Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme
25 Ocak 2019
Dictyostelium discoideum hücre göç, endositoz ve geliştirme gibi karmaşık hücresel süreçler çalışmaya bir popüler bir model organizmadır. Belgili tanımlık yarar organizmanın genetik manipülasyon fizibilite üzerinde bağlıdır. Burada, sıvı ortam kodlamayla hücrelerde varolan sınırlamalar üstesinden Dictyostelium discoideum hücre transfect yöntemleri mevcut.
Bu protokolün değeri, bu suş sıvı ortamda eksenli olarak büyüyüp büyümeyeceğine bakılmaksızın, neredeyse her türlü dictyostelium discoideum türünün moleküler genetik tarafından manipüle edilmesine izin verilmesidir. Bu tekniğin bir diğer avantajı hızlı ve basit olmasıdır. Dictyosteliums karıştırmaya başlamadan önce bir ekzoromosomal plazmid ile transfect hücrelere transkt.
Sonuçlar transfeksiyondan iki gün sonra mikroskopi ile doğrulanabilir. Dictyostelium hücreleri ve bakteri süspansiyonu ile çalışmak alışılmadık bir durumdur. Görselleştirme, deneme yapanlara protokollerin farklı adımlarının nasıl gerçekleştirildiği hakkında bir fikir vermenize yardımcı olur.
Prosedürü benimle birlikte göstermek Soudabeh Imanikia, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre magnezyum klorür ve kalsiyum klorür ile sorensen tampon çalışma çözeltisi 1000 mililitre hazırlamak. Bundan sonra, LB orta bir litre aşılamak için K aerogenes tek bir koloni kullanın.
Bakterilerin sallayarak 37 santigrat derece bir gecede büyümeye izin verin. Hücreleri hasat etmek için iki 500 mililitrelik santrifüj tüpleri aşağı hücreleri spin. Daha sonra bakterileri 500 mililitre tamponla yıkayın.
20 mililitre arabellekte peleti yeniden askıya alın. Numunenin optik yoğunluğunu kontrol etmek için bir fotometre kullanın ve optik yoğunluk yaklaşık 100 olana kadar numuneyi tamponla seyreltin. Bundan sonra, metin protokolüne göre H40 elektroporasyon tamponu hazırlayın.
Oda sıcaklığında bir gecede bir SM orta birleştirmek için K aerogenes grow. Bir SM agar plakasına 400 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve eşit olarak yayın. Daha sonra steril bir döngü yütleyin ve dictyostelium hücreleriyle aşılamak ve hücreleri plakanın bir kenarına yayın.
Büyüme bölgelerinin transfeksiyon için yeterince büyük olduğundan emin olmak için plakayı iki gün boyunca 22 derecede kuluçkaya yatırın. 10 santimetrelik doku kültürü yle tedavi edilen Petri kabına 10 mililitre K aerojen süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, kültür plakasının büyüme bölgelerinden hücreleri kazımak için 10 mikrolitrelik tek kullanımlık aşılama döngüsü kullanın.
Hücreleri buz gibi H40 tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10000 kat yerçekiminde iki saniye döndürün. Daha sonra, supernatant atın ve H40 tampon hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra, 1-2 mikrogram DNA içeren bir tüpe 100 mikrolitre hücre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve önceden soğutulmuş elektroporasyon cuvette hücre DNA karışımı aktarmak için. İki mikrogramdan fazla DNA eklemeyin.
Daha yüksek DNA konsantrasyonu hücreler için toksik ve verimliliği azaltır. Elektroporasyondan sonra, hücreleri hemen hazırlanmış 10 santimetrelik Petri kabına aktarın ve hücrelerin beş saat boyunca iyileşmesini bekleyin. Bir nakavt, knock-in veya bir hareket beş knock-in için bir transfectant seçmek için, yüzey üzerinde sıvı borulama tarafından Petri çanak hücreleri ayırmak.
