Name: Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Keşfedin, Iodide-YFP-GJIC yöntemiyle LN215 hücre hatları kullanarak gap junction hücreler arası iletişimi yüksek verimli tarama. Bu güvenilir ve ekonomik analiz, ilaç keşfi ve toksikolojik değerlendirme için gap junction modülatörlerini tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 ve 2018R1A6A1A03023718).

1. nesil YFPQL ve SLC26A4 ifade lentiviruses
<ol><li>HEK293T insan embriyonik böbrek hücreleri % 80 100 mm Kültür tabaklarda confluency büyümek. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM) boyunca protokolünün HEK293T ve aşağıda belirtilen diğer hücreleri korumak için kullanılan kültür ortamıdır.</li>
	<li>Her şey 10 dakika süreyle 2 mL steril poli-L-lizin (PLL) çözüm %0,005 ekleyerek kat 6-şey kültür tabak PLL çözüm Aspire edin ve yüzey iki kez 2 mL steril su ile durulayın.</li>
	<li>Yıkama HEK293T hücreleri ile fosfat 10 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış ve 3 dk. eklemek 5 mL kültür ortamının için 37 ° C'de 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile her 100 mm çanak içinde hücre monolayers tedavi ve hücreleri resuspend.</li>
	<li>Bir hemasitometre hücreleri saymak ve 250.000 hücre/ml kültür ortamında hücre süspansiyon yoğunluğunu ayarlamak ve 500.000 hücreler kültür orta 2 mL için lisin kaplı de 6-şey plakaları ekleyin. Oksijen 5 hücrelerde kuluçkaya % CO2/95% hava atmosfer 24 h 37 ° C'de ve kültür orta DMEM ile penisilin veya streptomisin değiştirir.</li>
	<li>Bir 1,5 mL tüp transfection reaktif 20 µL DMEM 500 µL serum veya antibiyotik olmadan ile sulandırmak. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve 5 min için oda sıcaklığında bekletin.</li>
	<li>Bu arada, DMEM 250 µL her iki 1,5 mL tüpler içine pipet ve 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL veya pLenti6P-SLC26A4, psPAX2, 1225 ng ve 375 ekleyin her pMD2.G ng. İki lentiviral plazmid yukarıda açıklanan21olmuştur. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya seyreltilmiş transfection reaktif 250 µL her plazmid tüp ekleyin.</li>
	<li>20 dk sonra transfection reaktif ve plazmid kompleksleri 500 µL 1,5 mL tüplerde dropwise her kültür tabağına de adım 1.4 ve mix tabak ileri geri sallanan tarafından ekleyin. CO2 kuluçka için 12 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Orta ile 2.5 mL taze orta değiştirmek ve ek bir 48 saat için kuluçkaya. Sonra kültür plaka buz infektivite korumak için soğutulmuş lentivirus içeren şartına orta tutmak 5 min için yerleştirin.</li>
	<li>Lentiviruses içeren medya hasat ve 15 mL konik tüpler için transfer. 3000 x g 3 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve kayan HEK293T hücreleri süpernatant 0.4 µm, filtrasyon sayesinde kaldır.</li>
	<li>Lentiviruses 2 gün içinde kullanılmak üzere 4 ° C'de içeren medyayı depolamak. Daha sonra kullanmak üzere saklamak 200 µL aliquots −80 ° C.</li>
</ol>2. nesil LN215-YFPQL ve LN215-ı− hücreleri tarafından lentiviral iletim
<ol><li>100 mm Kültür plakaları LN215 hücrelerde % 80 ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) 100 U/mL penisilin ve yukarıda açıklandığı gibi 100 µg/mL streptomisin takıma DMEM confluency büyür. Not: Eğer ben-YFP-GJIC tahlil farklı hücre satırı kullanarak yapılır, uygun kültür aracı kullanın. LN215-YFPQLve LN215-ı- hücreleri Yonsei Üniversitesi Üniversite-Sanayi Vakfı tarafından sağlanan. Lütfen ilgili yazarına başvurun.</li>
	<li>Bir gün önce iletim, yıkama hücreleri iki kez PBS 10 mL ile % 0.25 tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° C'de 2 mL ile tedavi 5 mL 10 mL gonore pipet ile kültür ortamının hücrelerde Resuspend ve 50. 000 hücre/ml yoğunluğu ayarlayın. 20.000 hücre medya 400 µL içinde her şey için tedavi hiçbir virüs denetimi, YFPQLve SLC26A4 hücreleri olarak 24-şey kültür plaka ekleyin.</li>
	<li>PLVX-EIP-YFPQL veya pLenti6P-SLC26A4 lentivirus ve taze kültür polybrene, 4 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma orta 1:1 karışımı 400 µL kültür orta değiştirerek, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra iki kuyu transduce. Hiçbir virüs denetimler için kültür orta ile değiştirin.</li>
	<li>15 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya, lentiviruses içeren orta Aspire edin, taze kültür orta eklemek ve bir ek 72 h için hücreleri kuluçkaya. Dikkat: kültür lentivirus içeren orta Aspire edin veya taze büyüme orta dağıtmak lentivirus kuyular arasında kirlenmesini önlemek için yeni ip uçlarına ya da pipets her şey için kullanın.</li>
	<li>3 dk. Resuspend için kültür orta 2 mL hücrelerde ve 2 µg/mL puromisindir ile altı-şey kültür tabak tabak her hücrelere de iki kez PBS 0.5 mL ile tripsin-EDTA 300 µL ile tedavi yıkama.</li>
	<li>Denetimdeki tüm hücreleri de ölünceye kadar 2 µg/mL puromisindir içeren medya hücrelerde Kültür (yuvarlak şekilli veya mikroskobu gözlenen yüzen), genellikle bir hafta sürer. Kültür puromisindir her geçen gün seçim döneminde içeren medya yenileyin. Eğer LN215 YFPQL veya LN215-ı- seçim tamamladı önce haline kültürler birleşmesi, 100 mm hücrelere plaka ve seçim adım 2,5 olduğu gibi devam transfer.</li>
</ol>3. hazırlık tahlil için gerekli çözümleri
<ol><li>500 mL C-çözüm (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2ve 1 mM CaCl2) ve ben-çözüm (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glikoz, 5 mM KCl ve 1 mM CaCl2) 500 mL hazırlayın.</li>
	<li>7.4 1 N NaOH ile her iki çözüm pH ayarlama, çözümler depolama için 0.4 µm, filtrations tarafından sterilize. 4 ° C'de 1 ay için saklayın. PH kullanmadan önce kontrol edin.</li>
</ol>4. LN215-YFPQL ve LN215 kaplama-ben− hücreleri
<ol><li>LN215-YFPQL ve LN215 kültür-ben 100 mm Levha ayrı ayrı kültür tayini için gerekli populasyonlarının reach için orta− hücrelerde. LN215-YFPQL ve LN215-ı−</li><li><li></li><li></li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li></li><li> <ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li></ol></li><li></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq2.jpg"> </li></ol>

