölçerek gerçekleştirmek ve kilobaz (kb) okuma en az sermaye maliyeti ile yüzlerce oluşturabilir. Bu platform için çeşitli uygulamalar birçok araştırmacılar tarafından kabul edilmiştir. Uzun sıralama okuma uzunlukları elde nanopore sıralama platformlar değerini kaldıraç için en önemli faktördür. Olağanüstü uzun okuma oluşturmak için özel dikkat DNA kırılmaları önlemek ve verimli sıralama şablonları oluşturmak için verimliliği elde etmek için gereklidir. Burada, biz ve bir nanopore aygıtında sıralama yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA ekstraksiyon taze veya dondurulmuş hücrelerden, Kütüphane inşaat mekanik kesme veya transposase parçalanma, dahil olmak üzere olağanüstü uzun DNA sıralama detaylı Protokolü sağlar. 20-25 µg HMW DNA dan N50 90-100 KB okuma uzunluğu transposase ile parçalanma aracılı ve yöntem N50 okuma uzunluğu 50-70 KB mekanik kesme ile elde edebilirsiniz. İletişim kuralı tüm genom sıralama yapısal türevleri ve genom derleme tespiti için gerçekleştirmek için DNA memeli hücrelerinden çıkarılan uygulanabilir. DNA ekstraksiyon ve enzimatik reaksiyonları ek iyileştirmeler daha fazla okuma yüksekliğini arttırın ve yararını genişletin.

Olağanüstü uzun DNA sıralama Protokolü HMW DNA Kütüphane yapımı için geçerlidir. Bu nedenle, canlı oranı ile iyi kültürlü hücreleri seçmek için önemlidir &gt; adım hasat hücre % 85. DNA ekstraksiyon için kullanılan hücre miktarı kalite ve HMW DNA miktarını etkiler. Hücre lizis de çok fazla hücre ile başlayarak, çalışmaz. HMW DNA yağış nazik döndürme el ile yerine yüksek hızlı Santrifüjü kullanarak gerçekleştirilir çünkü çok az sayıda hücre kullanarak kütüphane yapımı için yeterli DNA oluşturmaz. HMW buz gibi % 100 etanol ekleme ve döndürerek Şekil 2' deki Beyaz pamuk benzeri çökelti olarak gösterilir sonra DNA örneği.
Kütüphane inşaat başlamadan önce giriş DNA kalitesini kontrol etmek önemlidir. Bozulması, hatalı miktar, kirlenme (örneğin, proteinler, RNA'ların, deterjanlar, yüzey aktif ve artık fenol veya etanol) ve düşük moleküler ağırlıklı DNA sonraki yordamlar ve son okuma uzunluğu önemli bir etkiye sahip olabilir. Biz üç farklı yerlerde HMW DNA içeren tüp içinde DNA'yı kullanarak QC çözümlemesini öneririz. UV, sonuçları HMW DNA için okuma dan OD260/OD280 değeri yaklaşık 1,9 ve OD260/OD230 değeri yaklaşık 2.3 (şekil 3AB). Bu oranı değerleri üç testleri için iyi HMW DNA örneği arasında tutarlıdır. Farklı kesme yöntemleri giriş DNA'sı farklı hacimleri gerektirir. HMW DNA konsantrasyon olması gerekir &gt; 200 ng/µL olması gerekir iken mekanik kesme için &gt; 1 µg/µL transposase parçalanma için. Bir yer tarafından algılanan konsantrasyon biraz okuma UV düşüktür. Ancak, aynı HMW DNA örneği toplama varyasyon katsayısı yer ve deneyleri okuma UV ile % 15'den az olması için gereklidir. Mekanik kesme bir şırınga HMW DNA iğne geçer sayısı yamultulmuş DNA boyutunu etkiler ve son okuma uzunluğu break bir iğne ile geçerlidir. Bu iğne HMW DNA çoğunluğu sağlamak için kesme 50 şekil 4' te gösterildiği gibi kb değerinden daha büyük olduğunda boyutu QC gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Mekanik Kesme yönteminde 30 geçer en iyi sıralama sonuçları çıktı ve uzunluğu dikkate alınarak oluşturulur.
Transposase parçalanma tabanlı kitaplık 90-100 kb ise mekanik bir yamultma tabanlı kitaplık N50 50-70 kb'tır. HG00733 hücre satırı kullanarak dört çalışmalarını sonuçları Tablo 1<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Uzun okunur dizileri büyük ölçüde karmaşık genleri ve yapısal değişim karakterizasyonu montajı kolaylaştırmak. Biz sıralama nanopore tabanlı platformlar tarafından olağanüstü uzun dizileri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım kilobaz okuma orta kapsama ile yüzlerce insan hücreleri oluşturmak için değiştirilen kitaplığı hazırlıklar ardından en iyi duruma getirilmiş bir DNA ekstraksiyon benimser.

