Name: Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin, kimerik antijen reseptör T hücrelerinin sitotoksisite potansiyelini değerlendirmek için gerçek zamanlı in vitro sitoliz analizi yöntemini. Bu teknik, hem sıvı hem de katı tümör hücrelerine karşı immünoterapi etkinliğini nicel olarak ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar promab Biyoteknoloji ve ACEA Biosciences reaktifler ve bu çalışmada kullanılan aletleri sağlamak için teşekkür ederiz.

1. Car kodlama lentivirus üretimi
NOT: Belirli CAR T-hücre plazmid konstrüksiyonu tamamlandıktan sonra (CD47 ve diğerleri), lentiviral CAR standart prosedür tarafından oluşturulur, kullanılarak 293 FT hücreleri, bir lentiviral ambalaj karışımı, ve transfeksiyon ajanları (Malzemeler Tablosubakınız) açıklandığı gibi29. Daha sonra, üreticinin protokolüne göre lentiviral RNA miktarını ölçerek virüs titresini belirlemek için bir kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kiti ve bir termal çevrimci (Malzemeler Tablosunabakın) kullanın. Tüm lentiviral prosedürlerin güvenlik gerekliliklerine uygun olarak gerçekleştirilmesi önemlidir.
<ol><li>Tohum 15 x 106 HEK293FT hücreleri Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) ve bir gecede 37 °C bir 150 mm çanak içinde nemlendirilmiş% 5 CO2 kuluçka içinde hücreleri kuluçka.</li>
	<li>Transfeksiyon kompleksi olan iki 15 mL tüp hazırlayın. İlk tüp lentiviral vektör plazmid DNA (5 μg) ve lentiviral ambalaj karışımı (22.5 g) transfeksiyon seyreltme çözeltisi 2.5 mL içerir. İkinci tüp, transfeksiyon seyreltme çözeltisinin 2,5 mL'sinde 82,5 μL transfeksiyon reaktifi içerir (Bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
	<li>Tüp 1 içeriğini tüp 2 içine Pipet ve 15 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçka.</li>
	<li>Tüpün içeriğini HEK293FT hücrelerinin yemeğine aktarın ve numuneyi bir gecede 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, mevcut ortamı 19 mL taze DMEM kültür ortamıile değiştirin ve 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 kuluçka makinesinin içinde hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırmaya devam edin.</li>
	<li>Orta makineyi yemekten 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüp, virüs içeren ortamı buzdolabında saklayın.</li>
	<li>Yukarıdaki yordamı tekrarlayın, taze DMEM ekleyerek ve 1 gün sonra tekrar toplayarak.</li>
	<li>Bir santrifüj tüpü içine medya iki koleksiyonbirleştirin. Tüpü 2.000 x g'de 30 dk 4 °C'de santrifüj edin.</li>
	<li>Lentivirus içeren süpernatantın çoğunu ultra net bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre ve/veya enkaz içerebilecek peletin rahatsız edici olmasını önlemek için süpernatantın en az 1 mL'lik hacmini bırakın.</li>
	<li>Ultracentrifuge yukarıda 110.000 x g 4 °C'de 100 dk için supernatant açıklık.</li>
	<li>Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve tüpün altındaki virüs peletine 100 μL DMEM ortamını hafifçe ekleyin. Tüpü 15 dk buzüzerinde bırakın. Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve lentivirus çözeltisini önceden ititlenmiş steril tüplere yerleştirin. Bu virüs stok tüplerini -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Lentiviral RNA'yı ayıklayan ve ölçen üretici protokolüne göre lentivirüsün titresini belirlemek için nicel bir RT-PCR kiti kullanın.</li>
</ol>2. ARAÇ T hücrelerinin üretimi ve genişlemesi