<ol><li>Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins%2C+connexons%2C+and+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity%3A+Structure-Function+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).</li>
<li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li>
<li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li>
<li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li>
<li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li>
<li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li>
<li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia%2Freperfusion+injury%2C+cardioprotection+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li>
<li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li>
<li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li>
<li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging%3A+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+2+%2C+6+%2C+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-Loading+and+Dye+Transfer%3A+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advancement+of+Science%22%5BJournal%5D)">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li>
<li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909(2005).</li>
<li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li>
<li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li>
<li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li>
<li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li>
<li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li>
<li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li>
<li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+%2F+c+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li>
<li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+Connexin+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Connexins%22%5BJournal%5D)">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li>
<li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap%5BTitle%5D)+AND+%22Junctional+Intercellular+Communication%22%5BJournal%5D)">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Sağlam, hızlı ve ucuz olduğu için ben-YFP-GJIC tahlil HTS için kullanılabilir. Bir HTS tahlil sağlam kabul edilir eğer Z'-0.525bir faktördür. Zhang ve ark. bkz: HTS deneyleri25uygunluğunun değerlendirilmesi için kullanılan istatistiksel analiz açıklaması için. LN215 hücreler kullanıldığında, Z'-faktör oldu > 0,5 olmadan herhangi bir tahlil en iyi duruma getirme. Diğer hücre tipleri tahlil ve onun Z kullanılan Eğer '-faktör < 0.5, sağlamlık geliştirilmiş olabilir tahlil saat...