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Bu protokol, ultra uzun diziler üretme yeteneğimizdeki teknik boşluğu doldurur. Genomikte mevcut kısa okuma yaklaşımları ile sınırlı olan genom karmaşıklığını incelememizi sağlar. Yöntem performans, sağlamlık, çok yönlülük ve umut verici yeni uygulamalarla entegre etme potansiyeli açısından benzersizdir.Farklı malzemeler için geçerlidir ve farklı anlık boyutlar için modüle edilebilir. Bu teknik klinik manzaradevrim başladı. Tekrar genleşme bozukluklarında tanı programı birçok mevcut eksikliklerin üstesinden gelmiştir.Bazı nakil kayıtları daha iyi klinik sonuç için yüksek çözünürlüklü HLA-typing kullandık. Bu yöntemler, kademeli ve karmaşık yapısal varyans gibi daha önce erişilemeyen uzun menzilli bilgiler sağlar. Tek bir testte epigenetik okuma ile birleştiğinde, hassas tıp sağlayacaktır.Birçok yeni teknikle uzun bir protokol ve son sıralamaya kadar çalışıp çalışmamasını bilmek zor. Örnekleri çalıştırmadan önce eski akış hücrelerine yükleme uygulamanızı öneririm. İşbirlikçiler, bazı tekniklerin kısa okuma yaklaşımlarına kıyasla kafa karıştırıcı olduğunu söylediler.Özellikle, çıkarma yüksek kaliteli, yüksek molekül ağırlıklı DNA nedeniyle daha nazik. HMW DNA'sının çıkarılmasına başlamak için, ilk olarak 50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre likit tampona hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini ekleyin. Sonra, üç saniye boyunca en yüksek hızda girdap.Ve çözeltiyi 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, lysate iki mikrolitre RNS-A ekleyin. 50 mililitrelik tüpü yavaşça döndürün ve numuneyi bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, lysate fenol-kloroform-izoamyl alkol karışımı fenol tabakasının 10 mililitre ekleyin. Ve bir duman kaputunun altında 10 dakika boyunca 20 rpm bir rotator tüp koyun. Jel tüpler ile santrifüj sonra, dikkatle yeni bir 50 mililitrelik tüp içine supernatant dökün.Daha sonra, 25 mililitre buz gibi %100 etanol ekleyin ve DNA çökene kadar tüpü elle hafifçe döndürün. Bir kanca yapmak için 20 mikrolitre ucu bükün. Kancayı kullanarak, HMW DNA'sını dikkatlice çıkar ve sıvının düşmesine izin verin.Daha sonra, DNA'yı 40 mililitrelik %70 etanol içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve DNA'yı yıkamak için tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Mekanik kesme tabanlı kütüphaneyi hazırlamak için, önce tüm DNA'yı almak için 100 mililitrelik iğnesiz bir şırınga kullanın. Daha sonra şırınganın üzerine 27 kalibrelik bir iğne koyun ve tüm DNA'yı yavaşça ve yavaşça tabağa at.29 kez tekrarlayın. Daha sonra, yeniden askıda manyetik boncuklar 143 mikrolitre ve bir tüp DNA onarım reaksiyon karışımı 143 mikrolitre ekleyin. Yavaşça karıştırmak için altı kez tüp flick ve 30 dakika boyunca 20 rpm bir rotator tüp koymak.Tüpü 1000G'de oda sıcaklığında iki saniye boyunca santrifüj edin ve tüpü 10 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Daha sonra, tüp hala rafta yken supernatant atın. Taze hazırlanmış 400 mikrolitre ekleyin 70% etanol.30 saniye bekleyin. Sonra da etanolçıkar. Daha sonra, 1000G'de tüpü oda sıcaklığında iki saniye santrifüj edin ve numuneyi aşağı doğru döndürün.Tüpü manyetik rafa geri yerleştirin ve artık etanolleri çıkarın. Peleti 30 saniye boyunca havayla kurutun. Daha sonra, tüpü manyetik raftan çıkarın ve 103 mikrolitre T-E tampon ekleyin.Daha sonra, boncukların tamponla kaplı olduğundan emin olmak için tüpü hafifçe hareket ettirin ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca rotator'a koyun. Son olarak, boncuk pelet için 10 dakika boyunca manyetik raf üzerinde tüp geri yerleştirin. Eluate'nin 100 mikrolitresini 0,2 mililitrelik bir tüpe aktarmak için P200 geniş delik ucu kullanın ve dA kuyruklu ve adaptör ligasyon reaksiyonlarını onarmaya devam edin.Transposaz parçalanma tabanlı kütüphaneyi hazırlamak için, ilk olarak 0,2 mililitrelik bir tüpe 22 mikrolitre HMW DNA, 