<ol><li>Daha önce dondurulmuş insan PBMC'leri (yaklaşık 1 x 106 ila 2 x 106 hücre) 1 mL CAR T-hücre ortamında eşit sayıda CD3/CD28 kaplı mikroboncukla etkinleştirin (Malzeme Tablosunabakın) ve 24 saat boyunca nemlendirilmiş %5 CO2 kuluçka makinesinde hücreleri 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Lentivirus stokunun bir aliquot'unu buzda erit.</li>
	<li>1 μL transdüksiyon ekleyin hücrelerle kuyuya ajan geliştirmek ve karıştırın.</li>
	<li>5:1 enfeksiyon (MOI) bir çokluk hücrelere lentivirus ekleyin ve yavaşça karıştırın. Ertesi gün, bu adımı tekrarlayın (ilk transdüksiyondan sonra 24 saat).</li>
	<li>Her 2-3 günde bir T hücresi büyümesini izleyin. Hücreleri 1 x 106 ila 2 x 106 hücre/mL yoğunlukta tutmak için daha taze CAR T-hücre ortamı ekleyin.</li>
	<li>Dondurucu çözeltiyi kullanarak STANDART bir protokolle CAR T hücrelerini dondurun (Bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
	<li>Test ekibe uygulamadan önce STANDART bir yöntem kullanarak CAR T hücrelerini eritin ve IL-2 (300 adet/mL) ile ~2-4 saat boyunca CAR T-hücre ortamında önkültür.</li>
</ol>3. Akış sitometrisi ile ARAÇ ekspresyonunun saptanması
<ol><li>3 x 105 CAR T hücrelerini ve transed olmayan T hücrelerini iki ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Tüpleri 300 x g'de 2 dakika için santrifüj edin ve %1 insan serumu içeren floresan aktif hücre sıralama (FACS) tamponunun 200 μL'sinde hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Pipet 100 μL hücre çözeltisi iki 5 mL polistiren FACS tüpleri içine ve 5 dakika boyunca buz tüpleri tutun.</li>
	<li>Her hücre tipinden bir tüpe 1 μL biyotinylated keçi anti-mouse F(ab')2 ekleyin. Daha sonra, her hücre tipinin diğer tüpüne 2 μL PE etiketli anti-tag antikor (Malzemeler Tablosunabakın) ekleyin. İyibir şekilde karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri her tüpte 3 mL FACS tamponu ile yıkayın ve tüpleri 300 x g'de 5 dk santrifüj edin; supernatants ve girdap çok kısa bir süre atın veya kalıntı sıvı hücreleri yeniden askıya almak için kısa bir süre tüpleri sallamak.</li>
	<li>Her tüpe 2 μL APC anti-CD3 ve 2 μL 7-AAD antikor çözeltisi (Malzeme Tablosunabakın) ekleyin. Anti-F(ab')2 Ab ile boyanmış hücrelerin tüpünde 1 μL PE etiketli streptavidin ekleyin. Kısa bir süre karıştırın ve 30 dakika daha buz tüpleri kuluçka.</li>
	<li>Adım 3.5'te açıklandığı gibi hücreleri tekrar yıkamak ve her tüpe 200°L daha FAZLA FACS tamponu eklemek için FACS arabelleği kullanın.</li>
	<li>Akış sitometrisini kullanarak hücreleri önce ileri dağılım ve yan dağılım çiziminde T hücrelerine gating yaparak ve daha sonra cd3'e karşı 7-AAD çiziminde canlı hücrelere (7-AAD-negatif) gating yaparak analiz edin. Son adım anti-tag, anti-ScFv veya anti-F (ab')2 vs CD3 analiz etmektir.</li>
</ol>4. Gerçek zamanlı sitoksis potens teşp
NOT: RTCA tayini üreticinin önerilen koşullarına göre gerçekleştirin. Kısacası, ilk plaka E-Plaka kuyularında hedef hücreleri, ertesi gün CAR T hücrelerinin eklenmesi izledi. CAR T hücrelerinin hedef hücrelere karşı sitokiz aktivitesi gerçek zamanlı olarak izlenir. T hücreleri ve mock-transduced T hücreleri (Mock CAR T hücreleri) negatif efektör hücre kontrolleri olarak kullanılır. Aşağıdaki protokol, yapışık tümör hücre hatları için in vitro gerçek zamanlı sitoksis potens testini açıklamaktadır.
