Name: Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Öğrenin, insan periferik kan nötrofillerinde LRRK2 kinaz aktivitesini Rab10 fosforilasyonu üzerinden değerlendirmek için güvenilir bir yöntem. Bu yaklaşım, kalıtsal Parkinson hastalığı riski taşıyan bireyleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma için kan bağışında bulunan sağlıklı gönüllülere teşekkür ederiz. Biz Michael J. Fox Vakfı Parkinson Araştırma için teşekkür (MJFF) ve Fox BioNet çalışma liderlik (FBN) destek ve yazılı protokol ve video doğru giriş için. Avusturya'daki Viyana Üniversitesi'nden Profesör Alexander Zimprich'e protokolümüzü ve işbirliğimizi test ettiği için teşekkür ederiz. Paul Davies'in projeye katkılarına değer vermekteyiz (MRC PPU genel müdürü). Ayrıca MRC Protein Fosforilasyon ve Ubiquitition Unit (PPU) yani Kimyasal Sentez (Natalia Shpiro MLi-2 sentezi için), MRC PPU Reaktifler ve Hizmetler antikor arıtma ekipleri (tarafından koordine mükemmel teknik destek tanımak Hilary McLauchlan ve James Hastie). Biz Video ve animasyonlar yapımında yardım için Vivomotion Gelen Mhairi Towler ve Fraser Murdoch teşekkür ederiz. Biz steve Soave 81 film den son edinimleri ile yardım için teşekkür ederiz. Esther Sammler Bir İskoç Kıdemli Klinik Akademik Bursu tarafından desteklenir ve Parkinson İngiltere (K-1706) fon aldı.

