Name: Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin kök hücre DNA bütünlüğü değerlendirme protokollerini kardiyak hücre tedavisi için. Komet analizi ve immünolabeling yöntemleriyle hücre kalitesini transplantasyon öncesi doğrulayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hibe RO1-HL-99507, tarafından desteklenmiştir HL-114120, HL-131017, HL138023 ve UO1-HL-134764 (için J. Zhang) ve Amerikan Kalp Derneği bilimsel gelişme Grant 17SDG33670677 (için R. Kannappan) tarafından.

1. kuyruklu yıldız tahlil
<ol><li>
Reaktif hazırlık
	<ol>
<li>Düşük erime noktası özel için özel düşük erime 500 mg 100 mL DNA - yer / RNA ücretsiz su. Özel eriyene kadar fırın mikrodalga bir de şişe ısı. İhtiyaç kadar bir 37 ° C su banyosunda şişe yerleştirin. Not: Daha fazla okuma için Azqueta ve ark., özel toplama DNA gevşemek zaman ve birkaç Elektroforez faktörler23etkileri eğitimi görmek.</li>
		<li>SYBR yeşil DNA boya Tris-EDTA (TE) arabelleği 1:10,000 oranında hisse senedi boya çözüm çalışma x 1 edinmek için sulandırmak. Bu boya ışığa duyarlı, çok karanlık bir yerde saklayın.</li>
		<li>Hücre lizis arabellek için 100 mL lizis arabelleği dağıtılması (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris, % 1 Triton X-100) deiyonize su (DI H2O). Daha sonra 10 M NaOH pH 10.0 için ayarlamak için ekleyin. Arabellek 4 ° c serin</li>
		<li>Alkali DNA-gevşemek/Elektroforez çalışan arabellek için 1 L DI H2O. serin arabellek 4 ° C'ye alkali çözeltinin (0.3 M NaOH, 1 mM EDTA) dağıtılması PH emin olun > 13.</li>
		<li>Precoated kuyruklu yıldız slaytlarını birkaç damla % 0.5 özel bir cam slayt üzerinde yerleştirin. Hemen, bir sonraki slayda düz yüzeyini kullanarak, özel kaplama ince bir tabaka oluşturmak için özel yayıldı. Not: Slaytları kullanmadan önce kuru.</li>
		<li>Confluency ulaşıncaya kadar IP'leri hücre kültürü için Bodrum-membran-matris-kaplı (bakınız Tablo reçetesi) kültür IP'leri hücrelerde mTESR1 kültür orta levha kısaca kültür. Not: İnsan-kalp-fibroblast-türetilmiş IP'leri hücreleri bu protokol için kullanılmıştır. IPS hücre türetme ve kültür koşulları yeniden programlama Son Makaleler Gönderen bizim araştırma grubu12,13,21açıklanmıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numune hazırlama
	<ol>
<li>Kültür orta atın ve hücreleri yıkayın. Dekolmanı çözüm kullanarak hücreleri ayırmak ( Tablo malzemelerigörmek). Hücre Pelet fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile yıkama ve PBS hücrelerde 1 x 105 hücre/mL, resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Örnek slayt hazırlama Not: Düşük ışık koşullarında ultraviyole ışık bağlı hücre hasarı önlemek için aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Mix 10 μL hücre süspansiyon ve özel çözüm 90 μL (1:10 oranı) bir tüp. Tüp güçlendirilerek üzerinden özel önlemek için 37 ° C su banyosu yerleştirin.</li>
		<li>Hava kabarcıkları tanıtımı olmadan çözüm mix ve 70 μL/spot precoated kuyruklu yıldız slayda pipet. Pipet Ucu kullanarak, ince bir tabaka oluşturmak için hücre özel karışımı spread. Slayt 4 ° C'de 15 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Bir kap içinde tamamen soğuk lizis arabelleği slayt daldırın. 1s için 4 ° C'de karanlıkta konteyner yerleştirin.</li>