Daha sonra, metin protokolüne göre seçici aracının üç seyreltme ayarlayın. Son olarak, 96-iyi düz alt doku kültür plakaları her kuyuiçine hazırlanan seyreltme 150 mikrolitre dağıtın. Bu protokolde çift muhabir ekstrakromosomal plazmid sistemi gösterilmiştir.
Transfeksiyondan 32 saat sonra, hücrelerin çoğu hem floresan etiketli füzyon proteinlerini ifade etti. Bir hareket beş M kiraz knock-in ve bir NC4 de denendi. Bir agarose jel üzerinde sindirim çalıştırdıktan sonra iki bant elde edildi.
4127 baz çifti bandı istenilen yapıyı içerir. Saflaştırılmış DNA NC4 hücrelerinin transfeksiyonu için kullanıldı. NC4 transfeksiyonunun iki klonu PCR ile analiz edildi ve her ikisi de öngörülen bant modellerini gösterdi.
Güney leke sonra PCR sonuçlarını doğrulamak için kullanılmıştır. NC4 ax2 hücrelerinden daha bakteriyel çimler üzerinde daha hızlı büyüdü. Dört saat sonra, NC4 hücrelerinin daha Ax2 hücreleri daha agarose altında tarama başardık.
NC4 hücreleri daha hızlıydı ve folata Ax2 hücrelerinden daha güçlü kemotaktik yanıt gösterdi. Her zaman yeni kurulmuş SM plakaları hücreleri kullanın. Dört günden daha eski hücreleri asla kullanmayın, aksi takdirde verimlilik düşer.
Taze izole, nonextenic, beyaz HAP suşları genellikle dictyosteliums bir ruching veya sosyal davranış ile ilgili soruları ele almak için kullanılır. Moleküler genetiği bu izole ler aracılığıyla uygulayabilesin.
Genel Bakış
Bu makale, suşun büyüme koşullarından bağımsız olarak genetik manipülasyona olanak tanıyan, Dictyostelium discoideum hücrelerini transfekte etmek için bir protokol sunmaktadır. Yöntem verimli ve basit olup, sonuçların hızlı bir şekilde doğrulanmasını sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Genetik manipülasyon
- Model organizmalar
Arka Plan
- Dictyostelium discoideum, hücresel süreçlerin incelenmesinde yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır.
- Genetik manipülasyon, çeşitli biyolojik soruların araştırılması için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler, farklı suşların büyüme koşullarına bağlı olarak sınırlamalar içermektedir.
- Bu protokol, söz konusu sınırlamaların üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Dictyostelium discoideum'in çeşitli suşlarını transfekte etmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Aksenik olarak büyümeyen suşlarda moleküler genetik uygulamaları kolaylaştırmak.
- Transfeksiyon sürecinin verimliliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Transfeksiyon için bakteriyel ve tampon çözeltilerin hazırlanması.
- Dictyostelium discoideum hücrelerinin plazmit DNA ile elektroporasyonu.
- Transfeksiyon sonuçlarının mikroskopi ve PCR kullanılarak doğrulanması.
- Transfeksiyona yanıt olarak hücre davranışının ve büyümenin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Birden fazla Dictyostelium discoideum suyunun başarılı şekilde transfeksiyonu.
- Transfeksiyondan 32 saat sonra floresan protein ekspresyonunun gözlemlenmesi.
- NC4 hücrelerinin, Ax2 hücrelerine kıyasla daha hızlı büyüme ve kemotaktik yanıt göstermesi.
- Genetik modifikasyonların PCR ve Southern blot analizi ile doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, Dictyostelium discoideum suşlarının etkili genetik manipülasyonuna olanak tanır.
- Hücresel davranış ve genetik üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için bir çerçeve sunar.