Yerel İngiltere mevzuatına göre insan kanının tüm manipülasyonları ve borulama bir kategori 2 biyolojik güvenlik kabinesinde üstlenilir. Tüm prosedürler yerel etik inceleme kuruluna uygun olarak gerçekleştirildi ve tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay verdi.
1. Hazırlık
<ol><li>Fosfat tamponlu salinde (PBS) 100 mM EDTA içeren 0,1 mL EDTA Stok Çözeltisi 1 hazırlayın.</li>
	<li>PBS'de 1 mM EDTA içeren 60 mL EDTA Stok Çözeltisi 2 hazırlayın.</li>
	<li>50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), %1 (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF içeren lysis tamponunu hazırlayın, 10 mM β-gliserinosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.27 M sakaroz, %0.1 (v/v) β-mercaptoetanol, 1x proteaz inhibitör kokteyli, 1 μg/mL microcystin-LR ve 0.5 mM diisoylprop florosfat (DIFP). NOT: Yazarlar rutin bir EDTA içermeyen ürün kullanmak, ancak edta içeren proteaz inhibitörü kokteyl de çalışması gerekir. Lysis tamponu β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP olmadan önceden yapılabilir ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir. Β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP'nin kullanımdan hemen önce eklenmediğinden emin olun. DİkKAT: DIFP toksiktir ve yerel sağlık ve güvenlik risk değerlendirmesi sonrasında bir duman başlık içinde özenle ele alınmalıdır. DIFP lysis tamponekleyebilir ve hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, DIFP dahil diğer tüm bileşenleri içeren tam lisis tampon, aliquoted ve en az 4 hafta boyunca sonraki kullanım için -80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>2. Tam kandan nötrofil izolasyonu
<ol><li>Bir kan toplama tüpü içine 10 mL kan toplayın. Tüpleri 7−8x ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>10 mL'lik kanın 50 mL konik tüpe aktarılması.</li>
	<li>Kana 100 μL EDTA Stok Çözeltisi 1 ekleyin. Yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Nötrofil izolasyon kitinden(Malzeme Tablosu)tüm kan örneğine 500 μL izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin.</li>
	<li>Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanılmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 s'lik bir giriş için girdap.</li>
	<li>Kan örneğine manyetik boncukların 500 μL'sini ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>5 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübat.</li>
	<li>TÜPÜ EDTA Stok Çözümü 2 ile 50 mL'ye doldurun. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3x pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.</li>
	<li>RT'de 10 dakika kuluçka.</li>
	<li>Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet. NOT: Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyonyaklaşık 10 mL bırakın.</li>
	<li>Kullanmadan önce 30 s için manyetik boncukvor ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp için manyetik boncuk0.5 mL ekleyin. Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>5 dakika RT'de kuluçka.</li>
	<li>Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.</li>
	<li>5 dakika RT'de kuluçka.</li>
	<li>Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet. NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın.</li>
	<li>Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin.</li>
	<li>RT'de 10 dakika kuluçka.</li>
	<li>Şimdi yeni bir 50 mL konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon dikkatle pipet. NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın.</li>
	<li>İzole hücreleri 1 mM EDTA Stok Çözeltisi 2 ile yaklaşık 41 mL'lik son hacmi karıştırın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.</li>
	<li>Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mL olan iki tüpe eşit olarak bölün.</li>
	<li>Santrifüj her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk.</li>
	<li>Bu santrifüj sırasında MLi-2 inhibitör stokunu (200 μM/1000x konsantrasyon) -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve daha sonra kullanılmak üzere RT'de bırakın.</li>
	<li>Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün. Rt'de hücre kültürü ortamının 10 mL'lik(Malzeme Tablosu)her hücre peletini, hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı 4 kat borulayarak yeniden askıya alın.</li>
</ol>3. Saf nötrofillerin LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisi
<ol><li>Etiket bir tüp "DMSO" ve diğer tüp "MLi-2".</li>
	<li>"DMSO" etiketli tüpe 10 μL DMSO ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın. "MLi-2" etiketli boruya 10 μL 200 μM MLi-2 stok çözeltisi (son konsantrasyon 200 nM) ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Rt. Kuluçka sırasında her 10 dakikada bir inversiyon ile hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Kuluçka döneminde 0,5 M DIFP stoğunu -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde bir duman kaputuna yerleştirin. -80 °C'lik dondurucudan 1 mg/mL mikrosistin-LR stok çözeltisini çıkarın ve erimeye RT'de bırakın. Dondurucudan bir aliquot (0.25 mL) alın, RT'de çözülmesine izin verin ve daha sonra kullanmak üzere buzüzerine yerleştirin.</li>
	<li>1 μL DMSO içeren hücre kültürü ortamının 1 mL'sini hazırlayın ve bu DMSO resuspension arabelleği çağırın. 1 μL 200 m MM MLi-2 içeren 1 mL RPMI ortam hazırlayın ve bu MLi-2 resuspension tamponu deyin.</li>
	<li>30 dk kuluçka süresinden sonra her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk santrifüj edin.</li>
	<li>Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.</li>
	<li>DMSO etiketli numune için pelet, DMSO resuspension tamponunun 1 mL'inde ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 resuspension tamponunun 1 mL'inde peleti hafifçe askıya alın.</li>
	<li>Resuspended hücre peletlerini "DMSO" ve "MLi-2" etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 3 3 dk boyunca 335 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputuna 0,25 μL 0,5 M DIFP çözeltisi ve 0,25 μL 1 mg/mL mikrosisin-LR 0,25 mL likörü tamponuna dikkatlice ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın. NOT: DIFP sulu bir çözeltide nispeten kararsız olduğundan, hücre lisisinin 15 dakika içindeki lysis arabelleğine DIFP ekleyin.</li>
	<li>Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin.</li>
	<li>Her tüpe hemen DIFP ve mikrosistin-LR içeren 100 μL likis tamponekleyin. 100-200 μL pipet kullanarak hücre peletlerini yaklaşık 5-10 x yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücreleri 10 dakika boyunca buzüzerinde lyse.</li>
	<li>Hücre enkazLarını temizlemek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g'lık santrifüj tüpleri.</li>
	<li>Nötrofil lisatlarını içeren "DMSO" ve "MLi-2" süpernatantlarını yeni santrifüj tüplerine aktarın. Enkaz peletini atın. NOT: Nötrofil lysates kullanıma hazır dır veya sıvı nitrojende dondurulmuş ve ileride analiz için -80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Therapies+for+Parkinson%27s+Disease%3A+From+Genetics+to+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li>
<li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+kinase+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li>
<li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li>
<li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson%27s+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Parkinson%27s+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li>
<li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+3-%284-Pyrimidinyl%29+Indazole+%28MLi-2%29%2C+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li>
<li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+serine+proteases%3A+specific+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li>
<li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson%27s+disease+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li>
<li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+VPS35%5BD620N%5D+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li>
<li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li>
<li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32(2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Zorlayıcı klinik, genetik ve biyokimyasal kanıtlar LRRK2 için önemli bir rol doğru işaret ve özellikle Parkinson hastalığında kizaz fonksiyonu7. LRRK2 kiyaz inhibitörleri geliştirilmiştir ve klinik çalışmalara giriyorsunuz2,4,12. Bu nedenle, lrrk2'nin hedef katılımı ve hasta tabakalaşması için bir biyomarker olarak sömürülmesine ihtiyaç vardır. Protokolümüz, insan periferik kan nötrofillerinin homojen hav...

