Name: Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, site-yönelimli mutagenez yöntemiyle DNA'ya spesifik mutasyonlar eklemeyi ve RNA-protein etkileşimlerini incelemeyi. Bu PCR tabanlı protokol, moleküler biyoloji araştırmalarında genetik varyasyonları kolayca oluşturmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Güney Danimarka Üniversitesi açık erişim ilkesi hibe teşekkür etmek istiyorum.

1. vektör seçimi
<ol><li>Bir vektör ile aşağı akım deneyler gerçekleştirmek için seçin. Herhangi bir vektör bu 2 ve 3 adım PCR yöntemi için geçerlidir.</li>
	<li>Vektör seçim üzerinde bağlı olarak, uygun enzimleri klonlama için seçin.</li>
</ol>2. astar tasarım site mutagenesis yönetmen
<ol><li>Her iki 2-adım veya 3 adımlı PCR strateji arasında karar (2-adımdır sadece mutasyonlar için < 200 faiz DNA'ın iki ucundan kan basıncı). 2-adım PCR adım 2.2 gidin ve 3 adımlı PCR için adım 2.3'e gidin.</li>
	<li>2-adım PCR tasarım astar.<ol>
<li>Astar 1 ve ilgi ve ile 5' DNA yükseltmek için 3 çıkıntı tasarım ilgili kısıtlama tanıma site seçilen vektör clone için gerekli ardından 4 nükleotit (örneğin, ATAT veya AGCT) içerir.</li>
		<li>İlk 2 mutation(s), istenen site veya siteleri tanıtmak ve mutasyon ile 10-15 tamamlayıcı nükleotit her iki kanattan için tasarım. Astar mutasyon 5' sonunda kullanılırsa ters yapmak ya da mutasyon 3' sonunda kullanılırsa ileri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-adım PCR tasarım astar.<ol>
<li>Astar 1 ve 4 DNA ilgi ve ile 5' yükseltmek için bu çıkıntı tasarım ilgili kısıtlama tanıma site seçilen vektör clone için gerekli ardından 4 nükleotit (örneğin, ATAT veya AGCT) içerir.</li>
		<li>Astar 2 ve 3 mutation(s) istenen site (ler), tanıtmak ve mutasyon tarafından 10-15 tamamlayıcı nükleotit her iki kanattan tasarlayın. Astar 2 ve 3 tamamlayıcı ters vardır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR vahşi klonlama için tipi DNA amplifikasyon
Not:6PCR hakkında ayrıntılar için bkz.
<ol><li>PCR6 1 + 2 (2-adım PCR) veya 1 + 4 (3-adım PCR) primerler kullanılarak gerçekleştirmek ve vahşi türü DNA PCR ürünü ı. kullanım Tablo 1' deki PCR programını edinmek için şablon olarak kullanmak.</li>
	<li>PCR özel jel elektroforez tarafından doğrulayın.<ol>
<li>Bir özel çözüm (% 2) jel özel 100 mL 1 x Tris-asetat-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (TAE) arabelleği başına 2 g ekleyerek getirin. Özel bir mikrodalga fırında kaynatılarak geçiyoruz. DNA boyama boya etidyum bromür ekleyin (son bir konsantrasyon için ~ 0,5 µg/mL) için özel görüntüleme için çözüm jel.</li>
		<li>Özel jel döküm, bir elektroforez birimine yerleştirin ve PCR örnekleri (DNA yükleme boya ile karışık) ve bilinen boyutu DNA merdivenden yüklemek. Bantlar yeterince ayrılır ve bantları bir ultraviyole (UV) tablo ya da bir jel görüntüleme sistemi ile görselleştirmek kadar örnekleri 75 45 dk veya W çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve saf DNA konsantrasyonu spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.</li>
	<li>-20 ° c (arabellekte Tris-EDTA (TE)-uzun vadeli depolama) veya 4 ° C'de (dH2O – kısa süreli depolama) saf DNA kullanılmış içinde adım 5 kadar saklayın.</li>
</ol>4. site yönettiği mutasyonlar DNA'yı tanıtmak için PCR
<ol><li>PCR 2-adım PCR (bkz. Adım 4.2 3 adımlı PCR için)<ol>