		<li>Lizis arabellek soğuk alkalin çözüm ile değiştirin. Slaytları tamamen sular altında emin olun. Kapsayıcı için 30 dk 4 ° C'de karanlık bir yer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroforez
	<ol>
<li>Slaydı bir yatay Elektroforez tankı yerleştirin. Tank ile soğuk alkalin Elektroforez tampon dolduramazsınız slaytları tamamen sular altında. 1 V/cm için 15-30 dakika gerilim uygulanır. Not: Toplam gerilim elektrotlar x 1 V arasındaki mesafe =</li>
		<li>Bir kap içinde tamamen soğuk DI H2o slayt daldırın 2 dakika sonra DI H2O kaldırın ve taze DI H2O. tekrar bu adımı ekleyin.</li>
		<li>DI H2O soğuk % 70 etanol ile değiştirin. Yavaşça 5 dk. bekleyin slayt kaldırmak değil tilt ve izin kuruması.</li>
		<li>Bir kez kuru, seyreltilmiş DNA boya 100 μL her noktaya ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika bekleyin. FITC filtre bir epifluorescence mikroskop kullanarak, toplam örnek başına 50-100 kuyruklu yıldızlar görüntülerini alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görüntü analizi ve hesaplama sonuçları
	<ol>
<li>Kuyrukluyıldızlar Puanlama için Ulusal Sağlık Enstitüleri'nın (NIH) kullanmak ImageJ kuyruklu yıldız tahlil eklentisi ile (ImageJ buradan indirebilirsiniz: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; download eklenti burada: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). Not: Eklenti çözümlemeyi gerçekleştirmek için tüm ayrıntıları içeren bir PDF yönergesi ile gelir. Ayrıca, ekran kuyruklu yıldız analiz Şekil 2A-Cile gösterilir. Denetim ve doksorubisin (Doxo) temsilcisi kuyruklu yıldız görüntüleri-tedavi IP'leri hücreleri ve kuyrukluyıldızlar miktar Şekil 3A-Cile gösterilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA hasarı yanıt
<ol><li>Örnek ve reaktif hazırlık
	<ol>
<li>Bir IPS-CM hücre kültürü kültür IPS-CM RPMI orta confluency sonuna kadar B-27 (CMM) ile desteklenmiş kültür levha Bodrum-membran-matris-kaplı (bakınız Tablo reçetesi) hücreleri. Not: Cardiomyocytes insan-IPS-hücre kaynaklı bu protokol için kullanılmıştır. Cardiomyocytes içine IP'leri hücre farklılaşması için protokol Son Makaleler Gönderen bizim araştırma grubu12,13,21bulunabilir.</li>
		<li>IPS-CMs odası slaytlarında tohum.<ol>
<li>IPS-CM wells kültür ortamından atmak. Hücreleri üç kez PBS ile yıkayın.</li>
			<li>1 mL % 0.25 tripsin iyi ücret ekleyin ve 5 dk. onay plaka hücre dekolmanı için mikroskop altında 37 ° C'de kuluçkaya. CMM tripsin durdurmak için 1 mL ekleyin.</li>
			<li>15 mL tüp ve santrifüj 4 ° C ve 200 x g5 min için hücre süspansiyon yeri. Orta atın, CMM 1 mL ekleyin ve hücreleri resuspend. Hücreleri saymak ve hücre sayısı 20 x 105 hücreleri CMM 1.6 ml elde etmek için ayarlayın.</li>
			<li>Tohum hücre süspansiyon 8-şey odası kuyu başına 200 µL slayt ( Tablo malzemelerigörmek). Yavaşça hücrelerin kuyunun etrafında yaymak ve 37 ° C'de kuluçkaya slayt dokunun</li>
		</ol>
</li>
		<li>IPS-CM doksorubisin tedavisi için IPS-CM wells kültür ortamından atmak. PBS hücrelerle yıkayın. 1 mikron doksorubisin hücrelerle tedavi ve CMM 4 h için orta Aspire edin ve PBS hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>Engelleme arabellek için 10 mL % 3 BSA ve % 0.05 içeren Sığır serum albumin (BSA) çözeltisi hazırlamak Triton X-100. Engelleme arabellek 10 mL hazırlamak için 1 mL normal eşek serum 9 mL için hazırlanan BSA çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Birincil antikor çözüm için anti-tavşan Fosfo-histon H2A 1 μL ekleyin. X 200 μL engelleme arabelleği (Ser139) antikor.</li>
