Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme
28 Aralık 2018
Bu iletişim kuralı, biz Astyanax mexicanus yetişkin doğurmak, larvalar yükseltmek nasıl gösterir ve bütün Dağı immünhistokimya yüzey fenotipleri karşılaştırmak ve morphotypes mağara sonrası larva balık gerçekleştirin.
Burada, Meksika Tetra Astyanax Mexicanus'un nasıl yetiştirilebileceğimizi, larvaları nasıl yetiştirebileceğimizi ve nehir ve mağaraya uyarlanmış balıkların fenomenilerini karşılaştırmak için post larva balıklarında tam bir immünohistokimya yınasıl gerçekleştirebileceğimizi gösteriyoruz. Biz rotifers bir besin açısından zengin diyet aynı yoğunlukta balık yükseltmek. Bu teknik tutarlı büyüme sağlar ve maliyet, biyogüvenlik ve su kalitesi nde avantajlar sağlar.
Başlamak için, beş galon tankın altına plastik bir örgü yerleştirin. Sonra balık hazır su ile tank doldurun. Tankın yan tarafına bir su ısıtıcısı yapıştırın.
Tanka bir yaşından büyük olan bir dişi ve iki erkek Astyanax Mexicanus balığı ekleyin. Su ısıtıcısının sıcaklığını 24 dereceye ayarlayın. 24 saat sonra, sıcaklığı bir derece santigrat artırın.
Yumurta ları kontrol etmek için her gün tankın dibine bir el feneri parlayın. Yumurtalar üreme tankında tanımlandıktan sonra, yetişkin balıkları ve plastik kafesi çıkarın. 10 cm su derinliğini azaltmak için bir beher kullanın.
Döllenme süresini tahmin etmek için, bir petri kabına birkaç yumurta yerleştirmek ve evrelerini belirlemek için stereo mikroskopla görüntülemek için bir transfer pipetkullanın. Opak yumurta veya dışkı çıkarın. Sonra balık hazır su ile tank doldurun ve suya metilen maviyedi damla ekleyin.
Bundan sonra, tanka bir ısıtıcı ve akvaryum kabarcık ekleyin. Isıtıcıyı 24 santigrat dereceye ayarlayın ve hava akımı regülatöründen hafif bir kabarcık akışı oluşturmak için ayarlayın. Daha sonra su sıcaklığını korumak için tankı kapatın.
Sekiz litre balık hazır suya 20 gram tuz ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Sonra her kreş konteyner için hazırlanan su bir litre ekleyin. Daha sonra her bir fidanlık konteyner için yumurtadan larva 20 taşımak için bir transfer pipet kullanın.
Tüm larvaların çıkarıldığından emin olmak için büyük tanktaki suyu boşaltın. Balık gıda hazırlamak için, hasat rotifers bir litre yosun karışımı üç ml ekleyin. Beş gün sonra döllenme her kreş konteyner için balık gıda üç ml ekleyin.
Rotifers merkezi yakınında görünür sürece konteyner köşesinde yoğun gruplar halinde görünür olmalıdır. Her gün rotifers için konteyner kontrol edin ve konsantrasyon tükenmiş ise daha fazla gıda ekleyin. Ölü larvaları çıkarın.
İlk olarak, gıda içeriğinin gastrointestinal sistem temizlemek için, bir naylon örgü süzgeç ile istenilen yaş balık ile kreş konteyner dökün. Temiz balık hazır su ile bir kap içine süzgeç yerleştirin ve 24 saat boyunca yiyecek tutun. Balık ötenazi sonra, kurumsal kurallara göre, konik bir tüp balık aktarmak için bir transfer pipet kullanın.
Ötenazi çözeltisini fiksatif ile değiştirin. Ve tüpü bir gecede 4 derece santigrat derecede sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra fiksatif içıkarın ve PBST ile değiştirin.
Tüpü 15 dakika daha sallayarak kuluçkaya yatırın. Yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, bir vida üst kapağı ile dört ml cam şişe balık taşımak için bir transfer pipet kullanın.
PBST'yi şişeden çıkarın ve üç ml bloklama çözeltisi ekleyin. Şişeyi oda sıcaklığında bir saat boyunca sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, engelleme çözeltisini çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın ve bloklama çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikor ile değiştirin.
Tüplü olarak gece boyunca şişeyi oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi, PBST ile üç kez balık yıkayın. PBST'yi bloklama çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorile değiştirin.