<li>Mutasyonlar 5' uç veya Eğer mutasyon 3' 2 + 3 sonlandırmak ve vahşi türü DNA PCR ürünü II elde etmek için bir şablon olarak kullanmak astar 1 + 2 kullanarak PCR6 gerçekleştirmek (bkz. Tablo 1 için PCR program).</li>
		<li>Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.</li>
		<li>PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve saf DNA konsantrasyonu spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.</li>
		<li>Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) kullanılmış içinde adım 5 kadar saf.</li>
		<li>Eğer mutasyonlar 5' ucuna veya astar mutasyonlar sonunda 3' iseniz ve vahşi türü DNA PCR ürünü III almak için şablon olarak 1 PCR ürünü II astar astar 3 birlikte olarak kullanarak PCR6 gerçekleştirmek (bkz. Tablo 1 PCR program için).</li>
		<li>Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.</li>
		<li>PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve konsantrasyon saf DNA'ın bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.</li>
		<li>Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) 5 adım kadar saf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 3 adımlı PCR<ol>
<li>Astar 1 + 2 ve 3 + 4 ayrı tepkileri kullanarak PCR6 gerçekleştirmek ve vahşi türü DNA PCR ürünü elde etmek için şablon olarak kullanın (bkz. Tablo 1 için PCR program) II ve III.</li>
		<li>Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.</li>
		<li>PCR ürünleri bir jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve saf DNA konsantrasyonu spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.</li>
		<li>Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) saf.</li>
		<li>1 + 4 primerler kullanılarak PCR6 gerçekleştirmek ve PCR ürünü IV elde etmek için 2-5 ng her iki PCR ürünlerinin II ve III (kategorisinde de aynı tepkiyi) şablon olarak kullanın (bkz. Tablo 1 için PCR program).</li>
		<li>Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın. Not: Birkaç yanlış bantları (bazen daha az şablonu kullanılarak azaltılabilir) almak anormal değildir. Ancak, Eğer doğru boy band varlığına ve jel çıkarılan yanlış PCR ürünleri sayılabilir.</li>
		<li>Doğruysa, PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve konsantrasyon saf DNA'ın bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.</li>
		<li>Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) 5 adım kadar saf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. vahşi türü ve DNA'sı mutasyona uğramış sürümleri seçilen vektör içine rekombinasyon
Not: aşağıdaki adımları ayrıntılı bilgi için bkz.7.
<ol><li>Özet saf PCR ürünleri ı ve III (üzerinden 2-adım PCR) ve/veya ilgili kısıtlama enzimler kullanarak IV (gelen 3 adımlı PCR).<ol>
<li>1 sindirim arabellek x 20 µL 1 µL PCR ürünü için 30-60 dk 37 ° C'de Özet 200 ng her Restriksiyon enzimi ile içinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel bir jel ekstraksiyon kiti (Tablo reçetesi) kullanarak çıkarma tarafından sindirilmiş PCR ürünü arındırmak, saf DNA'ın DNA toplama bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek ve stok-20 ° c (TE arabellekte) ya da 4 ° C'de (dH2 O) kadar adım 5.6 için kullanılır.</li>
	<li>İlgili enzimleri ile arıtılmış vektör sindirmek ve alkalen fosfataz ile vektör yeniden ligasyonu olaylar azaltmak için tedavi. PCR ürünleri alkalen fosfataz ile muamele yapmak.<ol>