		<li>İkincil antikor karıştırmak için anti-tavşan ikincil antikor fluorochrome Birleşik, DAPI ve fluorochrome Birleşik phalloidin her 1 μL engelleme arabellek 200 μL için ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunolabeling
	<ol>
<li>Hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve taze hazırlanmış %4 paraformaldehyde (PFA) 200 μL her şey için ekleyin. İçinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dk için hücreleri tamir. PBS hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>PBS kaldırın ve oda sıcaklığında bir oksijen odasında engelleme arabelleği bloğu için 30 dakika başı iyi 200 μL ekleyin. Engelleme arabellek kaldırın ve 200 μL birincil antikor çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında bir karanlık, oksijen odasında 45 dk için kuluçkaya. Sonra wells üç kez PBS ile yıkayın.</li>
		<li>PBS kaldırın ve 200 μL ikincil antikor karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında bir karanlık, oksijen odasında 45 dk için kuluçkaya. Sonra wells üç kez PBS ile yıkayın. DI H2ile O antifade ile montaj önce yıkayın. Bir coverglass yerleştirin ve 4 ° C'de karanlıkta slaytları depolama</li>
		<li>Bir epifluorescence mikroskop kullanarak, Şekil 4Agörüldüğü gibi örnek başına rastgele alanlarının 3-5 fotoğraf çekmek ve görüntü analizi için devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>DDR foci sayma
	<ol>
<li>Karşıdan yükleyip CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
Not: Görüntü işleme Bu çalışmada CellProfiler sürüm 2.1.1 kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan eğitim CellProfiler için başka bir yerde bulunabilir (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & listesi PL7CC87670239B4D10 =). CellProfiler daha yeni bir sürümü kullanılıyorsa, boru hattı küçük uyarlamalar gerektirebilir.</li>
		<li>Boru hattı punctae_gH2AX.cpipeindirin. Dosyayı seçin > içe aktar > boru hattı üzerinden dosya ve punctae_gH2AX.cpipeseçin.</li>
		<li>Sürükle ve bırak γH2A.X foci Analizi (Şekil 5A) için Giriş modülleri/resimlerini bölümündeki dosya listesi penceresine alınan görüntüleri içeren klasör. Sonra Şekil 5A-Liçinde gösterildiği gibi yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Görüntüler için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:<ol>
<li>İstenen görüntü analizi için dosya listesiüzerine sürükleyin. Giriş modülleri' in altında görüntüleri seçin (bkz: Şekil 5A modülü ayarları). Giriş modülleri meta verileri seçin (bkz: Şekil 5B modülü ayarları). NamesAndTypes giriş modülleriseçin (bkz: Şekil 5C modülü ayarları).</li>
			<li>Gruplariçin yokseçin. ColorToGray analiz modülleriseçin (bkz Şekil 5 d modülü ayarlarını için).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analiz modülleri, pürüzsüz seçin (bkz: Şekil 5E modülü ayarları). Not: Bu değer, görüntü çözünürlüğüne bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş gerekir.</li>
		<li>IdentifyPrimaryObjects analiz modülleriseçin (bkz: Şekil 5F modülü ayarları). Not: Bu değerler tüm çekirdeği seçili olduğundan emin olun en iyi duruma getirme. Bu adımdan sonra bilgisayar gecikme.</li>
