Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları
7 Ocak 2019
Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.
Kalsiyum görüntüleme deneylerinden büyük miktarda veri elde etme kapasitesi, özellikle doku görüntüleme deneyleriyle büyük ölçüde artmıştır. Protokollerimiz, bu veri kümelerini ölçmek ve tanımlamak için uygun analiz tekniklerini açıklar. Protokollerimiz tüm dokularda kalsiyum sinyaline özgü bir dizi mekansal, zamansal ve yoğunluk değerleri üretir ve bu daha ilkel tabanlı analizlerde kaybedilebilir.
Görüntülemeden bir saat önce, cajal veya ICC'nin interstisyel hücreleri olan ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatını dönen disk konfokal mikroskobu aşamasına ifade eden bir fareden alınan ince bağırsağı aktarır. Ve sürekli 37 derece Santigrat Krebs-Ringer bikarbonat veya KRB çözeltisi ile doku perfüzyon. 60-100 X büyütme kullanarak ince bağırsağın dairesel ve uzunlamasına düz kas katmanları arasında stellat şekilli mienterik pleksus ICC veya ICC-MY bulun.
Daha sonra dairesel düz kas tabakası ve submukozal pleksus arasında tek bir düzlemde mil şeklinde derin kas pleksus ICC veya ICC-DMP bulmak ve TIFF görüntüleri bir yığın olarak film kaydetmek. ICC-DMP kalsiyum aktivitesinin spatiotemporal haritaları veya STM'leri oluşturmak için ImageJ'deki görüntü yığınını açın ve görüntü kalitesini değiştirmek için Resim, Tür ve 32 bit'i tıklatın. Satır tarası oluşturmak için satır seçim aracına sağ tıklayın ve parçalı satırı seçin.
Tek sol tıklamalar kullanarak, tüm hücre ana hatları ana hatları yla belirtildiğinde çift tıklatarak, tek bir ICC-DMP'nin orta erişimi boyunca bir çizgi çizin. Resim, Yığınlar ve Yeniden Dilimle'yi seçin. Açılır pencere görüntülenir.
Çizgi tonu'nu soldan sağa yönlendirmek için 90 derece döndür'ü seçin, böylece kalibrasyon yapılabilir ve x ekseninde zamana karşı okunabilir ve y ekseninde boşluk tutamaz ve Tamam'ı tıklatın. Spatiotemporal harita görünecektir. Haritadaki kalsiyum sinyallerinin genliğini doğru bir şekilde ölçmek için dikdörtgen seçimi seçin ve STM içinde en düzgün ve en yoğun floresan alanını gösteren alanın etrafına ilgi alanı çizin. Seçili ilgi alanı içindeki yoğunluğun ortalama değerini elde etmek için Analiz ve Histogram'ı tıklatın ve tüm STM'yi seçmek için Tümünü Seç'i tıklatın.
Ardından, İşlem, Matematik ve Bölme'yi tıklatın ve açılan kutuda ilgi çekici seçilen STM bölgesiyle yoğunluğun ortalama değerini girin. STM siyaha dönecek. Açılan pencerede Resim, Ayarla, Parlaklık/Kontrast ve Otomatik'i tıklatarak bunu düzeltin.
Hat tonu şimdi floresan sıfır floresan tarafından bölünmüş olarak ifade edilen floresan yoğunluğu ile genlik için kalibre edilecektir. STM, X ekseninde TIFF yığınındaki kare sayısını ve y ekseninde hücrenin uzunluğunu gösteren piksel sayısını görüntüler. Kalsiyum sinyallerinden gelen zamansal ve uzamsal verileri ölçmek için Resim ve Özellikler'i tıklatın ve açılan pencerede STM'yi uzay ve zaman için tam olarak kalibre etmek için uygun değerleri girin.
Bireysel kalsiyum olaylarını analiz etmek için Düz Çizgi'yi tıklatın ve x eksenine paralel bir kalsiyum olayının merkezinden düz yatay bir çizgi çizmek için STM'yi tıklatın ve sürükleyin. Ardından Analiz et ve Profili Oluştur'u tıklatın. Kalsiyum olayının çizim profilini gösteren bir kutu görüntülenir.
ICC-MY kalsiyum sinyal verilerinin parçacık tabanlı analizi için, film dosyasını Volumetry'de açın ve STK Filtresi, Farklılaştırma'yı seçmek için sağ tıklayın. Ayırt etmek için bir değer giriş yapmak için tekrar sağ tıklatın. Farklılaşmayı başlatmak için Enter tuşuna basın ve sol tıklatın.