<li>1 x 1 µL her Restriksiyon enzimi ve alkalen fosfataz, Özet 1000 ng vektörünün 30-60 dk 37 ° C'de 1 µL ile sindirim tampon 30 µL içinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Atık DNA (örneğin, kesilmemiş vektör ve boşaltma DNA) ayrı sindirilir vektöründen özel jel elektroforez adım 3.2.1 ve 3.2.2 olduğu gibi kullanarak.</li>
	<li>Jel bir jel ekstraksiyon kiti (Tablo reçetesi) kullanarak çıkarma tarafından sindirilmiş vektör arındırmak, DNA toplama saf DNA'ın bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek ve stok-20 ° c (TE arabellekte) ya da 4 ° C'de (dH2O) Adım 5.6 için kullanana kadar.</li>
	<li>Sindirilir PCR ürünleri sindirilmiş vektör Tablo 2' de belirtilen reaksiyonlar ile ligate.</li>
	<li>2 h veya 16 ° C'de gece için oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Alıcı zorlanma (örneğin, E. coli K12) tüp ligasyonu reaksiyonlar ile dönüşümü.<ol>
<li>Zorlanma OD600için büyümek = 0,3-0,5 ve transfer 1 mL kültür ligaz tepkiler olarak kadar 1,5 mL tüpler için.</li>
		<li>3.500 x g 5 min için de spin ve süpernatant atın.</li>
		<li>Dönüştürme arabelleği (0,1 g/mL Polietilen glikol 3350, %5 dimetil sülfat ve 20 mM MgCl2lysogeny suyu (LB): 10 mL) 200 μL hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Ve buz için 30 dk tüpler yer ligasyonu tepki ekleyin.</li>
		<li>Isı-şok 42 ° C'de 2 min için</li>
		<li>1 mL lb 1,5 mL tüpler ekleyin ve 37 ° C'de en az 45 dakika için antibiyotik direncinin fenotipik ifade sağlar</li>
		<li>Hücreleri 3.500 x g 5 min için de spin, 1 mL süpernatant atmak ve kalan süpernatant hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Hücreleri plakalar üzerinde uygun antibiyotiklerle plaka ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vektörel çizimler (örneğin, vektör ve Ekle özel primerler kullanılarak PCR ile) DNA ekleme başarılı entegrasyonu ile yataklık transformants tanımlayın.</li>
	<li>Sanger tarafından DNA dizisi doğrulamak sıralama. Dikkat: aynı astar için adım 5,9 kullanılan sıralama için kullanmayın.</li>
</ol>6. tüp bebek ve/veya içinde vivo deneyler için inşa vektörel çizimler kullanarak
<ol><li>İn vivo deney Not: Bu vahşi türü/mutasyona çoğu düzenleme karakterize etmek için RNA ifade etmek için bir vektör kullanmanın bir örneği olduğunu. Western Blot üzerinde daha fazla bilgi için bkz:8.<ol>
<li>E. coli K12 suşları inşa vektörel çizimler ile uygun ortamda büyümeye ve gerekirse ifade teşvik. Santrifüjü tarafından hasat örnekleri.</li>
		<li>Örnekleri Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) hücre topakları SDS örnek arabellek x 1 çözülerek hazırlamak (62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, % 2.5 SDS, %0,002 bromophenol mavi, %5 β-mercaptoethanol, % 10 gliserol) ve kaynatın 5 95 ° c Min. Not: Bir jel döküm veya piyasada bulunan prekast jel kullanımı mümkündür. İkinci sonuçları Şekil 3 ' te (Tablo reçetesi) sunulan kullanılmıştır.</li>
		<li>107 hücreleri her örneği ayrı Wells (protein merdivenle dahil) yükleyin ve proteinler (yaklaşık 45 dk) ayrılır kadar jel 200 V çalıştırın.</li>
		<li>Proteinler bir selüloz-zar 80, yarı kuru havalesiyle üzerine leke mA 1 h için.</li>
		<li>Membran proteinleri (örneğin, % 5-1 x Tween 20-Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TTBS) arabellekte çözünmüş Süttozu) karışımı ile engelleyin.</li>