		<li>Analiz modülleri, pürüzsüz seçin (bkz: Şekil 5G modülü ayarları). Not: Bu değer, görüntü çözünürlüğüne bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş gerekir.</li>
		<li>EnhanceOrSuppressFeatures analiz modülleriseçin (bkz Şekil 5 H için modülü ayarları).</li>
		<li>IdentifyPrimaryObjects analiz modülleriseçin (bkz: Şekil 5I modülü ayarları). Not: Bu değerler punctae seçilir emin olmak için en iyi duruma getirme. Bu adımdan sonra bilgisayarı yeniden gecikme.<ol>
<li>RelateObjects analiz modülleriseçin (bkz: Şekil 5J modülü ayarları). ClassifyObjects analiz modülleriseçin (bkz Şekil 5 K modülü ayarları için). ExportToSpreadsheet analiz modülleriseçin (bkz Şekil 5 L modülü ayarları için).</li>
			<li>Analiz görüntüleri görüntü analizi gerçekleştirmek için alt sol panelde'ı tıklatın. Çözümleme başarılı bitiminde, birkaç görüntü oluşturulur (Şekil 6A-F). Not: Kullanıcılar bu görüntüleri daha sonra başvurmak için kaydetmeniz gerekir.</li>
			<li>Oluşturulan ve kaydedilen bilgisayarda uygun yerde daha fazla çözümleme için nicel veri içeren .csv dosyası unutmayın. MyExpt_Imageolarak adlandırılan elektronik tabloda sütun B ve D beş ve daha fazla punctae için sırasıyla sahip çekirdeklerin numarasına sahip olacaktır. B ve D çekirdekleri toplam sayısını elde etmek için sütun ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.3.3 - 2.3.8 tüm görüntüler (her analiz önce MyExpt_ dosya adını değiştirmek) için adımları yineleyin. Araziler DNA bütünlüğü, değerlendirmek için Şekil 4 ciçinde gösterildiği gibi yapılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

DNA bütünlük hücre bütünlük canlandırıyor. Hücreler hasarlı DNA ile sık sık stres vardır ve sonunda kendi bütünlüğünü kaybetmek. Kök ve nakli amacıyla yayılır kök hücre kaynaklı hücreler hücreleri onların istenen işlevi gerçekleştirmek asıl dürüstlüktür. Hasarlı DNA içeren hücrelerin nakli bir zavallı engraftment hızı ve performansı cep8,20neden olacaktır. Bu nedenle, hücre transplantasyonu önce DNA bütünlük inceleyerek gerekli kalite denetimi iletişim kuralı. Bu...

Deneysel ve klinik kanıt hücre transplantasyonu orta hearts1,2,3,4,5 başarısız sol ventrikül contractile performansı artırabilir gösterir ,6,7,8,9. Son gelişmeler daha da çekici kardiyovasküler rejenerasyon için fırsatlar açtı; Bunlar somatik hücre Nanog teşvik ve bu indüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) farklı kalp soy, önemlisi cardiomyocyte (CM)10, ayırt etmek için programlama faktörlerin zorla ifade dahil 11 , 12 , 13. DNA yapay olarak oluşturulan iPSCs ve IPSC kaynaklı CM (IPS-CM), dahil olmak üzere her hücredeki kalıtsal malzemedir. DNA içinde depolanan genetik yönergeleri belirler büyüme, gelişme ve işlevi hücreler, dokular, organlar ve organizmalar. DNA etkisiz değil; metabolitleri, reaktif oksijen, karbonil ve azot türleri, gibi hücre ve alkilleyici neden DNA tüp bebek ve içinde vivo14,15,16,17zarar verebilir. Önemlisi, DNA hasarı sezgisel olarak önemli bir frekans ile her hücre oluşur. Bu zararlar düzeltilmez ise, bu DNA mutasyon, hücresel yaşlanma, DNA ve hücre bütünlüğü ve muhtemelen, hastalıklar, yaşamı tehdit eden kanser de dahil olmak üzere kaybına yol açacaktır. Bu nedenle, DNA bütünlüğünü koruyarak herhangi bir hücreye, özellikle klinikte çok büyük potansiyele sahip iPSCs, esastır.