Gap kavşak (GJs) hareket hücreler arası kanalları küçük moleküllerin difüzyon izin vermek için < 1 kDa besin, metabolitleri ve bitişik hücreler arasında sinyal molekülleri gibi. Bileske öğeleri hemichannel veya connexon her hücrede içerir ve her connexon altı connexins (Cxs)1teşkil eder. GJs ve Cxs gibi GJ inhibitörleri2,3,4olan aromatik polisiklik hidrokarbonlar (PAH), karsinojenler, toksikoloji deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Kesintiye GJIC nongenotoxic karsinojenezis5,6ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Potansiyel terapötik hedef olarak, belirli alt türlerinden nöbetler7,8, kalp ve beyin iskemi/reperfüzyon hasarı9, migren aura10ile koruma GJ tutulum bildirilmiştir, ilaca bağlı karaciğer hasarı6,11ve12şifa yara. Yüksek işlem hacmi (HTS) eleme deneyleri GJ oransal kimyasal madde veya ilaç bulma, toksikoloji deneyleri için için antikorlar tanıtmakta ve Roman hücresel düzenleyiciler GJ faaliyet tanımlamak için gereklidir. HTS deneyleri GJ modülatörler2,13,14,15yapısı-aktivite ilişkileri araştırmak için kullanabilirsiniz.
Bazı GJIC deneyleri boya transferi veya ikili yama kelepçe teknikleri içerir. Lucifer sarı CH (LY) ve calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) boya-devret deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Hücreler LY, mikroenjeksiyon, yükleme kazıma veya Elektroporasyon tarafından kullanılmaya geçirgen değildir. Bir kez hücre içindeki komşu hücreleri yoluyla GJs LY yayılır ve GJ etkinlik LY geçiş16ölçüde tarafından denetlesinler. Calcein-AM deneyleri genellikle photobleaching17,18sonra boşluk-floresan kurtarma içerir. Calcein-AM intracellularly geçirimsiz calcein tarafından içsel bir esteraz dönüştürülür bir hücre permeant boya var. Tahlil bu lazer photobleaching takip çevresindeki bir hücreye calcein-AM transferini gözlemlemek için confocal mikroskop gerektirir. Fonksiyonel GJs varsa, calcein-AM bitişik hücrelerde photobleached hücreleri girer ve floresan kurtarılır. GJ faaliyet photobleached hücrelerinin floresans kurtarma ölçüde tarafından denetlesinler. Boya-devret deneyleri zahmetli ve zaman alıcı veya düşük hassasiyetleri sahip. İkili yama sıkma bileske gürültülerinden ölçer elektrofizyolojik bir yöntemdir. Gürültülerinden doğrudan bir bağımlılık açık GJs19sayısı ile oldukça hassas; Ancak, bu teknik olarak talep, zaman alıcı ve pahalı20. Ben-YFP-GJIC tahlil HTS. kullanım için geliştirilmiştir
Şekil 1 gösterir bileşenleri ve alıcısı hücreleri H148Q ve I152L taşıyan bir iyodür duyarlı YFP değişken ifade kullanır-YFP GJIC tahlil adımlardan (YFPQL) ve donör hücreleri bir iyodür ışınlama (SLC26A4) ifade21 . YFPQL tarafından yapılan iki mutasyon floresans iyodür22tarafından Şoklama izin. İodides Co kültürlü alıcısı ve donör hücreleri eklenir; alıcısı hücreleri girmez ancak mevcut SLC26A4 taşıyıcıları tarafından donör hücreleri alınır. İodides donör hücreleri işleyen GJs nerede YFPQL floresans gidermek bitişik alıcısı hücrelere yaygın. GJs kapalı veya inhibitörleri tarafından bloke, iyodür floresans gidermek için alıcısı hücreleri giremezsiniz. YFPQL su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Ben-YFP GJIC tahlil ne karmaşık ne de zaman alıcı bir işlemdir. HTS ile uyumlu ve nispeten kısa bir süre içinde GJ etkinlik bileşikler çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılabilir. Sadece alıcısı ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözüm gerektirir. Aşağıda açıklanan protokol önemli olan Cx Cx4321yaşında LN215 hücreleri temel alan. LN215-YFPQL reseptörü ve LN215-ı− donör hücreleri YFPQL veya SLC26A421,23ifade lentiviruses ile iletim tarafından üretilen.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td> <td>Sigma</td><td>C5670</td><td>I-çözelti</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C-çözeltisi, I-çözelti</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>RES6003H-B7</td><td>C-çözeltisi, I-çözelti</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2 6H2O)</td> <td>Sigma</td><td>M2393</td><td>C-çözeltisi</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu ve nbsp;</td><td>BMG Laboratuvar Teknolojisi&nbsp;</td><td>POLARstar Omega 415-1618</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G&nbsp;</td><td>Addgene</td> <td># 12259</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin çözeltisi</td><td>sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P5405</td><td>C-çözeltisi, I-çözelti</td></tr><tr><td>psPAX2 & nbsp;</td><td>Ekleyin</td><td>&nbsp;#12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin Dihidroklorür</td><td>sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>C-çözeltisi, I-çözelti</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum İyodür (NaI)</td><td>Sigma</td><td>383112</td><td>I-çözeltisi</td></tr></tbody></table>