		<li>Faiz (örneğin, GFP, bayrak veya HIS öğesini protein) protein hedef ve nazik ajitasyon ile 1 h için kuluçkaya (1 x TTBS arabellekte çözünmüş) birincil antikor ekleyin.</li>
		<li>Membran ilişkisiz antikorlar kaldırmak için 1 x TTBS içinde 10 dakika yıkayın. İki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Birincil antikorlar hedefleyen ikincil antikor (1 x TTBS arabellekte çözünmüş) ekleyin ve algılama için sağlar (örneğin, horseradish peroksidaz (HRP)-Birleşik ikincil antikorlar. Nazik ajitasyon ile 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Membran ilişkisiz antikorlar kaldırmak için 1 x TTBS içinde 10 dakika yıkayın. İki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>İkincil antikorlar ile uyumlu bir teknik ile membran (HRP Birleşik ikincil antikor kullandıysanız Örneğin, kuluçka sonra luminol kaynaklı bir Kemiluminesan ile düşsel tarafından) gözünün önüne getir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İn vitro deney Not: Bu vektör şablon olarak tüp bebek RNA transkripsiyonu için RNA-protein etkileşimleri karakterize kullanmanın bir örneği olduğunu. Emsan hakkında daha fazla bilgi için bkz:9.<ol>
<li>Tüp bebek tutanaklar bir T7 vitro transkripsiyon kiti (Malzemeler tablo) ve adım 5 vektörlerinden şablon olarak kullanarak olun.</li>
		<li>Tarafından sayfası RNA transkript jel denaturing % 4.5 7 M üre üzerinde ayrı ve RNA elektro elüsyon diyaliz tüpler (Tablo reçetesi) tarafından doğrudan jel ayıklayın.</li>
		<li>Etiket RNA (örneğin, γ -32ile P-ATP radiolabeling T4-polinükleotit kinaz (Tablo reçetesi) kullanarak ve tekrar içeren sütunlar (Tablo reçetesi) arındırmak. Dikkat: radyoaktif madde ile çalışmaya başlamadan önce yerel radyasyon emniyet amiri ile başvurun.</li>
		<li>Etiketli-RNA bağlama arabellek (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)) x 1 ayrı reaksiyonlarda protein konsantrasyonları artan ile karıştırın. Not: sonuçlarında sunulan (Şekil 4), 2 nM radiolabeled csgD mRNA bir gradyan 0-2 µM Hfq protein (monomer konsantrasyon) ile karışık oldu.</li>
		<li>Protein ve RNA bir sigara denaturing polyacrylamide jel hibridizasyon mix yüklemeden önce melezlemek ve 1,5 saat için jel 200 V'de çalıştırmak için izin verir.</li>
		<li>6.1.3 adımından etiketleme ile uyumlu bir teknik ile jel görselleştirin. (radiolabeling uygulandıysa Örneğin, phosphoimaging tarafından).</li>
		<li>Bir görüntü işleme programı ötelenen bantları göreli yoğunluğunu ölçmek ve uygun bir eğri (sigmoidal) için bir grafik kullanarak veri ve veri analiz yazılımı (Malzemeler tablo). Monte eğri dayalı, ayrılma sabit (Kd) değerleri otomatik olarak yazılım ile belirlenebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.

Site yönettiği mutagenesis farklı uygulamaları geniş bir dizi var ve burada, bir içinde vivo ve tüp bebek deney temsilcisi sonuçlarından nasıl biyolojik sonuçlar yöntemi kullanarak yapmak için örnek olarak dahil edildi. Site yönettiği mutagenesis uzun süre RNA etkileşim çalışmaları için altın standart olmuştur. Aşağı akım deneyleri ve deneyler gen ürünlerinde fonksiyonları içinde belirli DNA siteleri ve onların önemi hakkında sonuçlara (örneğin, Batı leke veya Emsan) ile ilgili mutasyonlar tanıtımı ile birlikte teknik gü...