Miktar ve izole genomik DNA bütünlüğünü değerlendirmek için pahalı aletler piyasada mevcuttur. Ancak, hücreleri izole olmadan hücrelerdeki DNA bütünlüğünü değerlendirmek için hiçbir basit ve maliyet-etkin yöntem vardır. Ayrıca, Kullanıcı kaynaklı DNA yıkımı sırasında DNA izolasyon Bu yöntemler kullanarak büyük dezavantaj biridir. Tek hücreli jel elektroforez (kuyruklu yıldız tahlil olarak da bilinir)18,19 ve γH2A.X immunolabeling8 araştırma laboratuarları ve DNA hasarı değerlendirmek için temel yaklaşımlar tekniklerdir. Bu iki yöntem pahalı ekipman veya DNA bütünlük8,20,21analiz etmek izole genomik DNA gerektirmez. Beri bu teknikleri içeren bütün hücreleri gerçekleştirilmiş; Kullanıcı kaynaklı DNA/RNA/protein yıkımı numune hazırlama sırasında bu iletişim kuralları etkilemez. Burada, DNA hasarı ve DNA hasarı yanıt kök ve kök hücre kaynaklı hücreler olarak değerlendirmek için kuyruklu yıldız tahlil ve γH2A.X immunolabeling gerçekleştirmek için adım adım protokolleri sağlamak. Ayrıca, bu iki yaklaşım birleştirerek, biz nakli için hücrenin uygunluğu değerlendirmek için kullanılan bir saf değerlendirme öneriyorum.
Kuyruklu yıldız tahlil veya tek hücre Elektroforez jel, hücrelerdeki DNA sonları ölçer. Düşük erime özel katıştırılmış hücreleri supercoiled DNA içeren formu nucleoids lysed. Bozulmamış DNA, onların büyük boyutu ve onların konjugasyon matris protein nedeniyle kısıtlı bir geçiş olacak ise Elektroforez özel gözenekler parçalanmış DNA ve kırık DNA iplikçikleri küçük parçalar geçirin. Bir floresan mikroskop altında lekeli DNA modeli taklit eden bir kuyruklu yıldız. Kuyruklu yıldız baş bozulmamış DNA içerir ve kuyruk parçaları oluşur ve kırık DNA dizilerini. DNA hasarı kısmını hasarlı DNA (kuyruklu yıldız kuyruk) Floresan yoğunluğu tarafından bozulmamış DNA (kuyruklu yıldız başı) yoğunluk göreli olarak ölçülebilir. Parametre kuyruk an Şekil 1' de gösterildiği gibi hesaplanabilir.
DNA hasarı fosforilasyon histon H2A nın neden olmaktadır. X (γH2A.X) Ser139 ATM, ATR ve DNA-PK kinazlar tarafından. Fosforilasyon ve H2A alımı. DNA kırılmalara X DNA hasarı yanıt (DDR) denir ve DNA hasar sonra hızla olur. Bu işlem, denetim noktası-aracılı hücre döngüsü tutuklama ve DNA onarım işlemleri başlatılır. DNA onarım başarıyla tamamlayan γH2A.X dephosphorylated ve fosfatazlar tarafından inaktive olur. Uzun süreli ve DNA ' γH2A.X foci birikimi için birden fazla DNA kırılmalara yol. Bu hücrenin DNA hasarı ve DNA bütünlüğü kaybı onarmak yetersizlik gösterir. DNA'daki bu γH2A.X foci belirlenebilir ve DDR foci sayısı 2 bölümünde iletişim kuralını kullanarak sayılabilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8 oyuklu odacıklı slayt</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Hücre ayırma çözümü</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson Immuno Araştırma Laboratuvarları</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson Immuno Araştırma Laboratuvarları</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Takviyesi, Serum İçermez,</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel büyüme faktörü azaltılmış</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>PhalloidinA488</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-Histon H2A. X (Ser139) Antikor</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi</td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; Yeşil I nükleik asit jel lekesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Düşük erime Noktalı Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

kardiyak hücre tedavisi için kök hücre dna bütünlük değerlendirilmesi

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Kök ve kök hücre kaynaklı hücreler çeşitli dejeneratif hastalıklar için yenileyici bir terapi olarak büyük potansiyele sahip. DNA'sı, kök hücre de dahil olmak üzere tüm hücrelerdeki genetik veri depo ve bütünlüğünü rejeneratif kabiliyetini temelini oluşturur. Kök hücre nakli için gerekli numaraları elde laboratuvarlarında hızlı yayılma tabi. Hızlandırılmış hücre büyümesini reaktif oksijen, karbonil ve alkilleyici gibi birikmiş metabolitleri tarafından DNA bütünlük kaybına yol açar. Bu hücrelerin nakli zavallı engraftment ve rejenerasyon bozulan organ neden olur. Ayrıca, DNA zarar görmüş hücreleri yol açan mutasyonlar, DNA istikrarsızlık, hücresel yaşlanma dikim ve muhtemelen, hayatı tehdit edici hastalıkları kanser gibi. Bu nedenle, hücrenin uygunluğu nakli için değerlendirmek bir kalite kontrol yöntemi acilen ihtiyaç vardır. Burada, kök hücre hücre transplantasyonu önce DNA bütünlüğünü değerlendirilmesi için adım adım iletişim kuralları sağlar.

İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler kültürlü ve DNA bütünlüğü bir ölçüsü olarak kullanılan, DNA hasarı ve kuyruk an, kuyruklu yıldız tahlil tarafından analiz edildi. IPS hücreleri düşük erime noktası özel içinde gömülü ve bir cam slayt üzerinde yerleştirilir. Hücreleri sonra supercoiled DNA elde etmek için alkali bir çözüm tarafından takip lizis arabellek ile tedavi edildi. Nucleoids electrophoresed ve kuyruklu yıldızlar DNA boya (Şekil 1A-B</s...

Burada, bir analiz DNA bütünlük içinde kök hücre hücre transplantasyonu önce değerlendirme için deneysel bir kurulumuna ilişkin ayrıntılı bir açıklama sağlamak.

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Kardiyomiyopati gibi yenidoğan hastalıklarında, indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı hücreler kullanılarak rejeneratif tedavi nin büyük bir potansiyeli vardır. Ancak, in vitro hızlandırılmış hücre büyümesi reaktif oksijen türleri gibi birikmiş metabolitleri tarafından DNA hasarına yol açar. Bu DNA hasarlı hücrelerin nakli organın kötü engraftment ve rejenerasyon neden olur.Transplantasyon dan önce hücrelerin kalitesi değerlendirilmelidir. Burada kök hücrelerdeki DNA hasarını değerlendirmek için adım adım iki protokol salıyoruz. Prosedürleri gösteren Jessica Miller, bir araştırmacı, Nikhil Mardhekar, bir araştırmacı ve Vasanthi Rajasekaran, bir laboratuvar teknisyeni olacaktır.Başlamak için, DNA-RNA serbest su 100 mililitre düşük eriyen agarose 500 miligram yerleştirin. Agarose eriyene kadar bir mikrodalga fırında şişe ısıtın. Daha sonra, şişeyi 37 derecelik bir su banyosuna, ihtiyacı olana kadar yerleştirin.Önceden kaplanmış kuyruklu yıldız slaytları hazırlamak için, cam bir slayt üzerine % 0.5 agarose birkaç damla yerleştirin. Hemen bir coverslip kullanarak agarose kaplama ince bir tabaka oluşturmak için agarose yayıldı. Ultraviyole ışık kaynaklı hücre hasarını önlemek için düşük ışık koşullarında çalışarak, 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 90 mikrolitre agarose çözeltisini bir tüpte karıştırın.Agarose'un katılaşmasını önlemek için tüpü 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Önceden kaplanmış kuyruklu yıldız kaydırağına hava kabarcıkları ve nokta başına 70 mikrolitre pipet vermeden çözeltiyi karıştırın. Bir pipet ucu kullanarak, ince bir tabaka oluşturmak için hücre agarose karışımı yayıldı.15 dakika boyunca dört derece santigrat slayt yerleştirin. Bir kapta, tamamen soğuk lysis tampon slayt batırın. Bir saat için dört derece santigrat de karanlıkta konteyner yerleştirin.Lysis tamponu soğuk alkali çözeltisi ile değiştirin. Slaytların tamamen batırılmış olduğundan emin olun. Konteyneri karanlıkta dört derece daha 30 dakika daha bıraktıktan sonra, kaydırağı yatay bir elektroforez tankına yerleştirin.Kaydıralar tamamen batırılıncaya kadar tankı soğuk alkali elektroforez tamponuyla doldurun. Voltajı 15-30 dakika santimetre cinsinden uygulayın. Bir kapta, tamamen soğuk deiyonize su slayt batırın.