Parçacıklar oluşturmak için, filmde gezinmek için orta fare düğmesini kullanarak, bir ikilik periyot içeren 20-40 karelik bir bölüm seçin, ardından bir kalsiyum geçici küme ve kümeden hemen sonra takip eden 20 ila 40 kare oluşumunu izleyin. Tüm kareler stk OPS Rampa DS parçacık bilgilerine erişmek için film penceresinde sağ tıklandığında ve eşiği en üst ten minimum yoğunluğa kademeli olarak rampalayan bir parçacık analizi yordamını çalıştırmak için tıklatın. Başarılı bir parçacık analizi sağlamak için, mümkün olduğunca çok ön-kalsiyum geçici küme non-aktivite ve çok post-kalsiyum geçici küme non-aktivite dahil emin olun.
Bu sinyal-gürültü oranını artırmak için yardımcı olacaktır. Analiz, gürültü nün çizimi olarak çizim penceresinde grafik olarak ve parçacık sayısını temsil eden yeşil iz, ortalama parçacık boyutunu temsil eden kırmızı iz ve mutlak yoğunluk eşiğini temsil eden mavi iz ile üç renk izi olarak izleme penceresinde görüntülenir. Histogram için parçacık gürültü nün çizimini klavyedeki H tuşuna basın.
Ardından, arka plan beyaz olana ve üstteki renk izleri olana kadar renk şemaları arasında geçiş yapmak için sağ ayraç tuşuna basın. Bir ölçüm aracı getirmek için klavyedeki F tuşuna bir kez basın. Ardından, renkli çizimlerin sağ tarafa kaymaya başladığı kavşaktaki çizim deki izleme penceresinin kaydırma çubuğundaki tek bir dikey çizgiyi işaretlemek için ikinci kez F tuşuna basın.
İzler penceresi içinde işaretli beyaz dikey çizgi kırmızı izleme nin dönüm noktasından kaydırmak için orta fare düğmesini kullanın. Görüntülenen Y ortalamasını kaydettikten sonra, mavi izlemeyi seçmek için izleme penceresinin içindeki orta fare düğmesini yeniden tıklatın. Film penceresinde renk çarkını getirmek için C'yi ve eşiği ayarlamak için D'yi tıklatın.
Geçerli parçacıklar şimdi kırmızı renkte gösterilecektir ve doygunluk yapanlar beyaz olacaktır. Beyaz alanlar kaldırılana kadar kaydırmak için sol fare düğmesini kullanın ve renk çarkındaki sarı sayısal değeri y ortalama değerine ayarlamak için orta fare düğmesini kullanarak her şeyi belirlenen eşik noktasında aktif kalsiyum geçici parçacık olarak kırmızı olarak atayın. Verileri koordinat tabanlı parçacık dosyası olarak kaydetmek için STK 3D'ye erişmek için sağ tıklatın, parçacık sıfırı kaydedin ve dosyayı kaydetmek için sol tıklatın.
Parçacık etkinliği ısı haritaları oluşturmak için kaydedilen parçacık dosyasını açın ve parçacık STKops, StatMap Bayrak erişmek ve analiz etmek için bayrak atamaları girmek için film penceresinde sağ tıklayın. Analiz ve kayıt boyunca yüzde oluşumu nu temsil eden farklı renklerle kayıt tüm uzunluğu için toplam parçacıkları gösteren bir ısı haritası uygulamak için tıklatın. Isı haritasını TIFF dosyası olarak kaydetmek için sağ tıklatın.
Ardından parçacık ölçüsüne erişmek için film penceresinde sağ tıklatın, parçacık istatistikleri STK eşittir ve çözümleme için bir bayrak ataması girin. İzleme penceresinde bir dizi izleme oluşturulur. STM analizi, kalsiyum sinyalinin uzamsal yayılma ve yayılma hızı gibi uzamsal özelliklerini izleme ve kaydetme olanağı sağlar.
Bu bilgiler, kendi ortamlarında hücreler deki kalsiyum sinyaldavranışlarının tam bir görünümünü sağlamak için toplanabilir. Parçacık analizi kullanılarak, kalsiyum sinyali ile ilgili nicel bilgiler parçacık alanı ve parçacık sayısı ölçülerek hesaplanabilir ve bu bilgiler, belirli bir görüş alanı içinde kalsiyum sinyali aktivasyonunun uzamsal aralıklarını belirlemek için birlikte kullanılabilir. Parçacık analizi aynı zamanda yerin incelenmesi ve kalsiyum ateşleme bölgelerinin ateşleme olasılıkları ile hücre altı kalsiyum sinyallerinin derinlemesine ölçülmesine olanak sağlar.
