Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama
22 Mart 2019
Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.
X-Ray kristalografisi, proteinlerden elde edilen 3 Boyutlu yapısal bilgileri belirlemek için baskın bir tekniktir. Senkrotron ışını hatları proteinlerin ürettiği küçük, zayıf difüzif kristallerden veri elde etmek için gereklidir. Devasa olan benzersiz bir ışın hattıdır çünkü biyolojik makromoleküllerden veri toplama işlemini tam olarak otomatleştirir.
Örnek montaj, konum ve son veri toplama. Araştırmacıların ışın hattında veri toplamak yerine laboratuvarda zaman geçirmelerine olanak sağladığı için bu tür tam otomasyon çok önemlidir. Işın hattı da akıllı ve ortalama olarak, ışın hattı insanlar tarafından işletilen zaman daha iyi veri toplayabilir.
Bu protokolü başlatmak için, kristal montaj gerçekleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi Massive one üzerinde ışın süresi isteyin. Protein kristalografi ışın çizgileri veya ISPyB web sitesi için bilgi sistemine gidin. MX denemelerini seçin, deneme numarası ve parolayla giriş yapın.
Sevkiyata tıklayın, yeni ekleyin ve gerekli bilgileri sağlayın. Ardından kaydet'i tıklatın. Paket ekle'yi tıklatın ve istenen bilgileri doldurun.
Kaydet'i tıklatın, ardından kapsayıcı ekle'yi tıklatın. Disk barkod adını verin ve omurga diski seçin, tekrar kaydet'i tıklatın. Kapsayıcı sembolüne tıklayın ve edit ve diskte protein adı, tercih edilen iş akışı ve kristal konumu gibi örneklerle ilgili gerekli bilgileri doldurun.
ESRF güvenlik grubu tarafından onaylanan proteini seçin. Her bir örneği tanımlamak için benzersiz bir örnek adı girin. İsteğe bağlı olarak, pin barkod tazyik.
İçerecek bilgilerin geri kalanı da isteğe bağlıdır. Her bir örnek için deneme türünü girin. Bu, her kristali işlemek için hangi otomatik iş akışının kullanılacağını tanımlar.
GCSH kristallerinin iğne olduğu göz önüne alındığında, MX tuşuna basın P.Next'i seçin, bir uzay grubuna girin. Varsa, bu veri toplama stratejisi hesaplamaları için kullanılacak ve kullanılabilir otomatik veri işleme boru hatları tarafından. İstenilen çözünürlüğü girin.
Bu, kristalden dedektöre ilk kafes taramalarından, karakterizasyondan ve varsayılan veri toplamadan uzaklığı tanımlar. Şimdi, bu sınıra difüzif olmayan kristallerden tam veri kümelerinin toplanmasını önlemek için istenen eşik çözünürlüğünü ayarlayın. Bu, veri depolama alanından tasarruf sağlayabilir ve zamanı analiz eder.
Gerekli bütünlüğü ayarlayın. Sonra gerekli çokluğu ayarlayın. Örnek desteğinde birden fazla kristal bulunursa, analiz edilecek maksimum kristal sayısını ayarlayın.
Varsayılan değer, MX tuşuna basmak için bir veya beştir P.Uygun ışın boyutu da seçilebilir. Uzay grubuna, eğer biliniyorsa, kuvvet uzay grubu sütununa koyun. Sonra kristallerin radyasyon hassasiyetini ayarlayın.
İstenirse, tam veri kümesi koleksiyonu için toplanacak toplam dönüş açısını ayarlayın. Tüm bilgiler sisteme girdikten sonra değerleri kaydedin. Tıklayın, sevkiyatlara geri dönün ve ESRF'ye gönderi gönderme tuşuna basın.
Sevkiyat etiketini yazdırın ve örnekleri gönderin. Kullanıcılar ESRF hesap bilgilerini kullanarak bir kurye ile bir pikap düzenlemelidir. Deney günü, numuneler Massive one yüksek kapasiteli çiy-er aktarılır.
Işın hattı bilim adamları daha sonra uzaktan kullanıcılar tarafından takip edilebilir veri toplama, başlatmak. Her farklı örnek türü için, kullanıcılar veri toplamanın başladığını bildiren bir e-posta alır. Tüm iş akışlarındaki tüm adımların yürütülmesi çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir.
Bu, ISPyB'e giriş yaparak kullanıcı tarafından erişilebilir. Sonuçlar da görüntülenebilir ve indirilebilir. Analiz edilen her örnek için ISPyB'deki otomatik denemenin sonuçlarını inceleyin.
ID30A1'de istenilen deneysel oturuma tıklayın. Tercih edilen otomatik işleme ardışık hattını seçin. Doğru alan grubunda yazılan verileri en yüksek tamve en yüksek çözünürlüğe sahip olarak indirin.
Son toplama sonuçlarına tıklayıp indirebilirsiniz. MX basın P iş akışı ESRF ışın hattı Massive tarafından kullanılan tam otomatik olarak monte etmek, x-ışını ışın merkezi, karakterize, ve insan GCSH kristalleri bir dizi tam kırınım veri setleri toplamak. Örnekler monte edildi ve döngü tarayan bir alan için analiz edildi.
Kırınım analizlerinden sonra, veri toplama için kristal içinde dört nokta seçilmiştir. Moleküler replasman ile manuel yapı tayini, tek bir otomatik arıtma döngüsünden sonra yüksek kaliteli elektron yoğunluğu haritası nı ortaya koydu. Bu veri kümesi için, otomatik boru hattı bir noktada üç iki angstrom çözünürlüğü veri kesti.
Ancak, kullanıcılar verileri daha düşük çözünürlükte kesmeye karar verebilir. Sürekli elektron yoğunluğu eterminal histidin etiketi dışında tüm amino asit zinciri için görülebilir. İnsan ve büyükbaş hayvanı GCSH'yi ayıran dört ikameden üçü elektron yoğunluğunda kolayca tanımlanabilir.
Bu daha az aspartik asit lizin için daha az açıktır 125 ikame. Hangi yan zincirin elektron yoğunluğu sadece kısmen esneklik nedeniyle çözülür. Şu anda elde edilen model 20 nokta dört yüzde bir R çalışma değeri ve 23 nokta sekiz yüzde R serbest değeri ve daha otomatik ve manuel model oluşturma ve arıtma ek döngüleri ile optimize edilebilir.
Gereksinimleri sisteminize uyarlamak önemlidir. Örneğin, zaten gözlenen çözünürlüğü bilinen bir değere ayarlamak zamandan tasarruf edebilir ve daha iyi veri toplama sağlayabilir. Tam otomatik veri toplama kristalografi demokratikleştirilmiş ve şimdi bile küçük laboratuvarlar bu sadece büyük insan gücü ile daha önce mümkün iken ünlü proje girişmek olabilir.
Genel Bakış
Bu makale, protein kristalografisi için sinkrotron ışın çizgilerinin otomatik taranma ve veri toplama sürecini açıklamaktadır. Tamamen otomatik sistem, araştırmacıların insan müdahalesi olmadan kriyo-sogutmuş numunelerden veri toplamak ve işlemek için verimli bir şekilde kullanmalarına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein kristalografisi
- X-ışını kırınımı
- Veri toplamada otomasyon
Arka Plan
- X-ışını kristalografisi, protein yapılarını belirlemek için gereklidir.
- Sinkrotron ışın çizgileri, zayıf kırınım gösteren kristallerden veri elde etmek için kritik öneme sahiptir.
- Otomasyon, veri toplama verimliliğini ve kalitesini artırır.
- Massive one ışın çizgisi, biyolojik makromoleküller için tamamen otomatik bir iş akışını sunar.
Çalışmanın Amacı
- Sinkrotron ışın çizgilerinin otomatik veri toplama sürecini göstermek.
- Protein kristalografisinde otomasyonun avantajlarını vurgulamak.
- Araştırmacıların izlemesi için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Numunenin montajı ve sinkrotron'a gönderimi.
- Deney yönetimi için ISPyB bilgi sisteminin kullanılması.
- Otomatik veri toplama ve işleme iş akışları.
- Veri toplama ve sonuç analizinin gerçek zamanlı izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- İnsan GCSH kristallerinden yüksek kaliteli kırınım verilerinin başarılı bir şekilde toplanması.
- Otomatik işleme, yüksek çözünürlüklü bir elektron yoğunluk haritası üretti.
- İnsan ve sığır GCSH arasındaki yapısal farklılıkların belirlenmesi.
- Kristalografta otomatik iş akışlarının etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Veri toplamada otomasyon, kristalografiye erişimin demokratikleşmesini sağlar.
- Küçük laboratuvarlar artık daha büyük tesislerle sınırlı olan karmaşık projelere başlayabilir.
- Deneysel parametrelerin özelleştirilmesi, veri toplama verimliliğini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