İki dakika sonra, deiyonize su çıkarın ve taze deiyonize su ekleyin ve sonra ikinci kez bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, soğuk% 70 etanol ile deiyonize su değiştirin. Beş dakika sonra, yavaşça yatırmadan slayt çıkarın ve kuru hava sağlar.Kuruduktan sonra, her noktaya seyreltilmiş DNA boyası 100 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekleyin. Epifloresan mikroskobunda FITC filtresi kullanarak, numune başına toplam 50 ila 100 kuyruklu yıldızın görüntülerini alın. Kültür iPS kaynaklı kardiyomiyositler metin protokolünde açıklandığı gibi.Oda slaytlarında iPS kaynaklı kardiyomiyositleri görmek için, önce kültür ortamını kuyulardan atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Kuyu başına 0.25% Trypsin bir mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. Hücre kopması için mikroskop altında plakayı kontrol edin.Sonra Trypsin durdurmak için CMM bir mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüjü dört santigrat derecede beş dakika ve 200 kez yerleştirin. Orta atın, CMM bir mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya.Hücreleri sayın ve cmm 1.6 mililitre iki milyon hücre elde etmek için hücre sayımları ayarlayın. Şimdi tohum sekiz kuyulu oda slayt kuyu başına hücre süspansiyon 200 mikrolitre. Hücreleri kuyunun etrafına yaymak için slayta hafifçe dokunun.Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın. iPS kaynaklı kardiyomiyosit doksorubisin tedavisi için, iPS kaynaklı kardiyomiyosit kuyularından kültür ortamını atın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri tek mikromolar doksorubisin ile 37 santigrat derecede dört saat tedavi edin.Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile yıkayın. İmmünoetiketleme yapmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve her kuyuya 200 mikrolitre taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca hücreleri düzeltin.PBS ile hücreleri yıkadıktan sonra, kuyu başına engelleme tampon 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 30 dakika boyunca blok. Engelleme tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında koyu nemli bir odada 45 dakika kuluçkaya yattıktan sonra kuyuları PBS ile üç kez yıkayın.PBS çıkarın ve ikincil antikor karışımı 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında koyu nemli bir odada 45 dakika kuluçka. Daha sonra pbs ile kuyuları üç kez yıkayın.Antifade ile slaytlar montaj önce deiyonize su ile yıkayın. Bir kapak camı yerleştirin ve slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Konfokal mikroskop kullanarak, örnek başına rastgele alanların üç ila beş görüntüsünü alın ve görüntü analizine devam edin.DNA hasar yanıt foci saymak için, indirin ve CellProfiler yükleyin. Dosyayı seçin, içe aktarın, dosyadan ardışık kaynak aktarın ve puncti gamma-H2AX adlı ardışık işlem dosyasını seçin. Gama-H2AX foci'nin edinilmiş görüntülerini içeren klasörü, analiz için giriş modülleri görüntüler bölümündeki dosya listesi penceresine sürükleyin ve bırakın.Ardından metin protokolünde gösterildiği gibi yönergeleri izleyin. Görüntülerin parametrelerini ayarlamak için, analiz için istenen görüntüyü dosya listesine sürükleyin. Giriş modülleri altında görüntüleri seçin.Ayrıca giriş modüllerinde, meta verileri seçin ve ardından adları ve türleri seçin. Gruplar için hayır'ı seçin. Analiz modüllerinde çalışırken, griden griye rengi seçin.Ardından düzgün'ün, birincil nesneleri tanımlay'ı seçin ve yine düzgün'ün seçilmesini seçin. Sonraki özelliği geliştir veya bastır ve ardından birincil nesneleri tanımlay'ı seçin. Çözümleme modüllerinde çalışmaya devam ediyor, ilgili nesneleri seçin, ardından nesneleri sınıflandırın ve son olarak elektronik tabloya dışa aktarmayı seçin.Görüntü analizi gerçekleştirmek için sol alt