Tüm yapılar hücrenin DNA'sının sırayla kodlanır ettiği DNA kez için bir yaşam hücre planı denir. Doğru çoğaltma ve DNA tamir mekanizmaları mutasyonların sadece çok düşük oranları, doğru kodlanmış genler fonksiyonların sürdürülmesi için gerekli olduğu ortaya emin olun. Değişiklikleri DNA dizisinin farklı düzeylerde DNA'sını (transkripsiyon faktörleri ve enzimleri tarafından tanınması), sonra RNA (ikincil yapı değişiklik ve baz çifti tamamlayıcılık) ve/veya protein (amino başlayarak birbirini izleyen işlevleri etkileyebilir asit oyuncu değişikliği, silme, ekleme veya çerçeve-vardiya). Birçok mutasyonlar gen işlevini önemli ölçüde etkilemez ise bazı mutasyonlar DNA büyük etkileri olabilir. Böylece, mutagenesis site yönettiği belirli DNA siteleri her düzeyde önemi eğitim için değerli bir araçtır.
Bu iletişim kuralı belirli mutasyonlar tanıtmak için kullanılan bir hedeflenen mutagenesis yaklaşımı açıklar. Protokol iki farklı PCR stratejileri üzerinde dayanır: 2 adım veya 3 adımlı PCR. 2-adım PCR istenen mutasyon 5' uç ya da ilgi DNA 3' sonu yakın ise geçerlidir (< 200 baz çifti (bp) sonundan itibaren) ve 3-adım PCR tüm durumlarda geçerlidir.
2-adım PCR yaklaşımda, 3 astar tasarlanmıştır, hangi bir astar kümesi DNA'sı (astar 1 ve 3, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve tek bir astar mutasyon birleştirmek için tasarlanmıştır. Mutasyon 5' ucu ve ileriye doğru bir yönelim yakın ise mutasyon 3' ucu yakın ise astar (astar 2) tanıtımı mutasyon geriye doğru bir yönelim olmalı. İlk PCR adımda astar 1 + 2 ya da 2 + 3 5' uç veya 3' ucu yakın küçük bir parça sırasıyla güçlendirir. Elde edilen PCR ürünü sonra iki adımda bir astar astar 1 veya 3, böylece bir PCR ürünü faiz (Şekil 1A) DNA'daki bir mutasyon ile sonuçlanan ile kullanılır.
3-adım PCR 4 astar tasarlanmış, astar kümesi DNA'sı (astar 1 ve 4, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve astar bir dizi belirli mutasyonlar tamamlayıcılık örtüşen ile birleştirmek için tasarlanmıştır (astar 2 ve 3, geri ve ileri, sırasıyla). Bir ve iki adımda, astar 1 + 2 ve 3 + 4 5' ve 3' son yükseltmek. Üç adımda elde edilen PCR urun adım bir ve iki şablon olarak kullanılır ve astar 1 + 4 ile güçlendirilmiş. Böylece, elde edilen PCR ürünü istediğiniz mutasyon (Şekil 1B) ile ilgi DNA'sı.
Mutasyona uğramış DNA-ebilmek var olmak kullanılmış için aşağı akım herhangi bir uygulama iken, bu iletişim kuralını DNA klonlama vektör yeniden birleştirmek açıklar. Vektörel çizimler klonlama kullanım kolaylığı klonlama gibi çeşitli avantajları vardır ve özelliklere bağlı olarak belirli deneysel uygulamalar Yöneyin. Bu özellik genellikle RNA etkileşimi çalışmalar için kullanılır. Başka bir RNA etkileşim çalışmaları için karmaşık başka bir RNA1,2 veya protein3,ile4RNA'ın yapısal sondalama tekniğidir. Mutagenesis site yönettiği ve sonraki klonlama için etkileşim çalışmaları içinde vivo izin ise ancak, yapısal sondalama sadece tüp bebek gerçekleştirilir.
Site yönettiği mutagenesis yoğun olarak burada sunulan RNA etkileşim çalışmaları için kullanılmıştır. Ancak, anahtar yöntemi ile ilgili 2 - veya 3-adım PCR DNA herhangi bir parça için geçerlidir ve böylece sadece RNA-etkileşim çalışmaları için sınırlı.
Teknik ve olası kullanımları örneklemek için bölgeler için mRNA, csgD, Escherichia coli (e.coli) çoğu düzenleme önemli karakterizasyonu kullanılır. E. coli, csgD içinde küçük kodlamayan RNA tarafından McaS, protein, protein-ifade CsgD2,4,5bastırmak için Hfq, ile işbirliği içinde hedeflenmektedir. Teknik mutasyonlar McaS arasındaki csgD Bankası eşleştirme bölge ve csgDHfq bağlama site tanıtmak için kullanılır. Elde edilen DNA sonra sonraki deneyler için uygun bir vektör içine klonlanmış. Tekniğin aşağı akım uygulamalar içinde vivo, tüp bebek deneyleri içerir. İçin örnek, örnek 1 içinde vivo bir western blot yöntemi kullanarak karakterizedir ve örnek 2 tüp bebek bir elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) kullanarak karakterizedir. Her iki durumda da, o resimli nasıl site yönettiği mutagenesis birlikte diğer teknikleri ile ilgi bir gen hakkında biyolojik sonuçlar yapmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr>Tavşan <td>Merck</td><td>G6532'de</td> <td>üretilen anti-GroEL antikoru</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Jel görüntüleme iş istasyonu</td></tr><tr><td>Özel DNA oligo</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>Nükleik asit ölçümleri için</td><td>DeNovix</td><td>NA</td> Spektrofotometre</tr><tr><td>DNA Jel Yükleme Boyası (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür çözeltisi %1</td> <td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Merdiven Karışımı</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex tüp Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Elektro elüsyon için diyaliz tüpleri</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Hücre GT Hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Yatay elektroforez sistemi</td></tr><tr><td>Fare Merck</td><td>F3165'te</td><td>üretilen monoklonal ANTI-FLAG M2 antikoru</td> Birincil <td>antikor</td></tr><tr><td>Fare İmmünoglobulinleri</td><td>Dako Sitomasyonu</td><td>P0447</td><td>HRP konjuge ikincil antikor</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>RNA saflaştırması</td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Protein ayırma için Bis-Tris jelleri</td></tr><tr><td>Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>DNA polimeraz</td></tr><tr><td>PowerPac HC Yüksek Akım Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan İmmünoglobulinleri</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP konjuge ikincil antikor</td></tr><tr><td>SeaKem LE</td><td>Agarose Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Grafik ve veri analizi yazılım aracı</td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>PCR makinesi</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligaz</td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>TAE Tampon (Tris-asetat-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

site yönettiği mutagenesis in vitro ve escherichia coli etkileşimlerde rna ile örneği vivo deneyler için

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site yönettiği mutagenesis küçük kodlamayan ribonükleik asit (sRNA) molekülleri ve hedef haberci RNA (mRNA) arasındaki etkileşimi araştırmak için DNA belirli mutasyonların tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, site yönettiği mutagenesis belirli protein bağlayıcı siteleri için RNA eşlemek için kullanılır. 2-adım ve 3-adım dayalı PCR giriş mutasyonların açıklanmıştır. Tüm protein-RNA ve RNA, RNA-RNA etkileşim çalışmaları ile ilgili bir yaklaşımdır. Kısacası, teknik astar istenen mutation(s) ile 2 veya 3 adımda bir PCR ürünü mutasyon ile sentezleme PCR aracılığıyla tasarlama üzerinde dayanır. PCR ürünü daha sonra klonlama için kullanılır. Burada, nasıl site yönettiği mutagenesis mutasyonlar sRNA, McaS ve mRNA, RNA, RNA-RNA ve RNA-protein etkileşimleri araştırmak için csgD, tanıtmak için her iki 2 ve 3 adım yaklaşım ile gerçekleştirileceğini açıklar. RNA etkileşimleri araştırmak için bu tekniği uygulamak; Ancak, tüm mutagenesis çalışmaları (örneğin, DNA-protein etkileşimleri, amino asit ekleme/değiştirme/silme) için uygun bir tekniktir. Mutasyon doğal olmayan üsler dışında herhangi bir tür tanıtmak mümkün ama tekniği yalnızca PCR ürünü aşağı akım uygulama (örneğin, klonlama ve daha fazla PCR için şablon) için kullanılması durumunda geçerlidir.