Parkinson hastalığını (PH) yavaşlatmaya veya durdurma girişimleri şimdiye kadar başarısız oldu. Lösin zengin tekrar kilaz 2 hiperaktivasyon mutasyonlarının keşfi (LRRK2) neden ve / veya PH riskini artırmak LRRK2 kiyaz inhibitörlerigelişimineyol açmıştır1 ,2,3. Bunlar artık klinikçalışmalaragirdik 4 . LRRK2 tam işlevi belirsizdir, ama büyük bir ilerleme Rab GTPase proteinlerin bir alt kümesinin belirlenmesi olmuştur, Rab10 dahil, LRRK2 kisenin ilk iyi niyetli fizyolojik substratları olarak5,6,7. Hastalık değiştirici terapötikler çağında kisa ların temel zorlukları LRRK2 kizaz aktivasyon durumunun biyokimyasal belirteçleri ve LRRK2 kiyaz inhibitörlerinin hedef katılımıdır.
Şimdiye kadar, vivo LRRK2 inhibitörleri için temel farmakokinetik belirteç lrrk2 kurucu fosforile serin kalıntıları bir küme olmuştur, özellikle serine 935, çeşitli LRRK2 inhibitörleri yanıt olarak fosforilted hale8,9. Ancak, serine 935 fosforilasyon doğrudan LRRK2 tarafından fosforile değildir ve hala kilaz-inaktif LRRK210fosforile çünkü içsel hücresel LRRK2 kiziz aktivitesi ile ilişkili değildir. LRRK2 kinasaktivitesi serin1292 otofosforilasyon ile iyi ilişkilidir, ama pratik açısından bu site için güvenilir ve fosfospesifik antikorların mevcut eksikliği nedeniyle tüm hücre özleri immünoblot analizi ile endojen LRRK2 kinaz aktivitesi için uygun bir okuma değil10,11.
Biz threonine 7311de fizyolojik hedef protein Rab10 LRRK2 kontrollü fosforilasyon ölçer insan periferik kan hücrelerinde LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için sağlam ve kolay bir taht geliştirdik. Periferik kana, düşük riskli ve en az rahatsızlığa neden olan hızlı bir işlem olan venekesit ile kolayca ulaşılabilir. Onlar bol (tüm beyaz kan hücrelerinin% 37-80) ve hem LRRK2 ve Rab1011nispeten yüksek düzeyde ifade homojen hücre popülasyonu oluşturmak çünkü biz insan periferik kan nötrofiller odaklanmak. Ayrıca, periferik kan nötrofilleri immünomanyetik negatif yaklaşım la hızlı ve verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonraki gözlenen Rab10 fosforilasyon LRRK2 aracılık olduğundan emin olmak için, nötrofil her toplu veya güçlü ve seçici LRRK2 kiyaz inhibitörü olmadan kuluçka (biz kullanmak ve MLi-2 tavsiye)2,12. Bu daha sonra proteaz inhibitörü diisopropil florofosfat içeren bir tampon hücre lisis i takip (DIFP), nötrofiller yüksek olduğu bilinen içsel serin prote proteaz aktivitesini bastırmak için gerekli olan13. Kantitatif immünoblotting tarafından son analiz için, özellikle Rab10 Thr73-fosfoepitop algılar ve diğer fosforile Rab proteinleri ile çapraz tepki vermez MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor kullanmanızı öneririz14. Bu antikor seçiciliği ve özgüllüğü farklı Rab proteinleri ve A549 Rab10 knock-out hücre hattı14aşırı ekspresyon modellerinde doğrulanmıştır. Böylece, güçlü ve seçici LRRK2 kinaz inhibitörü2ile tedavi edilmiş nötrofil lysates Rab10 fosforilasyon farkı ölçmek . Alternatif olarak, örnekler nicel kütle spektrometresi gibi diğer yöntemlerle de analiz edilebilir.
Sonuç olarak, LRRK2 kontrollü Rab10 fosforilasyon serin 935 de LRRK2 fosforilasyon LRRK2 kiziaz aktivitesinin üstün bir belirteç ve insan periferik kan nötrofiller LRRK2 içine PD araştırma için değerli bir kaynaktır. Protokolümüz periferik kan nötrofillerinde LRRK2 yol aktivitesini sorgulamak için sağlam ve kolay bir tahkikat sağlar ve artmış LRRK2 kinaz aktivitesi15olan bireylerin biyokimyasal tabakalaşmasını sağlar. Daha da önemlisi, bu tür bireyler gelecekteki LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilirler.