paneldeki görüntüleri analiz et'i tıklatın. Analizin başarıyla tamamlanmasıyla, çeşitli görüntüler oluşturulur. Bilgisayarda oluşturulan ve kaydedilmiş CSV dosyasına dikkat edin.Bu dosya daha fazla analiz için nicel verileri içerir. Deneme resmim olarak adlandırılan elektronik tabloda, B sütununda beş puncti'ye kadar olan çekirdek sayısı, D sütunu ise beşten fazla puncti olan çekirdek sayısına sahip olacaktır. Toplam çekirdek sayısını elde etmek için B ve D sütunlarını ekleyin.Tüm görüntüler için bu adımları yineleyin, her analizden önce deneme dosya adımı değiştirin. Burada dokso ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen iPS hücrelerinden kuyruklu yıldızların temsili mikrografları gösterilmiştir. DNA hasarı ve kuyruk momentinin bir kısmı olarak ifade edilen iPS hücrelerinde bazal miktarda DNA hasarı bulundu.Ancak, dokso tedavisi beklendiği gibi iPS hücrelerinde DNA hasarı arttı, kuyruklu yıldız testi pluripotent kök hücrelerde DNA bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir gösteren. Gamma-H2AX immünetiketlemenin temsili mikrografları burada, daha düşük büyütmede ve daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Kontrol iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde, hücrelerin %90'ından fazlasının çekirdekbaşına beş DDR foci'den daha az olduğu görülür.Ve hücrelerin %10'undan azında çekirdek başına altıdan fazla DDR foci vardı. Altı ay boyunca kültüre sahip iPS kaynaklı kardiyomiyositler için, hücrelerin %90'ından azında çekirdek başına beş DDR foci ve toplam da %13'ten fazla çekirdek başına altı DDR foci vardı. Dokso-tedavi edilen iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde ise, hücrelerin %80'inden azında çekirdek başına beş DDR foci vardı.Ve hücrelerin yaklaşık %24'ünde çekirdek başına altıdan fazla DDR foci vardı. Bu veriler, uzun süreli iPS kaynaklı kardiyomiyosit hücre kültürü ve dokso tedavisinin önemli DNA hasarına yol açarak hücre nakli için uygun olmadığını göstermektedir. Bu elektroforez etkileyebilir gibi hücre süspansiyon karıştırırken değişkenleri önlemek için çok önemlidir.Bu prosedürü takiben, kuyruklu yıldız tahlilleri ve çeşitli hücreler ile immünetiketleme prosedürleri gerçekleştirebilirsiniz. Bu teknikler, hücre nakli çalışmalarında kullanılmadan önce çeşitli türdeki hücrelerin DNA hasarı açısından değerlendirilmesine olanak sağlayacaktır.

assessing-stem-cell-dna-integrity-for-cardiac-cell-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Kardiyomiyosit döngüsünün ölçülmesi zordur. Burada açıklanan protokol, neo-kardiyomiyosit çekirdek oluşumu ve çekirdek ploidisinin doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayarak bu zorluğa önemli bir katkı sağlar.

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Bu protokolde, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kardiyomiyosit farklılaşma ve arıtma için nasıl kullanılacağı ve daha fazla, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü ile transplantasyon verimliliğini nasıl iyileştirebileceğini gösteriyoruz. bir fare miyokard infarktüsü modelinde ön tedavi.

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Öğrenin kök hücre DNA bütünlüğü değerlendirme protokollerini kardiyak hücre tedavisi için. Komet analizi ve immünolabeling yöntemleriyle hücre kalitesini transplantasyon öncesi doğrulayın.

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet