Name: Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Keşfedin, Neisseria gonorrhoeae toplumlarında antibiyotik duyarlılığını ATP ölçümü ve canlı/ölü boyama yöntemleriyle nicel olarak değerlendirme tekniğini. Bu yöntem, klinik koşullarda bakteri yaşayabilirliğini doğru şekilde analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü teşkilat ve WS AI123340 için bir hibe tarafından desteklenmiştir. L.-CW, JW, A.C., ve E.N. bölümü/Maryland Üniversitesi tarafından finanse edilen "birinci sınıf yenilik & araştırma deneyimi" programına katılmak içinde desteklenen. Fon yayımlamak için çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. UMD CBMG Imaging Core tüm mikroskobu deneyler için anıyoruz.

1. genel bakım GC suşları
<ol><li>N. gonorrhoeae suşları çizgi GCK agar % 1 Kellogg18 (Tablo 1, tablo 2) derin dondurucu stokları takviyeleri ve 37 ° C % 5 CO2 16-18 h. kullanım MS11 faz-değişken Opa (MS11Opa +), hiçbir Opa (MS11ΔOpa), ifade için kuluçkaya veya kesilmiş LOS (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Dikkatlice pili negatif (koloni karanlık kenarı olmayan) veya pozitif (koloni karanlık kenarı ile) kolonilerin koloni morfolojisi19 bir diseksiyon ışık mikroskobu ve yeni GCK plaka üzerine çizgi kullanarak temel her zorlanma seç.</li>
	<li>16-18 h kullanmadan önce için % 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>2. canlılığı miktar GC toplamalardan
<ol><li>Steril bir aplikatör kullanarak GC toplamak. Çubukla GC plaka ve yeniden askıya GC önceden ısıtılmış suyu (GCP, Tablo 3) içinde % 1 ile % 4.2 NaHCO3 Kellogg çözümleri18takıma. Spectrophotometry dalga boyu 650 kullanın nm (1 OD650 = ~ 1 x 109 CFU/mL) askıya alınan bakteri konsantrasyonu belirlemek için.</li>
	<li>GC konsantrasyon ~ 1 10 x ayarlamak8 CFU/mL.</li>
	<li>99 µL ayarlanan GC süspansiyon, bir 96-şey plaka kuyu ekleyin.</li>
	<li>Bakteri izin vermek için % 5 CO2 37 ° c 6 h plaka kuluçkaya toplamak için.</li>
	<li>Seri seyreltilmiş ceftriaxone 1 µL ekleyin (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0,4, 0.2 µg/mL) her kuyuya. Denetimleri hizmet etmek için tedavi edilmezse bazı kuyular bırakın.</li>
	<li>%5 CO237 ° C'de 24 h plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Süspansiyon 3 kez her şey 5 144 W, s ve 20 kHz için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Piyasada bulunan ATP kullanımı kızdırma reaktif 100 µL her kuyuya eklemek, pipet yukarı-aşağı için 3 kere ve % 5 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli 96-şey siyah Mikroplaka yeni bir kuyuya her kuyudan karışımı 150 µL aktarmak ve kabarcıklar tanıtan kaçının.</li>
	<li>560 her kuyuda absorbans ölçmek plaka okuyucu kullanarak nm.</li>
	<li>Seri ceftriaxone tedaviden sonra okunurken işlenmemiş kuyulardan elde edilen okuma oranı tarafından sağkalım oranı hesaplar.</li>
</ol>3. floresans mikroskobik analizlerin yapıldığı canlı/ölü GC toplamları
<ol><li>Steril bir aplikatör kullanarak GC toplamak. Pamuklu çubuk GC plaka ve yeniden askıya GC önceden ısıtılmış GCP medya artı % 1 Kellogg tamamlar.</li>
	<li>Tarafından spectrophotometry bir dalga boyu 650 adlı bakteri sayısını belirlemek nm ve GC konsantrasyon ~ 1 10 x ayarlamak7 CFU/mL.</li>
	<li>8-şey coverslip-alt odasında 198 µL GC süspansiyon ekleyin.</li>
	<li>Odası 6 h 37 ° c % 5 CO2 toplama oluşumu izin vermek için kuluçkaya.</li>
	<li>Her toplama koşul içinde her kuyuya ceftriaxone (100 µg/mL ya da çeşitli dilutions) 2 µL ekleyin. 37 ° C % 5 CO2ile istediğiniz saatte için kuluçkaya.</li>
	<li>Her kuyuya 0.6 µL canlı/ölü boyama çözüm karışımı ekleyin ve %5 CO2ile 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Z-serisi görüntüleri (eşdeğer bir mikroskop kullanılabilir) confocal mikroskop kullanarak elde.</li>
	<li>GC toplamları ve canlı ölü her toplam olarak boyama floresan yoğunluğu oranı (FIR) boyutunu ölçümü için ImageJ yazılım kullanarak görüntüleri analiz.</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Bakteriyel toplamları boyutunu tahmin.<ol>
<li>ImageJ açın ve ImageJ menü çubuğuna bir raw resim dosyasını sürükleyerek bir resim açın.</li>
		<li>Serbest çizgiler ImageJ menü çubuğunu tıklatın ve görüntüdeki her toplama alanı daire.</li>
		<li>Tıklayın analiz | Ölçü ImageJ menü çubuğunda.</li>
		<li>Alan sütununda yeni bir pencerede numarası edinmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplamalardan canlı ölü oranı miktar<ol>
<li>ImageJ açın ve ImageJ menü çubuğuna bir raw resim dosyasını sürükleyerek bir resim açın.</li>
		<li>Tıklayın analiz | Ayarla ölçümleri ImageJ menü çubuğunda.</li>
		<li>Açılan pencerede entegre yoğunluğu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.</li>
		<li>Resmi tıklayın | Renk | Kanalları aracı menü çubuğu ve renkseç.</li>
		<li>Kanal 1 floresan için boyama canlı bakteri olarak kontrol edin.</li>
		<li>ImageJ menü çubuğunda Serbest çizgiler ' i tıklatın ve her toplama alanı daire.</li>
		<li>Tıklayın analiz | Ölçü ImageJ menü çubuğunda.</li>
		<li>IntDen sütununun altında numarası edinmek.</li>
		<li>Kanal 2 ölü bakteriyel boyama için floresans olarak kontrol edin. Adımları 4.2.6-4.2.8 tekrarlayın.</li>
		<li>Canlı ölü oranı numarasına adım 4.2.8 numarasına adım 4.2.9 bölerek elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstatistiksel analiz<ol>
<li>GraphPad prizma açın ve ImageJ istenen kolona elde numaralarını girin.</li>
		<li>Çözümle ' yi tıklatın ve sütun analizlerialtında t testleri seçin.</li>
		<li>Karşılaştırma için istenen sütununu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.</li>
		<li>Analiz penceresi altındaki P değeri elde edilir.</li>
		<li>XY analizleri altında Doğrusal regresyon 4.3.3 adımından seçin</li>
		<li>R-kare ve analiz pencerenin altındaki P-değeri elde edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+of+urogenital%2C+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li>
<li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+gonorrhea%3A+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li>
<li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonorrhea+in+Indonesia%3A+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta%2C+Yogyakarta%2C+and+Denpasar%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sexually+Transmitted+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li>
<li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis%2C+Neisseria+gonorrhoeae%2C+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation%2C+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).</li>
<li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li>
<li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+gonorrhea%3A+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li>
<li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li>
<li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li>
<li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).</li>
<li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Microbiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li>
<li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li>
<li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).</li>
<li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li>
<li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion%3A+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li>
<li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li>
<li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li>
<li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li>
<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bakteri biyofilmler insan vücudu enfeksiyon sırasında oluşabilir. Geleneksel mikrofon test bir biyofilm bakteri ortadan kaldırmak için gerekli toplama yansıtmaz. Bir biyofilm antimicrobials etkileri test etmek için yanı sıra biyofilm biyokütle esaslı CFUs kaplama yöntemleri biyofilm yapı etkisi nedeniyle hatalı olabilir. Örneğin, kaplama yöntem biricik inşaat eğer biyofilm bozulur. Bu nedenle, elde edilen CFU canlı bakteri gerçek sayısından daha düşük olabilir. Görüntülenmesi ölü ve canlı bakteri içinde biyofilm bakteri ...

Bel soğukluğu ortak bir cinsel enfeksiyon (STI)1iletilen olduğunu. Neisseria gonorrhoeae (GC), gram-negatif bir diplococcal bakteri bu hastalık hastalığının olduğunu. Genital enfeksiyonu belirtileri ağrı idrara çıkma, genelleştirilmiş genital ağrı ve üretral akıntı sırasında neden olabilir. Enfeksiyon genellikle asemptomatik2,3,4,5ve bu genişletilmiş kolonizasyon için sağlar. Bunlar tedavi edilmezse hastalık iletim organizmanın kolaylaştırmak için potansiyel var ve bu Pelvik inflamatuar hastalığa (PID) gibi komplikasyonlara yol açabilir ve dissemine Gonokokal Enfeksiyon (DGI)6gibi büyük sağlık kaygı vardır. Antibiyotik dirençli bel soğukluğu önemli halk sağlığı kriz ve artan bir sosyo-ekonomik yük7var. Sefalosporinler düşük duyarlılık tedavi rejimi değişikliğinden tek bir antibiyotik azitromisin veya doksisiklin ceftriaxone8ile birleştiren çift terapisi, sonuçlandı. Ceftriaxone ve Azitromisin9,10, asemptomatik enfeksiyondan ile birlikte artan başarısızlık bel soğukluğu tedavisi hataları anlama gereğini vurgulamaktadır.
Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri, dahil olmak üzere minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi bir antibiyotik direnç tanımlamak için standart tıbbi test olarak kullanılmıştır. Yine de, mikrofon test bakteriyel antibiyotik direnci içinde vivo yansıtır Eğer belli değildir. Bakterilerin antibiyotik bakteri yok edici konsantrasyonları huzurunda yaşama bakteriyel biyofilmler oluşumuna katkıda: mikrofon test bu etkisi11algılayamadı. GC biyofilmler mukozal yüzeyler12tarihinde oluşturabilir çünkü biz o antibiyotik broşürüne duyarlılık toplamları içinde bireysel GC içinde görülen farklı olurdu. Ayrıca, çalışmalar üç değişken yüzey molekülleri, Pili, opaklık ilişkili protein (Opa) faz ve arası bakteri etkileşimleri düzenleyen, lipooligosaccharides (LOS), farklı büyüklükte toplamları13için, yol göstermiştir 14 , 15. katkı antibiyotik direnci için bu bileşenlerin uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle muayene değil.
Şu anda biyofilm ortadan kaldırılması ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. En çok kullanılan nicel biyokütle kristal16boyama violet kullanarak değişiklikleri ölçerek yöntemidir. Ancak, yöntem potansiyel olarak deney tekrarlar17' hatalara neden olabilir önemli deneysel manipülasyon gerektirir. Burada kullanılan canlı/ölü boyama yöntemi canlı ve ölü bakteriler ve biyofilm içinde dağılımını görselleştirme sağlar. Ancak, biyofilm yapısı boya penetrasyon azaltır fiziksel bir engel olarak oluşturabilir. Bu nedenle, bir grup içindeki canlı/ölü bakteriler ölçmek için boyama küçük biyofilmler veya onun öncü-microcolonies veya toplamalardan sınırlıdır. Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri de dahil olmak üzere diğer yöntemleri toplama etkilerini ölçmek mümkün değildir. GC duyarlılık toplama sonra antibiyotik pozlama, ideal bir yöntem içinde her ikisi için ölçebilen bir nicel tahlil bakteriler yaşamak ve onların dağılımını görselleştirmenizi incelemek için.
Burada açıklanan yordamı bir ATP-kullanımı ölçüm birleştirir ve Canlı/Boyama ölü bir nicelik tahlil ve GC duyarlılık toplamları antibiyotik varlığında içinde görsel olarak inceleyin.

<table><tbody><tr><td>100x Kellogg's eki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Testi&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC orta taban&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Ferrik nitrat, nonahidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin Kristal Toz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight canlı/ölü boyama</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria gonorrhoeae suşu</td><td></td><td></td><td>, Walter Reed Ordu Enstitüsü'nden Dr. Herman Schneider tarafından nazikçe sağlanmıştır. Araştırma</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik (K2HPO<>sub4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Proteoz Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Çözünür Nişasta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Tiamin pirofosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu lamel alt haznesi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakaları&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini (NU-425-600 Sınıf II, A2 Laminer Akışlı Biyolojik Tehlike Başlığı)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Model 3530</td><td></td></tr><tr><td>Canlı görüntüleme odası ile donatılmış konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96 Kuyulu Siyah Polistiren Mikroplaka&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax Aydınlatıcı&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (0.1-10 & mikro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (1000 ve mikro; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (200 ve mikro; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Steril 15 ml konik tüpler</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Steril Mikrosantrifüj Tüpleri (1.7 mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Steril polyester uçlu aplikatörler</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Kontes</td><td>9110001'ye</td><td></td> Eşdeğer</tr></tbody></table>

nicel muayene, antibiyotik duyarlılık neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak atp-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Antibiyotik dirençli Neisseria gonorrhoeae (GC) ortaya çıkması bir dünya çapında sağlık tehdidi ve tedavi başarısız bireyler belirlemek gerektiğini vurgulamaktadır. Bu gram-negatif bakteri bel soğukluğu sadece insanlarda neden olur. Enfeksiyon sırasında form toplamları ve/veya biyofilmler yapabiliyor. Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi için antibiyotik duyarlılık belirlemek için ve uygun tedavi tanımlamak için kullanılır. Ancak, içinde vivo ortadan kaldırılması ve laboratuvar sonuçları ile ilişkisi mekanizmasının bilinen değil. Nasıl GC toplama antibiyotik duyarlılık etkiler ve toplam boyutu ve antibiyotik duyarlılık arasındaki ilişkiyi gösterir inceliyor bir yöntem geliştirildi. GC toplamak, antibiyotik öldürmeye daha dayanıklı oldukları zaman, bakteri merkezi ile ceftriaxone tedavi daha iyi daha fazla çevre olan hayatta kalmak için. Verileri N. gonorrhoeae toplama standart agar plaka tabanlı mikrofon yöntemleri kullanarak yansıtılmamış ceftriaxone onun duyarlılık azaltabilir gösterir. Bu çalışmada kullanılan yöntem araştırmacılar bakteri duyarlılık klinik koşullarda test etmek izin verir.

İki yöntem istihdam: bir ATP kullanımı tahlil ve canlı/ölü boyama tahlil. Sonuçları birlikte veya ayrı ayrı toplamları içinde bakteriyel yaşam antibiyotik tedavisinden sonra incelemek için kullanılır. ATP kullanımı tahlil S. aureus biyofilmler20,21doğru canlı bakteri ölçmek için gösterilmiştir. Burada, MS11Opa + Pil + zorlanma GC toplama rolü antibiyotik duyarlılık incelemek için kullanıldı. Sigara toplanan MS11Opa + Pil ...

Basit bir ATP ölçme tahlil ve canlı/ölü boyama yöntemi ölçmek ve Neisseria gonorrhoeae hayatta kalma ceftriaxone ile tedaviden sonra görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı herhangi bir antibiyotik antimikrobiyal etkilerini incelemek için genişletilmiş ve minimum inhibitör konsantrasyonu antibiyotik bakteriyel biyofilmler tanımlamak için kullanılır.

Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Bu teknik, klinik olarak daha uygun koşullar altında antibiyotik duyarlılığını ölçmemizi sağlar. Bu teknik aynı zamanda agregalarda bakterileri öldürebilen gerçek antibiyotik konsantrasyonu belirlememize de olanak sağlar. Bu teknik, GC agregalarını ortadan kaldırmak için gerekli konsantrasyonu belirlemek için uygulanabilir.Bu yöntem aynı zamanda agrega oluşturabilen bakterilerin antimikrobiyal duyarlılığının ölçülmesi için de uygulanabilir. Lysis'in tamamlandığından emin olmak için lysis adımlarına dikkat edin. Aksi takdirde ATP ölçüm tiskomi canlı bakteri sayısını hafife alacaktır.Bu yöntemin görselleştirilmesi, diğer araştırmacıların bu deneyi tutarlılıkla takip edip çoğaltmalarına olanak sağlayacaktır. Neisseria gonorrhoeae çizgili ile başlayın, veya GC suşları, GCK agar üzerinde 16-18 saatlik kuluçka için% 1 Kellogg ile takviye 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit. Ertesi sabah, her plakadan koyu kenarlara sahip koyu kenarlar veya pili pozitif koloniler olmadan pili-negatif kolonileri dikkatle seçmek için hafif bir mikroskop kullanın ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 16 ila 18 saatlik bir kültür için seçilen kolonileri yeni GCK plakalarına yerleştirin.Ertesi sabah, her plaka GC kolonileri toplamak ve sıcak suyu her bez askıya steril bir aplikatör kullanın 4.2% sodyum bikarbonat ve% 1 Kellogg çözeltisi ile takviye. Askıya alınan bakterilerin konsantrasyonunu belirlemek için optik yoğunluğu 650 nanometre veya OD650 olarak ölçün ve GC konsantrasyonunu mililitrede sekiz koloni oluşturan ünitelere kadar yaklaşık bir kez 10'a ayarlayın. Daha sonra, 96 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına 99 mikrolitre GC süspansiyonu ekleyin ve bakterilerin 6 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit toplama izin verin.Kuluçka sonunda, her iyi bazı kuyular kontrol olarak hizmet etmek ve başka bir 24 saat için kuvöz plaka dönmek için tedavi edilmezse bırakarak seri seyreltilmiş seftriakson bir mikrolitre ekleyin. Ertesi gün, sonication başına beş saniye için 144 watt ve 20 kilohertz her kuyuda üç kez süspansiyon sonicate ve her kuyuya ticari olarak kullanılabilir ATP kullanım kızdırma reaktif 100 mikrolitre ekleyin. Her kuyudan 150 mikrolitre karışımı yeni bir 96 kuyulu siyah mikroplakanın ayrı kuyularına dikkatlice aktarın ve her kuyunun emiciliğini bir plaka okuyucuda 560 nanometrede ölçün.Daha sonra, seri antibiyotik tedavisi sonrası elde edilen okuma oranı ile tedavi edilmeyen kuyulardan okuma oranı hesaplamak. Canlı/ölü GC agregalarının görselleştirilmesi için, bir gecede kültürlenmiş plakalardan GC toplamak ve %1 Kellogg ile desteklenen önceden ısınmış GCP ortamında GC'yi yeniden askıya almak için steril bir aplikatör kullanın. OD650'yi spektrofotometri ile ölçün ve konsantrasyonu mililitrebaşına yedi koloni oluşturan üniteye yaklaşık bir kez 10'a ayarlayın.Daha sonra, sekiz kuyulu kapaklı alt odaları içine GC süspansiyon 198 mikrolitre ekleyin ve altı saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak odaları kuluçka. Kuluçka sonunda, agregasyon durumu başına iki mikrolitre seftriakson ile bakterileri tedavi edin ve uygun deneysel kuluçka dönemi için odaları kuvöze geri döndürün. Kuluçka sonunda, her kuyuya 0,6 mikrolitre canlı/ölü boyama çözeltisi ekleyin ve odaları 20 dakika daha kuvöze geri verin.Daha sonra, z-serisi görüntüler elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanın. GC agregalarının boyutunun ölçümü için ImageJ'deki ilk görüntüyü açın ve görüntüdeki her toplama alanının çevresini daire içine almak için serbest el çizgileri seçin. Analiz et ve ölç'e tıklayın.Agregaların boyutu alan sütununun altında gösterilir. Canlının her bir agregadaki ölü boyama yada floresan yoğunluk oranının ölçülmesi için, analiz etmek ve ölçümleri ayarlamak ve açılır penceredeki entegre yoğunluğu kontrol etmek için tıklayın. Tamam'ı tıklatın ve resim, renk ve kanallar aracını tıklatın.Ölü bakteri boyama için floresan olarak renk ve kanal bir seçin. Her toplama alanının çevresini daire içine almak için serbest çizgileri seçin ve tümleşik yoğunluk sütunundaki her bir agrega için floresan yoğunluk oranını elde etmek için analiz et ve ölç' e tıklayın. Canlı bakteri boyama için floresan için kanal 2'yi seçin ve her bir agregadaki floresan yoğunluğunu az önce gösterildiği gibi ölçün.Daha sonra canlı floresan yoğunluğu verilerini ölü floresan yoğunluğu verilerine bölerek canlıdan ölüfloresan yoğunluk oranına geçin. Bu temsili deneyde, agregasız pili pozitif, birleştirilmiş pili pozitif veya birleştirilmiş ve bozulmuş pili pozitif bakteriler ATP düzeylerinin ölçülmeden önce seri seftriakson seyreltmeleri ile tedavi edildi. Preaggregated GC, eşit sayıda seftriakson veya daha yüksek konsantrasyonlarda tedavi edildiğinde, toplu olmayan veya agregasyon bozulmuş GC'den anlamlı olarak daha yüksek bir sağkalım göstermiştir.Daha büyük agregalar oluşturan pili-pozitif suşlar mutant suşlarına göre seftriakson tedavisinden sonra en yüksek ATP düzeylerini sergiledi. Ne olursa olsun suş test, antibiyotik tedavisi öncesi canlı / ölü boyama büyük ölçüde kültürün dış katmanlarında bulunan ölü bakteriler ortaya, canlı GC seftriakson tedavi agregaların çekirdek içinde ağırlıklı olarak tespit edildi. Beklendiği gibi, pili-pozitif bakteriler en büyük agregaları, pili-negatif kültürler ise en küçük agregaları oluşturmuştur.Özellikle, pili-pozitif agregalar antibiyotik tedavisinden sonra çekirdek katmanlarında hala hayattaydı, küçük, gevşek mutant agregalarda GC ise ölmüştü. GC'nin büyüklüğü ne ve hayatta kalım larına bağlı olarak, bakterilerin toplama boyutu ile antibiyotik sağkalımı arasındaki ilişkiyi incelemek için bir korelasyon grafiği çizilebilir. Sonication her bir bakteri ATP sıkıca bağlı agregalar içinde serbest olduğundan emin olmak için önemlidir.Aksi takdirde, ölçümler tutarlı olmayacaktır. Onlar agrega sonra bakteri plaka önemlidir ve hem canlı ve çoğaltma yeteneğine sahip bakterileri ölçmek için antibiyotik ile tedavi edilir. Bu teknik, bakterilerin antibiyotik duyarlılığı üzerindeki etkisini ölçerek araştırmacıların hastalıkların tedavisi için daha iyi ilaçlar geliştirmelerine olanak sağlar.

quantitative-examination-antibiotic-susceptibility-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Cayron, J. ve Lesterlin, C. Stres Tedavileri Altında Bakteri Büyümesinin Çok Ölçekli Analizi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, canlılığı ölçmek için kaplama ve hücre boyutunu ve DNA içeriğini analiz etmek için akış sitometrisi kullanarak hücre bölünmesini inhibe eden antibiyotik tedavisi altında E. coli filamentasyonunu ve DNA replikasyonunu değerlendirme prosedürünü göstermektedir.

E. coli'de Antibiyotiğe Bağlı Filamentasyonun Kaplama Testi ve Akış Sitometrisi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Kaynak: Maurakis, S. ve Cornelissen, C. N. Metale Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Konakçı Ligandlardan Metal Edinimi için Neisseria gonorrhoeae'nin Metalle Sınırlı Büyümesi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, ligand bağlanması, antikor tespiti ve kolorimetrik görselleştirmeyi içeren bir nokta leke tahlili kullanılarak metal sınırlı koşullar altında yetiştirilen Neisseria gonorrhoeae'de yüzey metal taşıyıcılarını tespit etme prosedürünü göstermektedir.

Neisseria gonorrhoeae'deki Yüzey Metal Taşıyıcılarının Nokta Blot Kullanılarak Tespiti

Bu video, antimikrobiyal tedavinin Pseudomonas aeruginosa (Pa) agregatları üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. Floresan etiketli Pa hücreleri, enfeksiyon sırasındaki büyüme modelini taklit ederek agregalar halinde büyütülür. Agregalara öldürücü olmayan bir antibiyotik kolistin konsantrasyonu ile meydan okunduktan sonra, bakteri-antibiyotik etkileşiminin gerçek zamanlı değerlendirmesi floresan mikroskobu ile gerçekleştirilir.

Bakteriyel Agregatlar Üzerinde Antimikrobiyal Tedavileri İncelemek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu videoda, lusiferaz kızdırma reaktifi kullanılarak yapılan basit ATP ölçüm testi açıklanmaktadır. Bu test, seftriakson ile tedaviden sonra Neisseria gonorrhoeae sağkalımını ölçmek için kullanılır.

Antibiyotik Tedavisi Altında Bakteriyel Sağkalımı Belirlemek İçin Bir ATP Kullanım Testi

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Keşfedin, Neisseria gonorrhoeae toplumlarında antibiyotik duyarlılığını ATP ölçümü ve canlı/ölü boyama yöntemleriyle nicel olarak değerlendirme tekniğini. Bu yöntem, klinik koşullarda bakteri yaşayabilirliğini doğru şekilde analiz etmeyi sağlar.

Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama (Video) | JoVE Journal

Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

Daha fazla video keşfet