Ve şişeyi gece boyunca oda sıcaklığında ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Son olarak, PBST ile 15 dakika boyunca üç kez balık yıkayın. Bu protokol kullanılarak, yüzey balıkları Tinaja, Molino ve Pachon mağara balıkları statik üreme tanklarında yetiştirildi.
Yüzey ve Pachon, döllenmiş embriyolar ile, her zaman yumurtadan larvaüretti. Molino ve Tinaja bazı zaman başarısız oldu. Genel olarak, yüzey balıkları yumurtlama başına en fazla larva üretti ve onu sırasıyla Pachon, Tinaja ve Molino izledi.
Tüm montaj immünboyama tekniği başarıyla 12.5 gün sonrası döllenme aşamaları nöronlar ve pankreas hücreleri etiketlemek için kullanılmıştır. Larvaları yükseltirken ve hayatta kalan balıkların sayısını kaydederken ölü balıkları çıkarmak önemlidir. Birçok balık ölürse bakteriyel veya mantar kontaminasyonu nedeniyle olabilir.
Tanklar kullanılmadan önce %70 etanol ile sterilize edilmelidir. Tarif ettiğimiz immünboyama tekniği malzeme tablosunda listelenen antikorlar için başarıyla kullanılmıştır. Immunostaining sonra, balık bütün monte edilebilir veya ilgi herhangi bir doku görüntülemek için kesitli.
Birlikte, Üreme, kuluçka ve immünboyama prosedürü laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir bir şekilde gen aktivitesi NC2 değerlendirmek için sağlam bir yöntem sağlar.
Genel Bakış
Bu protokol, yetişkin Astyanax mexicanus'ların üretilmesini, larvaların büyütülmesini ve post-larval balıklarda bütün monte immünohistokimya uygulanmasını özetlemektedir. Çalışma, yüzey ve mağara morfotiplerinin fenotiplerini karşılaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişim Biyolojisi
- Karşılaştırmalı Morfoloji
Arka Plan
- Astyanax mexicanus, belirgin yüzey ve mağara morfotipleri sergiler.
- Fenotipik farklılıkların anlaşılması, adaptasyon mekanizmaları hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Bütün bağlam immünohistokimya, hücresel yapıları görselleştirmek için değerli bir tekniktir.
- Güvenilir deneysel sonuçlar için tutarlı büyüme koşulları esastır.
Çalışmanın Amacı
- Astyanax mexicanus için bir üretim protokolü oluşturmak.
- Nehir ve mağara adaptasyonlu balıkların fenotiplerini karşılaştırmak.
- Hücresel analiz için immünohistokimyayı kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kontrollü bir ortamda yetişkinlerin üretilmesi.
- Larvaların rotiferlerden oluşan besin açısından zengin bir diyetle yetiştirilmesi.
- Post-larval balıklar üzerinde whole-mount immünohistokimya uygulanması.
- Hayatta kalma oranlarının ve fenotipik sonuçların belgelenmesi.
Ana Sonuçlar
- Yüzey ve mağara morfotiplerinin başarılı bir şekilde çiftleştirilmesi gerçekleştirildi.
- Yüzey balıkları, mağara balıklarına kıyasla yumurta başına daha fazla larva üretti.
- İmmün boyama, nöronları ve pankreas hücrelerini etkili bir şekilde işaretledi.
- Sağlık durumunu ve kontaminasyon risklerini değerlendirmek için hayatta kalma oranları izlendi.
Sonuçlar
- Kurulu protokol, Astyanax mexicanus üretimi ve analizi için güvenilir bir yöntem sunar.
- Karşılaştırmalı çalışmalar, evrimsel adaptasyonların anlaşılmasını geliştirebilir.
- İmmünohistokimya, gelişimsel biyolojiyi incelemek için güçlü bir araçtır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Astyanax mexicanus için standardize edilmiş post-larval kültür ve immün boyama protokollerinin oluşturulması, yüzey ve mağara morfotiplerinin karşılaştırmalı fenotipik analizini mümkün kılar. Bu yaklaşım, adaptif özellikleri ve gelişimsel gen fonksiyonlarını incelemek için hastalıkla ilişkili bir sistem sunarak hedef doğrulamayı destekler. Yöntem, popülasyonlar arası karşılaştırma yoluyla korunmuş yolakların mekanistik risk analizine olanak tanıyarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yüzey ve mağara popülasyonları arasındaki post-larval evrelerdeki fenotipik farklılıkları karşılaştırarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef doğrulama deneylerinde biyolojik değişkenliği azaltmak için yoğunlukları eşleştirilmiş larval kohortlar oluşturmaya yönelik standartlaştırılmış bir akuakültür sistemi sağlar.
- Bilimsel Değer: Transgenik raporlar olmadan nöronlarda ve pankreatik hücrelerdeki gen ekspresyon modellerini değerlendirmek için tüm vücut immün boyama yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Gelişimsel yolakları etkileyen bileşiklerin yüksek içerikli taraması için uygun, tekrarlanabilir post-larval fenotipler üretir.
- Operasyonel Değer: Statik sistemlerde rotifer diyetleri ile larval yetiştirmeyi standartlaştırarak tutarlı büyümeyi sağlar ve analiz sonuçlarındaki karıştırıcı değişkenleri minimize eder.
- Bilimsel Değer: İmmün boyama yoluyla kantitatif fenotipik ölçümlere olanak tanıyarak analiz standardizasyonunu ve laboratuvarlar arası veri karşılaştırılabilirliğini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Mağara balığı ortamlarındaki post-larval fenotipik farklılıkları yetişkin sağkalım özellikleri ile ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Uzun süreli fenotipik çalışmalar için yetişkin yetiştirmeye ölçeklendirilebilen kreş protokolleri oluşturarak preklinik model geliştirmeyi destekler.
- Bilimsel Değer: Adaptasyon ve hastalık direncinde rol oynayan korunmuş gelişimsel yolların karşılaştırılmasına olanak tanıyarak mekanistik risk azaltmayı teşvik eder.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, öncü bileşik tanımlama çalışmalarından önce fenotipik tarama ve hedef doğrulama için standartlaştırılmış bir platform sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yüzey ve mağara kaynaklı post-larval balıklar arasındaki immünboyama modellerini karşılaştırarak gelişimsel genlerin hipotez testlerini gerçekleştirmeyi sağlar.
- Tarama: Tutarlı büyüme ve sağkalım metriklerine sahip, assay-hazır larval popülasyonlar sunarakle tekrarlanabilir bileşik tarama kampanyalarını destekler.
- Analitikler: Ekiplerin farklı deneysel koşullar genelinde protein ekspresyon seviyelerini karşılaştırmasına olanak tanıyan kantitatif immünohistokimyasal okumalar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Erken fenotipik taramaları yetişkin adaptif özelliklerle ilişkilendirerek preklinik geliştirmedeki riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Omurgalı modellerde gelişimsel gen fonksiyonunu inceleyen birden fazla çalışma genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir kreş ve immünboyama platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Adaptif varyantların doğrudan fenotipik karşılaştırması yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef seçimindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış larva yetiştirme ve immün boyama protokolleri aracılığıyla laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Hastalıkla ilgili modellerdeki korunmuş fenotipik yanıtlara dayanarak hedeflerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak, devam/durdur karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Genetik olarak işlenebilir karşılaştırmalı bir sistemde hedef modülasyon etkileri üzerine ampirik veriler sağlayarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Larvaların başarılı şekilde yetiştirilmesi için zebrafish bakımı ve canlı yem kültürü (rotiferler) konusunda uzmanlık gereklidir.
- Nöronal ve pankreatik hücrelerin tespiti için floresan mikroskobuna ve standardize edilmiş immünboyama reaktiflerine erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir boyama sonuçları elde etmek için fiksasyon, bloklama ve antikor inkübasyon prosedürlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokolün diğer balık türlerine veya döllenmeden sonraki 12,5 gün dışındaki gelişim aşamalarına genişletilmesi durumunda adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Belirli mağara popülasyonlarında (örneğin Molino, Tinaja) değişken yumurtlama başarısı gibi pratik kısıtlamaları içerir; bu durum, ayarlanmış üretme oranları veya artırılmış replika sayıları gerektirebilir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Breeding
1:20
Hatching Fertilized Eggs
2:16
Transfer of Hatched Larvae to Nursery Containers
2:45
Preparation of Rotifer-based Fish Food and Feeding of Post-Larval Fish
3:19
Whole-Mount Immunohistochemistry of Post-Larval Fish
5:11
Results: Surface Fish Produce Greatest Number of Larvae per Spawn
5:56
Conclusion