bir iyodür-sarı floresan protein-gap junction hücreler arası iletişim tahlil

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Gap kavşak (GJs) bitişik hücreler arasında 1 kDa daha küçük moleküllerin difüzyon izin hücre zarı kanallar vardır. Fizyolojik ve patolojik rollere sahip olduğu ilaç bulma ve toksikoloji deneyleri GJ modülatörler tanımlamak için lüzum-in yüksek-den geçerek (HTS) eleme deneyleri. Bir roman iyodür-Sarı floresan protein-gap junction hücreler arası iletişim (ı-YFP-GJIC) tahlil bu ihtiyacı karşılamaktadır. Stabil olan floresans hassas iyodür veya SLC26A4, bir iyodür taşıyıcı tarafından sırasıyla söndürülür bir sarı floresan protein (YFP) değişken ifade etmek için tasarlanmıştır alıcısı ve donör hücreleri de dahil olmak üzere hücre tabanlı bir tahlil olduğunu. İyodür iki hücre tiplerinin karışık bir kültüre eklendiğinde, donör hücreleri ile SLC26A4 taşıyıcı girin ve nereye YFP floresan gidermek GJs ile bitişik alıcısı hücrelere diffüz. YFP floresan iyi iyi bir kinetik modunda ölçülür. YFP su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Güvenilir ve HTS. için kullanılacak hızlı tahlil LN215 hücreleri, insan gliyom hücreleri, kullanarak ben-YFP-GJIC tahlil için protokol açıklanmıştır.

29 96-şey kültür plakaları istimal belgili tanımlık LN215-YFPQL ve LN215-YFP GJIC tahlil tarafından roman GJIC modülatörler tanımlamak için 2,320 kimyasallar ekran için kullanılmıştır-ben− hücreleri. Temsil edici bir plaka ile elde edilen sonuçlar Şekil 2' de gösterilir. Her iyi YFP floresan yüzdesi Şekil 2A bir çizgi grafik olarak gösterilir ve her şey GJIC etkinlik yüzdesini <strong class=...

Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Gap kavşakları uyuşturucu hedefleri olarak öne sürülmüşlerdir. Iodide-YFP-GJIC tsöplisi, boşluk bağlantı modülatörlerini keşfetmek için yüksek iş leme taraması ile uyumludur. Nispeten kısa bir süre içinde boşluk kavşak faaliyetleri üzerinde bileşiklerin çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılmıştır.Iodide-YFP-GJIC analizi basit, sağlam, tekrarlanabilir ve ucuzdur. Bu töz sadece kabul ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözeltisi gerektirir. Lucifer sarısı ve Calcein gibi ek reaktifler gerekmez.Ayrıca tek bir kuyudaki hücrelerin toplam boşluk kavşak aktivitelerini ölçer ve bu da iyi-değişkenlik arasında düşük bir sonuç verir. Bu yordamı başlatmak için ln215 hücreleri büyümek 80% metak ile eklenmiş DMEM metin protokolünde belirtildiği gibi. Transdüksiyondan bir gün önce hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Hücrelere %0.25 tripsin EDTA'dan iki mililitre ekleyin ve 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak, beş mililitre lik kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya almak ta ve hücre yoğunluğunu mililitrede 50.000 hücreye ayarlar. 24 kuyulu bir kültür plakasının her kuyuya 20.000 hücre içeren 400 mikrolitre medya ekleyin.24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün mililitre başına dört mikrogram lık son konsantrasyonda polibren ile desteklenen bir lentivirüs ve taze kültür ortamının bire bir karışımının 400 mikrolitresi ile kültür ortamını değiştirerek iki kuyu yuvarlayın. Hiçbir virüs kontrolleri için mililitre başına dört mikrogram son konsantrasyonda polibren ile takviye taze kültür ortamı ile kültür ortamı değiştirin.15 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Sonra lentiviruses içeren orta aspire, ve taze kültür orta. Hücreleri 72 saat ek olarak 37 derecede kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, 0,5 mililitre PBS ile her kuyudaki hücreleri iki kez yıkayın. Hücrelere %0,25 tripsin EDTA'dan 300 mikrolitre ekleyin ve 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. İki mililitre kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve mililitre püromisin başına iki mikrogram ile altı kuyulu kültür plakalarına koyun.Kültür kontrol kuyularında tüm hücreler ölü kadar hücreleri, genellikle yaklaşık bir hafta sürer. İlk olarak, ayrı ayrı kültür LN215-YFP ve LN215-iyodür hücreleri 100 milimetrelik plakalar kültür ortamda tsurel için gerekli popülasyonlara ulaşmak için. Bir gün önce, pbs 10 mililitre ile her plaka yıkayın.Her plakayı %0,25 tripsin EDTA çözeltisi ile iki mililitre ile tedavi edin ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Dört mililitre kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri peletlemek için üç dakika için 1,000 g santrifüj.Supernatant atın ve kültür orta beş mililitre her hücre pelet resuspend. Pipet herhangi bir hücre kümeleri kırmak için yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.Ve sonra burada gösterilen yoğunluklarda hücre süspansiyon yapmak için kültür ortamı hücreleri seyreltmek. Daha sonra, her hücre süspansiyonunun yedi mililitresini bir rezervuarda karıştırın. 96 kuyulu bir kültür plakasının her kuyusu için bu karışımın 100 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.24 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. İlk olarak, 96 kuyulu plakaları kontrol etmek için 20X büyütmeli floresan mikroskobu ve GFP filtresi kullanın. Bir mikroplaka okuyucuaçmak ve 37 santigrat dereceye ayarlamak önce en az 30 dakika.Otomatik bir enjektörün tüpünü üç mililitre 70%etanol, üç mililitre distile su ve üç mililitre I-çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra, C ve I-çözeltilerini su banyosunda 37 dereceye ısıtın. Ya büyüme ortamını aspire edin ya da boşaltmak için plakayı ters çevirin.Artık ortama dokunun. Daha sonra plakanın her kuyusu için 200 mikrolitre C-çözeltisi eklemek için çok kanallı pipet kullanarak bir rezervuara C-çözeltisi ekleyin. Ya çözeltiaspire veya