<ol><li>XCELLigence E-Plakasının her kuyusuna 100 μL hedef hücre kültürü ortamı ekleyin, plakayı xCELLigence aletinin içine yerleştirin ve arka plan okuması alın. Daha sonra, hücre tohumlama için bir doku kültürü başlık E-Plaka aktarın.</li>
	<li>Kültür cihazından hedef kanser hücrelerini denemek için standart bir protokol kullanın. Daha sonra hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 15 mL'ye kadar taze kültür ortamı ekleyin. 200 x g5 dk için santrifüj ile hücre pelet . Supernatant atın, taze orta 5 mL ekleyin ve yavaşça hücre pelet yeniden askıya serolojik pipet kullanın. Hemositometre ve mikroskop kullanarak canlı hücrelerin yoğunluğunu sayın.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu uygun şekilde ayarlayın ve ardından E-Plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 100 L'sini ekleyin. Hedef hücre numarası genellikle yaklaşık 10.000 hücre / iyi yapışık hücre hatları için (BxPC3, Hela-CD19 ve SKOV3), veya 30.000 hücreleri / iyi Raji gibi süspansiyon hücreleri için (sıvı kanser hücreleri tether için antikorlar ile precoating kuyular ile ilgili ayrıntılar için aşağıya bakın).</li>
	<li>Hücrelerin kuyunun dibine eşit bir şekilde yerleşmelerini sağlamak için E-Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengeleyin (bu çok önemlidir; bu adımı atlamayın).</li>
	<li>E-Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesinin içine xCELLigence aletine yerleştirin ve hücre indeksi ve zaman olarak görüntülenen empedansı otomatik olarak her 15 dakikada bir ölçmeye başlayın.</li>
	<li>Ertesi gün, efektör CAR T hücreleri hazırlayın. Tüm hücrelerin aynı anda hazır olduğundan emin olmak için uygun kontrolleri (örneğin, Mock CAR T hücreleri, trans-transduced olmayan kontrol T hücreleri ve/veya ilgisiz CAR T hücreleri) önceden hazırladığınızdan emin olun. Efektör hücreleri ve kontrol hücrelerini uygun yoğunluğa ayarlayın ve adım 9'daki her kuyuya 100°L efektör hücre süspansiyonu eklendiğinde istenilen E:T oranlarının elde edilmesini sağlamak için seri seyreltmeler hazırlayın.</li>
	<li>XCELLigence veri alımını duraklatın ve E-Plakayı kuvözden hücre kültürü başlığına getirin.</li>
	<li>Her kuyudan 100°L orta çıkarın. Her kuyuda artık ortam miktarı şu anda 100 μL'dir.</li>
	<li>İstenilen E:T oranlarını elde etmek için seri olarak seyreltilmiş efektör CAR T hücreleri veya diğer kontrol hücrelerinin (yani Mock CAR T hücreleri) 100 μL ekleyin.</li>
	<li>Efektör hücrelerin yerleşmesine izin vermek için E-Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengeleyin ve e-Plakayı xCELLigence aletine geri yerleştirin. Veri toplamayı devam ettirin.</li>
	<li>Eğer istenirse, önemli zaman noktalarında xCELLigence veri toplama duraklatılabilir ve ortogonal tahliller (yani, ELISA veya akış sitometrisi tarafından sitokin üretiminin ölçülmesi) tarafından analiz edilecek küçük numuneler toplamak için plaka kaldırılabilir.</li>
	<li>EGFR-GITR-CD3 CAR T-cell deneyinde, INFγ verimini bir ELISA kiti ile ölçün (üreticinin talimatlarına uyun; Malzeme Tablosunabakın). SIVI KANSERLerİn KULLANIMI İlE İlGİlİ NOT: Yapışmaz hematolojik kanser hücrelerini test etmek için, hücrelere eklemeden önce E-Plate kuyuları ilk olarak kanser hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen bir antijene özgü bir antikor la kaplanır. Raji B hücre hattı için anti-CD40 dayalı bir tethering reaktif kullanılır (Malzemeler Tablosu'ndasıvı tümör öldürme test kiti bakınız). Aşağıda plaka kaplama prosedürüdür:</li>
	<li>Tethering reaktifini (anti-CD40) tethering tamponu ile 4 μg/mL konsantrasyonuna seyreltin.</li>
	<li>Bir doku kültürü başlık içinde çalışma, E-Plate her kuyuya seyreltilmiş tethering reaktif 50 μL ekleyin. E-Plakayı oda sıcaklığında veya 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 3 saat bekletin.</li>
	<li>Tethering reagent çıkarın ve yıkama tampon ile en az 2x E-Plaka yıkayın. Bu noktada, E-Plaka Raji hedef hücreleri (30.000 hücre / iyi) tohumlama için hazırdır.</li>
	<li>Yordamın geri kalanını gerçekleştirmek için adım 4.1 (üstte) ile devam edin.</li>
</ol>

