Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma
18 Ocak 2019
Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.
Bu protokol, araştırmacıların özel ekipman, pahalı reaktifler veya karmaşık teknikler kullanmadan bir hücrenin farklı fraksiyonlarını elde etmenizi sağlar. Bu protokolün en önemli avantajı, onu değiştirilebilir ve kolay bir şekilde gerçekleştiren tekniklerin basitliğidir. Prosedürü gösteren Matt Deragon, Rob Haluska ve Alexa Hodges.Benim laboratuvar üç lisansüstü öğrencileri olacaktır. Bir pelet oluşturmak için hazırlanan hücre süspansiyon santrifüj başlamak için. Supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında PBS pelet yeniden askıya. Hücre süspansiyonunu 400 xg'de 10 dakika santrifüj edin. Sonra supernatant çıkarın ve buz gibi tampon hücre pelet yeniden askıya. Arabellek Metin protokolüne göre bir çözüm hazırlayın. On dakika boyunca 400 xg hücre süspansiyon santrifüj ve supernatant çıkarın. Tamponpelet yeniden ml başına 200 milyon hücre nin son konsantrasyonuna bir çözüm askıya, ve pipet yavaşça herhangi bir kümeleri kırmak için. Bu kuluçkadan sonra hücre süspansiyonu 4'te son rotator üzerinde bir uçta
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yüksek hızlı santrifüj gerektirmeden U937 hücrelerinin plazma membranı, sitoplazma ve mitokondrilerinin izole edilmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, immunoblotting yoluyla protein lokalizasyon çalışmaları için sübhücresel fraksiyonların saflaştırılmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Biyokimya
- Nörobilim
Arka Plan
- U937 hücreleri, insan monosit fonksiyonlarının incelenmesi için kullanılan bir modeldir.
- Hücre altı bileşenlerin izolasyonu, hücresel süreçlerin anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler genellikle hücrelere zarar verebilen yüksek hızlı santrifüj işlemlerini içerir.
- Bu protokol, hücre altı fraksiyonlama için daha yumuşak bir alternatif sunmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Yüksek hızlı santrifüj kullanmadan hücre bileşenlerini izole etmek için bir protokol geliştirmek.
- Protein lokalizasyonunun müteakip analizine olanak sağlamak.
- U937 hücrelerindeki hücresel mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Plazma membranının, sitoplazmanın ve mitokondrilerin izolasyonu.
- Hücre fraksiyonlamasını kolaylaştırmak için spesifik reaktiflerin kullanımı.
- Protein lokalizasyon analizi için immunobloting.
- Sonuçların geleneksel yöntemlerle karşılaştırılması.
Ana Sonuçlar
- Yüksek hızlı santrifüj gerektirmeden subcellular fraksiyonların başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- İmmünoblottleme yoluyla protein lokalizasyonunun net bir şekilde görselleştirilmesi.
- Yeni protokolün etkinliğinin ve nazik yönteminin kanıtlanması.
- Hücre biyolojisi araştırmalarında daha geniş uygulama potansiyeli.
Sonuçlar
- Yeni protokol, U937 hücre bileşenlerinin izole edilmesi için etkilidir.
- Geleneksel yöntemlere uygulanabilir bir alternatif sunmaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar, çeşitli hücresel analizler için bu tekniği kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, yüksek hızlı santrifüj gerektirmeden U937 hücrelerinin maliyet etkin alt hücresel fraksiyonlamasını sağlayarak, erken keşif aşamasındaki hedef doğrulama ve mekanizmanın riskten arındırılması süreçlerini destekler. Erişilebilir reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak sitoplazma, mitokondri ve plazma membranı fraksiyonlarının izole edilmesi, yolakların netleştirilmesi ve assay geliştirme için kritik olan protein lokalizasyon çalışmalarını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, özel altyapı bağımlılığını azaltarak preklinik hedef değerlendirme iş akışlarında ölçeklenebilirliği ve tekrarlanabilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İmmünoloji ve inflamasyonla ilgili bir insan monosit modelinde, hücre altı protein lokalizasyonu aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Ultrasantrifüjasyona göre daha nazik bir alternatif sunarak, fonksiyonel hedef değerlendirmesi için protein bütünlüğünü ve kompleks oluşumunu korur.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilgili hücrelerde yolak katılımını ve kompartman spesifik sinyallemeyi netleştirerek mekanistik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Hedef etkileşimini veya modülasyonunu değerlendirmek için immunoblotting tabanlı analizlere uygun, saflaştırılmış hücre altı fraksiyonlar oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arasında tutarlı fraksiyonlaşma sağlamak için standartlaştırılmış tampon koşulları ve diferansiyel santrifügasyon basamakları kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Protokol, orta ölçekli tarama hazırlıklarını destekleyecek şekilde farklı hücre sayılarına uyarlanabilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: U937 hücreleri, insan monosit fonksiyonunu modelleyerek inflamatuar ve enfeksiyöz hastalık bağlamlarında translasyonel biyobelirteç araştırmalarına olanak tanır.
- Preklinik Süreklilik: İzole edilen fraksiyonlar, in vivo çalışmalar öncesinde hedef lokalizasyonunun ve etki mekanizmasının downstream validasyonunu destekler.
- Riski Azaltılmış İlerleme: Subselüler erişilebilirliği ve etkileşim potansiyelini doğrulayarak hedeflerin erken aşamada riskten arındırılmasını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, biyokimyasal fraksiyona yoluyla hedef doğrulamayı destekleyerek, analiz geliştirme ve preklinik değerlendirme aşamalarına geçmeden önceki erken keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: U937 hücrelerinde hedef lokalizasyonunu ve yolak katılımını netleştirmek için subselüler fraksiyona aracılığıyla hipotez testine olanak tanır.
- Tarama: Güvenilir immunoblotting tabanlı hedef doğrulama analizleri için standartlaştırılmış sitoplazmik, mitokondriyal ve membran fraksiyonları üretir.
- Analitik: Immunoblotting yoluyla kantitatif protein lokalizasyon verileri oluşturarak, hedef dağılımının farklı koşullar arasında karşılaştırılmasına imkan sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Bir insan monosit modelinin hastalıkla ilişkili subselüler kompartmanlarında hedef varlığını doğrulayarak biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İmmünoloji ve inflamasyon araştırmalarında birden fazla hedef ve projeye uygulanabilen, yeniden kullanılabilir ve düşük maliyetli bir fraksiyonasyon kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doğrudan hücre altı lokalizasyon kanıtları aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Ultrasantrifüjasyon ihtiyacını ortadan kaldırarak ekipman maliyetlerini düşürür ve araştırma merkezleri arasındaki erişilebilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Hedef erişilebilirliği ve kompartmanizasyon hakkında erken ve güvenilir veriler sağlayarak, devam/durdur (go/no-go) karar verme verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: Fizyolojik olarak ilgili bir insan hücresi modelinde doğrulanmış hücre altı lokalizasyona dayalı, riskten arındırılmış hedef önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, hücre altı fraksiyonlama ve immunoblotting tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Soğutmalı santrifüjlere, rotatörlere ve digitonin ile hipotonik tamponlar gibi standart laboratuvar reaktiflerine erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar arasında tekrarlanabilir fraksiyonlama sağlamak için hücre yoğunluğunun, inkübasyon sürelerinin ve lizis koşullarının standartlaştırılması gerekir.
- Diğer hücre tiplerine adaptasyon, lizis tamponu kompozisyonunun ve santrifüjleme parametrelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında organellerin potansiyel olarak tam ayrılamaması ile hücre sağlığına ve pasaj sayısına bağlı verim değişkenliği yer alır.