RNA etkileşimleri ile ilgili çoğu, düzenleme, csgD, bir çift vektör Kurulum seçildi araştırmak için: bir csgD ifade etmek için mRNA ve başka bir küçük kodlamayan RNA McaS ifade etmek için. csgD bir arabinoz indüklenebilir orta-kopya plazmid kloramfenikol direnci ile olan pBAD33 içine klonlanmış ve McaS izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüklenebilir düşük kopya plazmid olan mini R1 pNDM220, klonlanmış ile ampisilin direnç. Vahşi türü csgD ya...

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site yönelimli mutagenez, RNA-RNA ve RNA protein etkileşimleri gibi moleküler etkileşimleri incelemek için yararlıdır. Bu protokol, iki veya 3 adımlı PCR yaklaşımıyla site yönelimli mutagenezinnasıl gerçekleştirilini açıklar. Yöntemin temel avantajları, dahil edilebilen farklı mutasyonların çeşitliliğinin yanı sıra göreceli bir kolaylık ve bunun maliyetidir.Başlamak için, 2 adımiçin özel iki, bir ve iki, üç veya üç, üç, dört astar çiftleri, PCR ürün bir elde etmek için 3 adımpcr için özel vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri kullanın. Agarose jel elektroforez ile PCR ürünleri doğrulamak için, bir mikrodalga fırın kullanarak, 1X TAE tampon 100 mililitre agarose iki gram eriterek% 2 agarose jel olun. Mililitre başına 0,5 mikrogram son konsantrasyonda ethidyum bromür ekleyin.Sonra agarose jel döküm. Katılaştırıldığında, bir elektroforez ünitesine yerleştirin. Bilinen boyutta bir DNA merdiveni yükleyin ve DNA yükleme boyası ile karıştırılmış PCR örnekleri kuyulara.Örnekleri 75 voltta 45 dakika çalıştırın. Uv transilluminator'da veya jel görüntüleme sistemiyle bantları görselleştirin. Daha sonra, pcr ürününü üretici protokolüne göre bir jel çıkarma kiti ile arındırın ve saflaştırılmış DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.Sonra arındırılmış DNA'yı eksi 20 santigrat derecede TE tamponunda saklayın. 2 adımlı bir PCR ile site yönelimli mutagenez başlamak için, ilk vahşi tip DNA şablonu kullanın, sonra astar çiftleri iki, bir ve iki, beş astar mutasyonları için, ya da astar çiftleri iki, iki, ve iki, üç üç astar mutasyonlar PCR ürün iki elde etmek için. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün.Daha sonra yabani tip DNA şablonu ve PCR ürün iki astar olarak, birlikte astar iki, üç beş priment mutasyon, ya da astar iki, üç priment mutasyon için bir, PCR ürün üç elde etmek için kullanın. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün. Sonra arındırılmış DNA'yı TE tamponunda eksi 20 derecede saklayın.3 adımlı bir PCR ile site ye doğrudan mutagenezi başlatmak için, ilk olarak yabani tip DNA şablonu ve üç, bir ve üç, iki çift PCR ürün iki elde etmek için astar çiftleri kullanın. PCR ürün üç elde etmek için vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri üç, üç ve üç, dört kullanın. PCR ürün üç elde etmek için vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri üç, üç ve üç, dört, kullanın.PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün. Son olarak PCR ürün dört elde etmek için, üç, bir ve üç, dört astar çiftleri ile birlikte şablon olarak PCR ürünleri iki ila beş nanogram kullanın. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün.Saflaştırılmış DNA'yı EKSI 20 santigrat derecede TE tamponunda saklayın. Bu çalışmada, CSGD'nin transkripsiyonel düzenlemesi ile ilgili RNA etkileşimlerini araştırmak için 2 adımlı ve 3 aşamalı site yönelimli mutagenez kullanılmıştır. Yabani tip CsgD PCR ürün IA verim pcr amplifiye edildi, ve vahşi tip mcaS PCR ürün IB verim pcr amplifiye edildi. 3 adımlı PCR stratejisi kullanılarak, PCR ürünleri IIA ve IIIA ilk iki adımda sentezlendi ve CsgD'de mutasyonları tanıtmak için üçüncü adımda IVA sentezlendi.Benzer şekilde, mcaS'de pcr, IIIB, ilk iki adımda ve IVB'yi üçüncü adımda teslim etmek için ücretsiz site yönelimli mutasyonlar ortaya konmuşve bu mutasyonlar ortaya konmuşoldu. Batı leke analizi, yabani tip mcaS'nin ekspresyonu yabani tip CSGD'nin çevrilmesini engellerken, mcaS veya CsgD'deki mutasyonların gözlenen baskıyı hafifletdiğini göstermiştir. Ancak hem CsgD hem de mcaS'deki mutasyonlar CsgD'nin çevrilmesini engeller.2 adımlık BIR PCR stratejisi kullanılarak, PCR ürünleri IIC, IID, IIE, IIF ve IIG, ilk adımda sentezlendi ve PCR ürünleri IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG, tüm CsgD DNA mutasyonları tanıtmak için ikinci adımda sentezlendi. PCR ürünleri IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG kullanılarak sentezlenen in vitro transkripsiyonu CsgD yabani tipi ve mutant RNA'lara bağlanan HFQ'nun EMSA sonuçları mutant alellerin KD değerlerinin arttığını göstermiştir. Bu, HFQ'nin mutantlara daha az verimli bir şekilde bağlanabileceğini kanıtladı.Ayrıca HFQ'da CsgD'de yabani tip RNA için gözlenen üç vardiya ile gösterilen birkaç bağlama alanı vardır. Ancak, farklı mutant RNA'lar için sadece iki bağlama alanı gözlenmektedir. Bu nedenle, siteye yönelik mutasyonel yaklaşım, HFQ'nun tam bağlanması için önemli olan CsgD mRNA'nın primer ve veya sekonder yapılarını tanımlar.Burada açıklanan site yönelimli mutagenez yöntemi PCR'ye dayanır. İyi PCR uygulamaları yöntem için çok önemlidir ve başarılı olmak için optimizasyon gerektirebilir. Site yönelimli mutagenez sadece emsa ve Batı Blotting gibi üç yöntem ile güçlüdür.Diğer yöntemler, örneğin, çeşitli yapısal tahliller ve bazı etkinlik testleri ve çeviri sonrası değişiklik çalışmaları içerir.

site-directed-mutagenesis-for-vitro-vivo-experiments-exemplified-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Bu makalenin amacı, RING tipi E3 ubikitin ligaseskapsamlı biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar için bir anahat sunmaktır. Ayrıntılı protokollere sahip bu çok aşamalı boru hattı, test edilen proteinin enzimatik aktivitesini doğrular ve aktivitenin işlevine nasıl bağdaştırılabildiğini gösterir.

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Öğrenin, site-yönelimli mutagenez yöntemiyle DNA'ya spesifik mutasyonlar eklemeyi ve RNA-protein etkileşimlerini incelemeyi. Bu PCR tabanlı protokol, moleküler biyoloji araştırmalarında genetik varyasyonları kolayca oluşturmanızı sağlar.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Daha fazla video keşfet