Parçacıkları zamansal özelliklerine göre farklı bayraklara ayırarak, başlatan parçacıklar doğru bir şekilde eşlenebilir. Ve inisiyasyon sitelerinin sayısı, piksel ve mikrometre olarak sitenin boyutu, her bir kalsiyum geçici küme sırasında bir veya birden çok kez ateş her başlatma sitesi olasılığı ve her kalsiyum geçici küme döngüsü sırasında ateş ateş siteleri yüzdesi elde edilebilir sabit veri zenginliği elde edilebilir. Tutarlılık bu protokolde başarının anahtarıdır.
Güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tüm veri kümeleri ve tüm filmler aynı şekilde ele alınmalıdır. Bu özellikle parçacık dosyaları ile ilgili doğrudur. Protokollerimiz kalsiyum sinyalinin yerinde derin bir karakterizasyonuna olanak sağlar ve uygun kullanıldığında bir dizi istatistiksel yöntem, çeşitli mekansal ve zamansal parametreler arasındaki farklılıkları değerlendirebilir.
Protokolümüzdeki bu analiz teknikleri, araştırmacıların bağırsak pacemaking ve bağırsak innervasyonu ile ilgili daha önce ele alınamayan soruların yanı sıra alt üriner sistemin nöronal kontrolünü sormalarına ve yanıtlamalarına olanak sağlamıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, doku deneylerindeki kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini geliştirmeye, özellikle de genetik olarak kodlanmış Ca2+ indikatörlerinin (GECI'ler) kullanımına odaklanmaktadır. Gelişmiş analitik teknikler aracılığıyla kalsiyum sinyallerinin kantifikasyonunu kolaylaştıran detaylı protokoller sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Kalsiyum görüntüleme
- Sinyal kantifikasyonu
- Doku analizi
Arka Plan
- Kalsiyum görüntüleme deneylerinden daha iyi veri elde edilmesi
- Kalsiyum sinyalizasyonunun yakalanmasında doğru analiz tekniklerinin önemi
- In situ görüntüleme için genetik olarak kodlanmış belirteçlerin kullanımı
Kullanılan Yöntemler
- Spatyotamporal haritalama
- Parçacık tabanlı analiz
- Mikroskopi teknikleri (konfokal mikroskop)
Ana Sonuçlar
- Protokoller, kalsiyum sinyalizasyonunun anlaşılması için kritik olan mekansal, zamansal ve yoğunluk verileri sağlar
- Kalsiyum olaylarının ve bunların özelliklerinin ölçümünde artırılmış doğruluk
- Doku örneklerindeki kalsiyum geçici kümelemlerinin analizi için bir çerçeve oluşturulmuştur
Sonuçlar
- Çalışma, dokulardaki kalsiyum sinyallerini nicelleştirmek için gelişmiş yöntemler sunmaktadır
- Kalsiyum sinyalizasyonunda biyolojik içgörülerin geliştirilmesi için rafine analitik yaklaşımların önemini vurgulamaktadır
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Doğal doku ortamlarında hücre içi Ca2+ sinyalleşmesinin doğru şekilde nicelendirilmesi, gastrointestinal ve nöromüsküler ilaç keşiflerinde hedef doğrulamadaki risklerin azaltılması için kritik öneme sahiptir. Uzay-zamansal haritalama ve partikül tabanlı analiz; yüksek çözünürlüklü Ca2+ görüntüleme verilerinden mekansal, zamansal ve yoğunluk parametrelerinin çıkarılmasını sağlayarak, sinyalleşme karmaşıklığını göz ardı eden basitleştirilmiş ROI ölçümlerine olan bağımlılığı azaltır. Bu yaklaşım, kalp pili (pacemaker) aktivitesi ve nöronal kontrol yollarına dair mekanistik içgörüyü destekleyerek erken keşif aşamalarındaki öngörüsel güvenilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bozulmamış dokularda frekans, süre, yayılma hızı ve genlik gibi Ca2+ sinyalizasyon paternlerini nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Gastrointestinal motilitenin temel bir düzenleyicisi olan Cajal interstisiyel hücreleri (ICC) aktivitesinin ayrıntılı karakterizasyonu aracılığıyla biyolojik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Öngörücü Değer: Ca2+ sinyalizasyon dinamiklerini intestinal pacemaker aktivitesi ve alt üriner sistemin nöronal kontrolü ile ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: in situ Ca2+ geçici kümelerinden kantitatif çıktılar üreterek, sonraki iş akışları için doğrulanmış biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kalibre edilmiş uzaysal-zamansal haritalar (STM'ler) ile tanımlanmış eşik değerleme ve bayrak