<table><tbody><tr><td>1 mL Pipet uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikro tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>10 mL Pipet uçları&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025&nbsp;</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>10 & mu; L Pipet uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70.113</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>15 mL falcon tüpü&nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipet uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>25 mL Pipet uçları&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>50 mL şahin tüpü&nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Hemogard Kapatma Plastik K2-EDTA Tüpü</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD 367525</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-15R santrifüj</td><td>Beckman</td><td></td><td>veya 1000-1200 x g hızında 50 mL şahin tüpleri için yüzme kovası döndürücülü eşdeğer santrifüj</td></tr><tr><td>Kategori 2 biyolojik güvenlik kabini.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete(EDTA içermeyen) proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>DIFP (Diizopropilflorofosfat)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0879</td><td>Özel önlemler kullanarak izopropanol içinde 0.5M stok çözeltisi hazırlayın&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>6250</td><td></td></tr><tr><td>Kuru buz veya sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14190094</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet&nbsp;</td><td>1 x 50ml konik tüp tutmak için</td> <td>Kök Hücre</td><td>18002</td></tr><tr><td>EasySep Doğrudan İnsan Nötrofil İzolasyon Kiti&nbsp;</td><td>Kök Hücre</td><td>19666</td><td>Bu, " adı verilen Çözeltiler içerir. İzolasyon Kokteyli" ve " RapidSpheres manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf santrifüj 5417R santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, sprey şişesinde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol (susuz sınıf)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Lizis tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7.5, %1(h/h) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &beta;-gliserofosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.27 M sükroz, %0.1 (h/h) &beta;-merkaptoetanol, 1x cOmplete(EDTA içermeyen) proteaz inhibitör kokteyli (Roche), 1 & mu; g/ml Mikrosistin-LR, 0.5 mM diizopropilflorofosfat (DIFP).&nbsp;</td><td></td><td></td><td>alternatif olarak Microcystin-LR, DIFP içermeyen alikotlarda donmuş lizis tamponu MRC-PPU Reaktifleri (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td></tr> <tr><td>Merck LRRK2 inhibitörü II (MLi-2)</td> <td>Merck</td><td>438194-10MG</td><td>veya eşdeğeri (güçlü ve seçici LRRK2 inhibitörü)</td></tr> <tr><td>Microcystin-LR</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-350-012-M001</td><td>DMSO'da 1 mg / ml stok ve -80 oC'de saklayın.</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx tarama Western Blot görüntüleme sistemi</td><td>Odyssey</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalıcı işaretleyici kalem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kişisel koruma ekipmanı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>sodyum pirofosfat</td><td>Sigma</td><td>S22</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -gliserofosfat</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Western blot için önerilen antikorlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-RAB10 (fosfo T73) antikoru [MJF-R21]</td> <td>abcam</td><td>ab230261</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-tubulin</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>5174</td><td>1:2000 seyreltmede kullanılır</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IRDye 680LT</td><td>LI-COR</td><td>926-68020</td><td>1:10.000 seyreltmede kullanılır</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>1:10.000 seyreltmede kullanılır</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td>, nanoTools (nanotools.de) tarafından üretilen <td>1: 10.000 seyreltme</td></tr><tr><td>MJFF-total Rab10 fare antikorunda</td><td></td> kullanılır, <td>uygulanamaz *</td> <td>2 & mu'da kullanılır; g/ml nihai konsantrasyon; * nanoTools (www.nanotools.de) [11] tarafından üretilen MJFF-total Rab10 antikoru, 2018'de Michael J Fox Vakfı tarafından ticarileştirilecektir</td></tr>. <tr><td>Fare anti-LRRK2 C-terminal antikoru</td><td>Antikorları Dahil...</td><td> 75-253</td><td>1 & mu'da kullanılır; g/ml nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>pS935-LRRK2</td><td>MRC PPU Reaktifleri ve Hizmetleri</td><td>UDD2</td><td>1 & mu'da kullanılır; g/ml nihai konsantrasyon</td></tr></tbody></table>

