Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site yönelimli mutagenez, RNA-RNA ve RNA protein etkileşimleri gibi moleküler etkileşimleri incelemek için yararlıdır. Bu protokol, iki veya 3 adımlı PCR yaklaşımıyla site yönelimli mutagenezinnasıl gerçekleştirilini açıklar. Yöntemin temel avantajları, dahil edilebilen farklı mutasyonların çeşitliliğinin yanı sıra göreceli bir kolaylık ve bunun maliyetidir.

Başlamak için, 2 adımiçin özel iki, bir ve iki, üç veya üç, üç, dört astar çiftleri, PCR ürün bir elde etmek için 3 adımpcr için özel vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri kullanın. Agarose jel elektroforez ile PCR ürünleri doğrulamak için, bir mikrodalga fırın kullanarak, 1X TAE tampon 100 mililitre agarose iki gram eriterek% 2 agarose jel olun. Mililitre başına 0,5 mikrogram son konsantrasyonda ethidyum bromür ekleyin.

Sonra agarose jel döküm. Katılaştırıldığında, bir elektroforez ünitesine yerleştirin. Bilinen boyutta bir DNA merdiveni yükleyin ve DNA yükleme boyası ile karıştırılmış PCR örnekleri kuyulara.

Örnekleri 75 voltta 45 dakika çalıştırın. Uv transilluminator'da veya jel görüntüleme sistemiyle bantları görselleştirin. Daha sonra, pcr ürününü üretici protokolüne göre bir jel çıkarma kiti ile arındırın ve saflaştırılmış DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.

Sonra arındırılmış DNA'yı eksi 20 santigrat derecede TE tamponunda saklayın. 2 adımlı bir PCR ile site yönelimli mutagenez başlamak için, ilk vahşi tip DNA şablonu kullanın, sonra astar çiftleri iki, bir ve iki, beş astar mutasyonları için, ya da astar çiftleri iki, iki, ve iki, üç üç astar mutasyonlar PCR ürün iki elde etmek için. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün.

Daha sonra yabani tip DNA şablonu ve PCR ürün iki astar olarak, birlikte astar iki, üç beş priment mutasyon, ya da astar iki, üç priment mutasyon için bir, PCR ürün üç elde etmek için kullanın. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün. Sonra arındırılmış DNA'yı TE tamponunda eksi 20 derecede saklayın.

3 adımlı bir PCR ile site ye doğrudan mutagenezi başlatmak için, ilk olarak yabani tip DNA şablonu ve üç, bir ve üç, iki çift PCR ürün iki elde etmek için astar çiftleri kullanın. PCR ürün üç elde etmek için vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri üç, üç ve üç, dört kullanın. PCR ürün üç elde etmek için vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri üç, üç ve üç, dört, kullanın.

PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün. Son olarak PCR ürün dört elde etmek için, üç, bir ve üç, dört astar çiftleri ile birlikte şablon olarak PCR ürünleri iki ila beş nanogram kullanın. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün.

Saflaştırılmış DNA'yı EKSI 20 santigrat derecede TE tamponunda saklayın. Bu çalışmada, CSGD'nin transkripsiyonel düzenlemesi ile ilgili RNA etkileşimlerini araştırmak için 2 adımlı ve 3 aşamalı site yönelimli mutagenez kullanılmıştır. Yabani tip CsgD PCR ürün IA verim pcr amplifiye edildi, ve vahşi tip mcaS PCR ürün IB verim pcr amplifiye edildi. 3 adımlı PCR stratejisi kullanılarak, PCR ürünleri IIA ve IIIA ilk iki adımda sentezlendi ve CsgD'de mutasyonları tanıtmak için üçüncü adımda IVA sentezlendi.

Benzer şekilde, mcaS'de pcr, IIIB, ilk iki adımda ve IVB'yi üçüncü adımda teslim etmek için ücretsiz site yönelimli mutasyonlar ortaya konmuşve bu mutasyonlar ortaya konmuşoldu. Batı leke analizi, yabani tip mcaS'nin ekspresyonu yabani tip CSGD'nin çevrilmesini engellerken, mcaS veya CsgD'deki mutasyonların gözlenen baskıyı hafifletdiğini göstermiştir. Ancak hem CsgD hem de mcaS'deki mutasyonlar CsgD'nin çevrilmesini engeller.

2 adımlık BIR PCR stratejisi kullanılarak, PCR ürünleri IIC, IID, IIE, IIF ve IIG, ilk adımda sentezlendi ve PCR ürünleri IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG, tüm CsgD DNA mutasyonları tanıtmak için ikinci adımda sentezlendi. PCR ürünleri IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG kullanılarak sentezlenen in vitro transkripsiyonu CsgD yabani tipi ve mutant RNA'lara bağlanan HFQ'nun EMSA sonuçları mutant alellerin KD değerlerinin arttığını göstermiştir. Bu, HFQ'nin mutantlara daha az verimli bir şekilde bağlanabileceğini kanıtladı.

Ayrıca HFQ'da CsgD'de yabani tip RNA için gözlenen üç vardiya ile gösterilen birkaç bağlama alanı vardır. Ancak, farklı mutant RNA'lar için sadece iki bağlama alanı gözlenmektedir. Bu nedenle, siteye yönelik mutasyonel yaklaşım, HFQ'nun tam bağlanması için önemli olan CsgD mRNA'nın primer ve veya sekonder yapılarını tanımlar.

Burada açıklanan site yönelimli mutagenez yöntemi PCR'ye dayanır. İyi PCR uygulamaları yöntem için çok önemlidir ve başarılı olmak için optimizasyon gerektirebilir. Site yönelimli mutagenez sadece emsa ve Batı Blotting gibi üç yöntem ile güçlüdür.

Diğer yöntemler, örneğin, çeşitli yapısal tahliller ve bazı etkinlik testleri ve çeviri sonrası değişiklik çalışmaları içerir.