- Yeni izole edilmiş suşlar, transfeksiyon verimliliği açısından en iyi sonuçları verir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Bu protokol, bakteriler üzerinde büyüyen vahşi tip Dictyostelium suşlarının genetik manipülasyonuna olanak tanıyarak, Ras sinyalleşmesi bozulmuş aksenik adaptasyonlu suşların sınırlamalarını ortadan kaldırır. Hastalıkla ilgili bir model sistemde hedef doğrulaması için ölçeklenebilir ve hızlı bir yöntem sunarak, erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler. Bu yaklaşım, moleküler genetiği çevresel olarak izole edilmiş suşlara genişleterek, fenotipik tarama iş akışlarında translasyonel sürekliliği ve öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Ras sinyali sağlam olan non-aksenik suşlar kullanarak, bozulmamış sinyalizasyon ve hareketlilik yolaklarındaki terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Aksenik suşlarda görülen makropinositoz kusurları ve göç bozukluklarından kaynaklanan deneysel karıştırıcı etkenleri azaltır.
- Öngörücü Değer: Fizyolojik olarak ilgili büyüme koşullarında mutajeneze izin vererek, fonksiyonel hedef doğrulamayı ve biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik taramaları için hızlı analiz sonuçları sağlayan, 32 saat içinde çift floresan raporer eksprese eden rekombinant hücreler üretir.
- Operasyonel Değer: Bakteriyel çimleme ve elektroporasyon kullanarak transfeksiyon iş akışını standartlaştırır ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Transfeksiyondan doğrulanmış klonlara kadar geçen süreyi haftalar yerine günlere indirerek hızlandırır ve yüksek kapasiteli suş mühendisliğini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Yeni izole edilmiş yabani tip suşlarda kemotaksi ve sosyal davranış çalışmalarını kolaylaştırarak hastalık modeli ilgisini artırır.
- Operasyonel Değer: Moleküler genetiğin, önceden aksenik adaptasyon gerektirmeden çevresel izolatlara doğrudan uygulanmasını sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Folat kaynaklı kemotaksi ve agaroz penetrasyon analizleri gibi ölçülebilir çıktılar aracılığıyla, keşif aşamasındaki hedef doğrulamayı preklinik fenotiplere bağlar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, yolak sorgulama ve fenotipik tarama için genetik olarak yönetilebilir modeller sağlayarak, erken keşiften potansiyel ilaç adayının belirlenmesi aşamalarına kadar olan sürece uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Bozulmamış vahşi tip suşlar kullanarak kemotaksi, makropinositoz ve gelişim sinyalizasyonunda hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için bakteriyel çimler üzerinde kantitatif floresan ve büyüme verileri sağlar.
- Analitikler: Transfeksiyondan sonraki 32–48 saat içinde genetik modifikasyonların PCR, Southern blot ve mikroskopi tabanlı doğrulanmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Genetik manipülasyonu, kemotaksi ve agaroz altında büyüme gibi fonksiyonel analizlerle ilişkilendirerek risk ayarlı ilerlemeye bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İzolasyon kaynağı veya büyüme koşulundan bağımsız olarak, herhangi bir Dictyostelium suşunun mühendisliği için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Aksenik adaptasyondan kaynaklanan artefaktları ortadan kaldırarak ve doğal sinyal yolaklarını geri getirerek öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş tampon hazırlıkları, elektroporasyon parametreleri ve seleksiyon protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Suş mühendisliği zaman çizelgelerini kısaltarak ve hedef doğrulamada hızlı karar verme süreçlerini mümkün kılarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış genetik modifikasyonlara sahip, mekanistik olarak riskten arındırılmış modeller oluşturarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Bakteriyel kültür hazırlama ve bakteriyel çimler üzerinde Dictyostelium işlemleri için mikrobiyoloji uzmanlığı gerektirir.
- Transfeksiyon ve geri kazanım adımları için elektroporasyon ekipmanına ve steril doku kültürü altyapısına erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar arasında bakteriyel inokülüm yoğunluğunun (OD ~100) ve H40 tamponu hazırlığının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Protokolün farklı vahşi tip izolatlara veya çevresel suşlara uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Bakteriyel çimler üzerinde büyüme kapasitesine sahip suşlarla sınırlıdır; izolasyondan sonra dört günden daha yaşlı olan hücrelerde verimlilik azalır.