rab10 fosforilasyon değerlendirilmesi tarafından parkinson İlişkili lrrk2 kinas yolu sorgulama için İnsan periferik kan nötrofil İzolasyon

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Lösin zengini tekrarlayan kiziaz 2 (LRRK2) kalıtsal Parkinson hastalığında (PH) en sık mutasyona uğrayan gendir ve tüm patojenik LRRK2 mutasyonları kizaz fonksiyonunun hiperaktivasyonuile sonuçlanır. Burada, fizyolojik substratlarından biri olan Rab10'un threonine 73'teki LRRK2 kontrollü fosforilasyonunu ölçerek insan periferik kan nötrofillerindeki LRRK2 kiyazı yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir tahkikat tanımlıyoruz. Açıklanan immünolot analizi, MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor gibi LRRK2 tarafından fosforile rab10 Thr73 epitopunu tanıyan tam seçici ve fosfospesifik antikor gerektirir. Periferik kan kolayca erişilebilir ve nötrofiller bol ve homojen bir bileşen dir, çünkü insan periferik kan nötrofilkullanır. Daha da önemlisi, nötrofiller hem LRRK2 hem de Rab10'un nispeten yüksek düzeylerini ifade eder. Nötrofillerin potansiyel bir dezavantajı yüksek içsel serin proteaz aktivitesidir, bu da lisis tamponunun bir parçası olarak organofosfor nörotoksin diisopropilorofosfat (DIFP) gibi çok güçlü proteaz inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo LRRK2 kiyazı yolu aktivitesi araştırma için değerli bir kaynak ve PD biyorepozitory koleksiyonlarına dahil edilmesi için düşünülmelidir.

Bizim taht bir okuma olarak LRRK2 bağımlı Rab10 fosforilasyon ile insan periferik kan nötrofillerinde PD ilişkili LRRK2 kizaz aktivasyonu sorgulama sağlar. Nötrofiller, hem LRRK2 hem de Rab10 proteinlerinin yüksek düzeylerini ifade eden homojen ve bol periferik beyaz kan hücresi popülasyonudur(Şekil 1). Kalan periferik kan mononükleer hücreleri arasında kalan tek hücre popülasyonu (PBMCs) her iki proteinin yüksek kopya numaraları monositler, ancak bu beyaz kan hücrelerinin sadece% 2-12 makya...

Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Bu işlemin genel amacı insan periferik kan endojen LRRK2 kinaz aktivitesini değerlendirmek için bir yöntem sağlamaktır. Bu, Michael J.Fox Vakfı fosfospesifik Rab monoklonal antikorların kullanımı yla Rab proteinlerinin LRRK2 aracılı fosforilasyonunun izlenmesiyle elde edilir. Burada, hem Rab2 hem de Rab10 yüksek ekspresyon düzeyleri ile homojen site popülasyonunun bir parçası olarak insan periferik kan nötrofiller üzerinde duruluyor.Nötrofil izolasyonu, bitmiş eylem 40 dakika içinde% 99 saf ve canlı nötrofillerizolasyon sağlar aynı zamanda protein düzeyleri yüksek miktarda verim negatif bir seçim dayanmaktadır. Bir kan toplama tüpü içine 10 mililitre kan toplamak. Tüpleri 7-8 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.50 mililitrelik konik bir tüpe 10 mililitre kan aktarın. Kana 100 mikrolitre EDTA stok çözeltisi 1, 0.1 molar EDTA PBS Çözeltisi ekleyin, hafifçe karıştırın. Nötrofil izolasyon kitinden tüm kan örneğine 500 mikrolitre izolasyon kokteyli, mililitre başına 50 mikrolitre ekleyin.Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 saniye boyunca girdaplayın. Kan örneğine 500 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.EDTA stok çözeltisi 2 ile 50 mililitreye kadar tüp toplayın. Bu bir milimolar EDTA PBS Çözümü. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetting tarafından karıştırın.Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat. Dikkatle pipet yeni bir 50 mililitre konik tüp içine nötrofiller içeren hücre süspansiyon zenginleştirilmiş.Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyon yaklaşık 10 mililitre bırakın. Kullanmadan önce 30 saniye boyunca vortex manyetik boncuklar ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp 0.5 mililitre manyetik boncuk ekleyin.Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yat. Dikkatle pipet yeni bir nötrofil içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon 50 mililitrekonik tüp. Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın.Tüpün altında süspansiyon yaklaşık beş mililitre bırakın. Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat.Dikkatle pipet şimdi yeni bir 50 mililitre konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon. Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Tüpün altında yaklaşık beş mililitre süspansiyon bırakın.Yaklaşık 41 mililitre lik son hacmine kadar bir milimolar EDTA stok çözeltisi 2 ile izole hücreleri toplayın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için. Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mililitre olan iki tüpe eşit olarak bölün.335G'de her iki tüpü de beş dakika santrifüj edin. Santrifüj adımı sırasında, MLi-2 inhibitör stok, eksi 80 derece dondurucu dışında 200 mikromolar eğik 1000X konsantrasyonu almak ve sonraki kullanım için oda sıcaklığında bırakın. Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün.hücre lerini dört kez hafifçe borulandırarak oda sıcaklığında 10 mililitre hücre kültürü ortamıiçinde her hücre peletini yeniden askıya alın. Etiket bir tüp DMSO ve diğer tüp MLi-2. DMSO etiketli tüp için 10 mikrolitre DMSO ekleyin ve karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından 200 mikromolar MLi-2 stok çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka örnekleri. Kuluçka döneminde her 10 dakikada bir ters çevrilerek hafifçe karıştırın. 30 dakika LRRK2 kinaz inhibitörü tedavisi sırasında eksi 80 derece dondurucu dan 0,5 molar DIFP stok çözeltisi kaldırmak ve buz üzerinde duman kaputyerleştirin.Daha sonra, eksi 80 derece dondurucu dan mililitre Microcystin-LR stok çözeltisi başına bir miligram hareket ve çözülmek için oda sıcaklığında yer. Bir aliquot, dondurucu dan çıkararak lysis tampon 0.25 mililitre defrost, oda sıcaklığında defrost izin ve daha sonra kullanmak için buz üzerine yerleştirin. DMSO bir mikrolitre içeren RPMI orta bir mililitre hazırlayın bu DMSO Resuspension Tampon diyoruz.200 mikromolar MLi-2 veya alternatif LRRK2 kiyazı inhibitörü bir mikrolitre içeren RPMI orta bir mililitre hazırlayın ve bu MLi-2 Resuspension Tampon diyoruz. 30 dakikalık kuluçka döneminden sonra, her iki tüpü de 335G'de her iki tüpü de daha önce olduğu gibi beş dakika santrifüj edin. Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.DMSO etiketli tüp için, bir mililitre DMSO Resuspension Tampon'da peleti hafifçe yeniden askıya alın. Ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 Resuspension Tampon bir mililitre pelet resuspend. Yeniden askıya alınan hücre peletlerini DMSO ve MLi-2 etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 335G'de üç dakika santrifüj edin.Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputunda, 0,25 molar DIFP çözeltisinin 0,25 mikrolitreyanı nın yanı sıra 0,25 mililitrelik lisis tamponuna mililitre başına bir miligram mikrolitre mikrolitre ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin. Hemen her tüp için DIFP ve mikrosistin-LR içeren lysis tampon 100 mikrolitre ekleyin. 100 ila 200 mikrolitrelik pipet kullanarak, hücre peletlerini yaklaşık 5-10 kez yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.Hücreleri 10 dakika boyunca buzun üzerinde yat. Sonra, 20,000 kez G'de santrifüj tüpleri hücre enkazLarını temizlemek için 15 dakika boyunca 4 derece santigrat derece. Transfer DMSO ve MLi-2 supernatant içeren nötrofil lysates yeni santrifüj tüpleri içine.Enkaz peletlerini atın. Nötrofil lysates şimdi kullanıma hazır veya sıvı azot dondurulmuş ve gelecekteki analiz için eksi 80 derece saklanabilir. Kamuya açık ithalat veritabanından elde edilen verileri kullanarak, bu grafik LRRK2 ve Rab10 proteinlerinin bir bolluk insan periferik kan nötrofiller ve monositler özellikle yüksek olduğunu göstermektedir.Bu işlem ile insan periferik kan nötrofilleri izole hücrelerin yüksek kirli verim sonuçları. Üstteki tablo, üç sağlıklı donörden 10 mililitre periferik kandan izole edilen toplam hücre sayısını gösteriyor. Ayrıca izole hücrelerin saflığı ve canlılığının yanı sıra toplam protein lisat verimi de gösterilmiştir.LRRK2 kinaz inhibitörü, MLi-2 ile ve olmadan tedaviden sonra nötrofiller güçlü proteaz inhibitörü, DIFP varlığında lysed edilir. Sol taraftaki Şekil B için, şerit başına 10 mikrogram tüm hücre ekstresi belirtilen antikorlarla çokkatlı kantitatif immünoblot analizine tabi tutuldu. Sağdaki figür, C, büyük LRRK2 proteini başta olmak üzere, proteolitik bozulmanın önlenmesi için DIFP önemini göstermektedir.Buna karşılık, pmsf yüksek konsantrasyonlarda tek başına daha az etkilidir. Burada lrrk2 kontrollü Rab10 fosforilasyon önemli ölçüde kontrollere göre heterozigot VPS35 D620N mutasyonu barındıran kalıtsal Parkinson hastalığı olan hastalardan elde edilen periferik kan nötrofillerinde yaklaşık üç kat arttığı gösterilmektedir. Üst grafik multipleks immünoblot analizini ve alt kısmını, bunların niceliğini gösterir.Bu, VPS35 D620N mutasyonunun henüz bilinmeyen bir mekanizma ile LRRK2 kinazisi aktive ettiğini göstermektedir. Özetle, rab10 gibi Rab protein fosforilasyonlarını insan periferik türevi nötrofillerde izleyerek LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir analiz salıyoruz, bu yöntem LRRK2 yol aktivitesini değerlendirmemize ve mutasyonların, hastalık durumlarının veya inhibitörlerinin LRRK2 yol aktivitesini nasıl modüle ettiğini belirlememize olanak sağlar.