10 milimolar Triss, pH 8 mikrolitresi ve %0.02 Triton X-100 ile 1 mikrolitre parçalama karışımı ekleyerek DNA etiketleme reaksiyonu yapın. Daha sonra, reaksiyonu altı kez karıştırmak için P200 geniş delik ucu kullanın ve bir dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçka, bir dakika boyunca 80 santigrat derece takip. Dört santigrat derecede tutun.Son olarak, 1,5 mililitrelik bir tüpe reaksiyon aktarmak ve hızlı bir şekilde 1 mikrolitre hızlı adaptör karışımı eklemek için P200 geniş delik ucu kullanın. Reaksiyonu altı kez karıştırmak için P200 geniş delik ucu kullanın. Reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın ve sıralamaya devam edin.Sıralamaya başlamak için önce Nanopore aygıtının kanallarından birine yeni bir akış hücresi yerleştirin. Ardından, beraberindeki sıralama kontrol yazılımında akış hücresinin konum kutusunu işaretleyin. Doğru akış hücre türünü seçin ve denetim akışı hücresinin iş akışını tıklatın.Akış hücresi QC analizini başlatmak için test başlat düğmesini tıklatın. Daha sonra, 100 mikrolitreye ayarlanmış bir P1000 pipetle, akış hücresinden kabarcıkları çıkarmak için 30 mikrolitreden daha az tampon çekin. Kabarcıklar tanıtmak önlemek için astar bağlantı noktası üst kapsayacak şekilde astar karışımı 30 mikrolitre ekleyin.Daha sonra, pipet 800 mikrolitre astar karışımı astar bağlantı noktasına akış hücresi yüklemek için. Sol astar karışımı yaklaşık 50 mikrolitre olduğunda ucu çıkarın ve astar bağlantı noktasının üstüne astar karışımı geri kalanını ekleyin. Daha sonra, P1000 pipet ile, akış hücresine astar karışımı 200 mikrolitre ekleyin.Daha sonra, yüklemeden hemen önce, DNA kitaplığı üzerinde altı kez pipet yukarı ve aşağı pipet için 80 mikrolitre ye ayarlanmış bir P200 pipet kullanın. Son olarak, kitaplık karışımı damla-bilge örnek bağlantı noktası üzerinden akış hücresine yük ve sıralama ve veri analizi devam edin. Mekanik yamultma tabanlı kütüphane inşaatı için hazır DNA QC analizi yaklaşık 1,9 260-280 saflık oranı ve yaklaşık 2,3 260-230 oranı, iyi bir DNA örneği gösteren sonuçlandı.Aynı sonuç DNA'ya hazır transposaz parçalanma tabanlı kütüphane yapısı kullanılarak da görüldü. Darbe alanı jel elektroforezi ile iğne-litared HMW DNA boyut kalite kontrolü HMW DNA çoğunluğu 50 kilobases daha büyük olduğunu gösterdi. HG00733 hücre kullanılarak yapılan dört çalıştırmanın sonuçları, mekanik kesme tabanlı bir kitaplığın N50'sinin transposaz parçalanma tabanlı kitaplıktan daha kısa olduğunu göstermiştir.Ayrıca, dört çalışır 100 kilobases daha uzun uzunluğu ile 2300 üzerinde okuma vardı. Transposaz parçalanma tabanlı kütüphanelerde, mekanik kesme tabanlı kütüphanelere kıyasla daha kısa hazırlık süresi ile maksimum uzunluk daha uzundu. Mekanik kesme tabanlı kütüphaneler transposaz parçalanma tabanlı kütüphanelere göre daha fazla toplam okuma üreterek daha yüksek bir verim gösterir.Her iki kütüphane de tutarlı yüksek kalite gösterdi ve toplam üslerinin %97'sinden fazlası insan referans genomu ile uyumluidi. Beklenen boyut dağılımları, dört çalıştırmanın da 50 kilobaz üzerinde büyük oranda veriye sahip olduğunu, transposaz parçalanma tabanlı kütüphanelerin ise ultra uzun okuma oranının daha yüksek olduğunu gösterdi. Genel amaç DNA'yı sağlam tutmak, bu yüzden DNA'nın sert bir şekilde işlenmesinden kaçınmak önemlidir.Yöntemin değerini en üst düzeye çıkarabilecek önemli bir faktör hesaplamalı çözümlemedir. Ekibimiz, yüksek hassasiyetle tüm SV'leri tespit edebilen PICKY adında uzun okunan bir analiz boru hattı geliştirmiştir. Bu karmaşık SVs tespit ve tek molekül düzeyinde yeniden düzenleme ve değişiklikler phasing gibi heyecan verici alanlara yeni yollar açacaktır.Bu, genom mimarisi anlayışımızı büyük ölçüde geliştirecektir. Fenol çok aşındırıcıdır. Eldiven, güvenlik gözlükleri, laboratuvar önlüğü, uzun pantolon ve ayakkabı dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman, bir duman başlık ile çalışmak gerekir.