plakayı ters çevirerek boşaltmak için, artık çözeltiyi dışarı atamasını sağlar.Her kuyuya 50 mikrolitre C-çözeltisi ekleyin. Daha sonra bir araç olarak 2,5 milimolar kimyasal stok veya DMSO bir mikrolitre ekleyin ve her kuyuya 50 mikrolitre C-çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 derecede havada yaklaşık 10 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sırasında, Protokolleri Yönet düğmesini tıklatarak mikroplaka okuyucu programındaki parametreleri ayarlamaya başlayın. Yeni düğmesini tıklatın. Ölçüm Yöntemi bölümündeFloresan Yoğunluk ve Okuma Modu bölümünde Kimod'u seçin.Ardından, Tamam düğmesini tıklatın. Yeni bir sekme görüntülenir. Temel Parametreler menüsünde Uyarma dalga boyu 485 nanometre, Emisyon ise 520 nanometre olarak belirlenmiştir.Floresan'ı alttan okumak için Alt optik'i seçin. Daha sonra ölçüm başlangıç saatini sıfır saniye, aralık ların sayısı 25, kuyu başına yanıp sönme sayısını ve 20 olmak üzere aralık sayısını ve aralık süresini 0,4 saniye olarak ayarlayın. Düzen menüsünde okunacak plakanın bir bölgesini çizin.Konsantrasyonlar/Hacimler/Shacking menüsünde mikroplaka okuyucu, saniyede 135 mikrolitre enjeksiyon hızıyla her kuyuya 100 mikrolitre I-çözelti enjekte etmeye ayarlayın. Enjeksiyon Süresi menüsünde enjeksiyon başlangıç saatini bir saniye olarak ayarlayın. Ardından Ölçüm Başlat düğmesini tıklatın.Kuluçka tamamlandığında, 96 kuyulu plakaları mikroplaka okuyucuya aktarın ve yeniden Başlat ölçüm düğmesini tıklatarak ölçüme başlayın. Bu çalışmada, iyot-sarı floresan protein-gap kavşak-hücrelerarası iletişim testi LN215-YFP ve LN215-iyot hücreleri ile ekran 2, 320 kimyasallar yeni boşluk kavşak hücre içi iletişim modülatörleri tanımlamak için kullanılır. Homosalate'in hücre içi gap kavşağının %50'sini inhibe edilebistir.Terbinafine tamamen inhibe ederken. Bu bir boşluk kavşak inhibitörü olarak terbinafine doğrular. Bu titreci, komşu donör ve kabul eden hücreler arasındaki GJIC'yi ölçer, bu nedenle donör ve kabul eden hücreler kaplamadan önce tamamen ayrıştırılmalıdır.Ve karışık kültürün birleşimi hücreler arasındaki boşluk kavşaklarının oluşumunu en üst düzeye çıkarmak için %100 olmalıdır. Zaman ders verileri, doz yanıt ilişkileri ve gap kavşak modülatörlerinin geri döndürülebilirliğini değerlendirmek Iodide-YFP-GJIC tsömu ile elde edilebilir. Ayrıca, Iodide-YFP spesifik connexin GJIC tahlilleri fonksiyonel boşluk kavşaklarından yoksun hücrelere ilgi connexin ifadesini indükleyerek kurulabilir.Bu connexin belirli bir tür bir kimyasal IC50 değerini belirlemek mümkün kılar. Iodide-YFP-GJIC tsöplisi yüksek iş elde tarama için kullanılabilir, çünkü sağlam, tekrarlanabilir ve ucuzdur. Bu tahliller ilaç keşfi ve toksikolojik değerlendirme için kimyasallar modüle boşluk kavşak bulmak için yardımcı olur.

an-iodide-yellow-fluorescent-protein-gap-junction-intercellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama...

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Biz canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon gerçekleştirin ve bazı yararlı ipuçları sağlamak için nasıl burada açıklamak. Biz bu kağıt nedeniyle fonksiyonel gap junction hücresel bağlantı derecesini değerlendirmek için herkese yardımcı olacağını bekliyoruz. Burada tarif edilen her şey 1,000 Dalton altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar için uyarlanmış, ilke olarak, olabilir.

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Bu sunum, hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyürken, hücreler arası, kavşak iletişiminin incelenmesi için yapışık, kültürlenmiş hücrelerin elektroporasyonunun kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Keşfedin, Iodide-YFP-GJIC yöntemiyle LN215 hücre hatları kullanarak gap junction hücreler arası iletişimi yüksek verimli tarama. Bu güvenilir ve ekonomik analiz, ilaç keşfi ve toksikolojik değerlendirme için gap junction modülatörlerini tespit eder.

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

Daha fazla video keşfet