human-peripheral-blood-neutrophil-isolation-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Lipoksijenaz (LOX) izozimler nöroinflamatuarasyonu ve nörodejenerasyonu artırabilecek veya azaltabilecek ürünler üretebilir. Gen-çevre etkileşimi çalışması LOX izozime özgü etkileri tanımlayabilir. İki LOX izozim eksikliği olan transgenik çizgilerde nigrostriatal hasarın 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) modelinin kullanılması, LOX izozimlerinin dopaminerjik bütünlük ve inflamasyona katkısının karşılaştırılmasını sağlar.

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Nötrofiller sadece istilacı mikroorganizmalara karşı konak savunmasında değil, aynı zamanda tümör hücrelerinin immün sürveyansında da önemli bir rol oynarlar. Burada, anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ile ilgili teknikleri ve in vitro ve in vivo olarak anti-tümör nötrofil fonksiyonunu izleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Bu çalışma, Parkinson hastalığının bu klinik öncesi modelinde nöroinflamasyonu, nörodejenerasyonu ve motor bozukluğu indüklemek için gereken vektör dozunu ve maruz kalma süresini analiz etmektedir. İnsan α-sinükleini kodlayan bu vektörler, Parkinson hastalığı ile ilişkili sinüklein patolojisini özetlemek için substantia nigra'ya verilir.

İnsan α-Sinükleini Kodlayan Adeno İlişkili Viral Vektörler Tarafından İndüklenen Parkinson Hastalığı Fare Modelinin Analizi

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Öğrenin, insan periferik kan nötrofillerinde LRRK2 kinaz aktivitesini Rab10 fosforilasyonu üzerinden değerlendirmek için güvenilir bir yöntem. Bu yaklaşım, kalıtsal Parkinson hastalığı riski taşıyan bireyleri belirlemeye yardımcı olur.

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon (Video) | JoVE Journal

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

Daha fazla video keşfet