ultra-long-read-sequencing-for-whole-genomic-dna-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz yüksek verimlilik sıralama (DamID seq) DNA adenin metiltransferaz kimlik (DamID) bağlanması burada bir tahlil açıklar. Bu geliştirilmiş bir yöntem daha yüksek çözünürlüğü ve daha geniş bir dinamik aralığı ve karşılaştırın vb ChIP-SEQ RNA-SEQ gibi diğer yüksek verimli sekanslama verileri ile birlikte DamID seq verileri analiz...

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Mikroskobik organizmaların genomik sıralama sırasında kontaminasyon büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. İşte, bir tardigrade tek bir örnekten genom genomik DNA tüm genom amplifikasyon olmadan bulaşma riskini en aza indirmek için olduğu kadar az 50 pg ile sıralamak için bir yöntemi göstermektedir.

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Bu iletişim kuralının amacı bilinen yalnızca kısmen bir ortak arındırıcı serisinden kolayca ayrılamayan roman dizileri bulamadı bir arada hesaplamalı ve tezgah araştırma kullanmaktır.

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs 'ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Bu protokol, üriner bakterilerin kültleme, dizileme ve de novo hibrid genom montajı için kapsamlı bir yaklaşımı detaylandırmak. İdrar kolonizasyonuna, patogeneze ve antimikrobiyal direncin yayılmasına katkıda bulunan kromozomal ve ekstrakrozomal genetik elementlerin incelenmesinde yararlı olan tam, dairesel genom dizilerinin üretimi için tekrarlanabilir bir prosedür sağlar.

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis'teki 18 ilaca dirençli bölgenin uzun okumalı bir dizileme platformu kullanılarak hedeflenen derin dizilimi için optimize edildi ve ardından uzun okunan veriler için tasarlanmış tüberküloza özgü bir biyoinformatik boru hattı ile analiz edildi.

Uzun Okuma Dizileme Teknolojilerini Kullanarak Amplikon Dizileme

Keşfedin ultra uzun DNA dizileme yöntemini genomik analiz ve yapısal varyasyon karakterizasyonu için. Nanopor tabanlı bu teknik, kısa okuma yaklaşımlarının sınırlamalarını aşarak klinik tanı ve hassas tıpta devrim yaratır.

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Daha fazla video keşfet