atama protokollerine sahip partikül tabanlı analizler aracılığıyla assay standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Yüksek hacimli veri işlemeye ve deneyler arası karşılaştırmaya olanak tanıyan koordinat tabanlı partikül dosyaları ve ısı haritaları aracılığıyla tarama hazırlığını sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Bağırsak ICC'lerindeki keşif aşaması Ca2+ sinyalizasyon analizini, motilite bozukluklarının ve üriner sistem disfonksiyonunun preklinik doğrulamasıyla ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Başlangıç bölgesi konumu, ateşleme olasılığı ve küme dinamiklerinin incelenmesi yoluyla subselüler Ca2+ sinyalizasyonunun ayrıntılı olarak nicelenmesine olanak tanır.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: Başlangıç bölgesi sayısı, piksel/mikrometre cinsinden bölge boyutu ve geçici küme döngüsü başına aktif ateşleme bölgelerinin yüzdesi hakkında somut veriler sağlayarak devam/durdur kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulaması ve assay hazırlığına temel teşkil eden kantitatif Ca2+ sinyalizasyon verileri sağlayarak, Erken Keşif aşamasından Ön Lider Belirleme ve Preklinik çalışmalara kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: STM analizi aracılığıyla Ca2+ sinyallerinin uzaysal yayılımını ve yayılma hızını yakalayarak hipotez testlerini ve yolak netleştirme çalışmalarını destekler.
- Tarama: Parçacık alanı ve sayısının tekrarlanabilir nicelendirmesi yoluyla analiz hazırlığı sağlayarak, tanımlanmış bir görüş alanında Ca2+ sinyal aktivasyonunun uzaysal aralık belirlenmesine olanak tanır.
- Analitik: Parçacıkların zamansal özellikleri üzerine istatistiksel çıktılar üretir; bu da başlatıcı parçacıkları haritalamak ve ateşleme olasılıklarını değerlendirmek için bayraklandırma sistemine ayırmayı sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Bağırsak pacemaker mekanizmaları ve nöronal kontrol yolaklarıyla bağlantılı Ca2+ sinyalizasyon modellerinin analizine imkan tanıyarak preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: STM kalibrasyonu, parçacık analizi ve ısı haritası oluşturma için standartlaştırılmış protokoller aracılığıyla, model sistemler genelinde Ca2+ sinyalizasyonunu analiz etmek için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Ca2+ sinyal iletim dinamiklerindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla hedef doğrulamada öngörücü güven.
- Operasyonel Değer: Kalibre edilmiş STM'ler, eşik ayarlı partikül tabanlı analiz ve koordinat tabanlı veri çıktısı ile sağlanan standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Tutarsız veya tekrarlanamaz sinyal modellerinin erken tespitini sağlayarak daha iyi git/gitme kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Başlangıç bölgesi yoğunluğu, boyutu ve ateşleme güvenilirliğine ilişkin nicel verilerle desteklenen riskten arındırılmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- STM oluşturma ve partikül analizi için konfokal mikroskopi, ImageJ ve Volumetri konularında bilimsel uzmanlık gereklidir.
- Enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları arasında dönen diskli konfokal mikroskop, TIFF görüntü yığını yönetimi ile hat tarama yeniden dilimleme (line scan reslice), histogram dengeleme ve eşik ayarı için kullanılan yazılımlar yer almaktadır.
- Ekipler arası standardizasyon gereksinimleri, özellikle partikül dosyası oluşturma ve bayrak tabanlı analizler için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak amacıyla tüm veri setlerinin ve videoların tutarlı bir şekilde işlenmesini kapsar.
- Model sistemler arası adaptasyon hususları arasında hat tarama yöneliminin ayarlanması, sükunet ve aktif dönemler için kare seçimi ve floresan yoğunluk profillerine dayalı eşik kalibrasyonu yer alır.
- Pratik kısıtlamalar arasında; başarılı partikül analizi ve optimal sinyal-gürültü oranı sağlamak için sükunet dönemlerini, Ca2+ geçici kümelerini ve küme sonrası aktiviteyi kapsayan 20–40 karelik bölümlerin dikkatli seçilmesi gerekliliği bulunmaktadır.