<ol><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+Therapy%3A+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li>
<li>June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>FDA. FDA approval brings first gene therapy to the United States. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017).</li>
<li>FDA. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017).</li>
<li>Celgene. Celgene Corporation and bluebird bio Announce bb2121 Anti-BCMA CAR-T Cell Therapy Has Been Granted Breakthrough Therapy Designation from FDA and Prime Eligibility from EMA for Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://ir.celgene.com/releasedetail.cfm?releaseid=1049014">http://ir.celgene.com/releasedetail.cfm?releaseid=1049014</a> (2017).</li>
<li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 166(2017).</li>
<li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li>
<li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li>
<li>Celyad. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017).</li>
<li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li>
<li>D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy%3A+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li>
<li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric-antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cell+therapy+for+solid+tumors%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li>
<li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li>
<li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li>
<li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+the+chromium-51+release%2C+cell-mediated+cytotoxicity+assay%3A+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074(2015).</li>
<li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , 27(2001).</li>
<li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free%2C+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li>
<li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li>
<li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+%28RT-CES%29+technology+to+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies%3A+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News+%28GEN%29%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li>
<li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li>
<li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li>
<li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683(2012).</li>
<li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li>
<li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13(2018).</li>
<li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47%2FSIRPalpha+axis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD47%3A+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li>
<li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine%2C+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+%28P4455%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+Industry%2C+Potency+Tests+for+Cellular+and+Gene+Therapy+Products%22">Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products</a>. , (2017).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149(2017).</li>
<li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+technology+and+patient+cells%3A+from+early+drug+development+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar CAR T-hücre geliştirme ve ProMab Biyoteknoloji ve ACEA Biosciences iş çıkarları olan ilişkili potens tahlilleri, sırasıyla araştırma yapmak. Ancak bu, yazarların JoVE'nin bilimsel bilginin yayılmasını artırma misyonuna olan bağlılığını değiştirmez. Bu yayının şartları ProMab Biyoteknoloji ve ACEA Biosciences tarafından araştırma politikasına uygun olarak gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Chimeric antijen reseptörleri bir hücre dışı tek zincirli değişken parça (scFv bölge), bir menteşe bölgesi, bir transmembran bölgesi ve CD28 ve OX4011,40gibi reseptörlerden TCR sinyal etki alanları ve ek kostimulatör etki alanlarından oluşan bir sitoplazmik etki alanı oluşan çok etki alanı proteinleridir. Güvenli, seçici ve etkili CAR tasarlamak için, CAR tasarımında çeşitli permütasyon iyice in vitro potens tahlilleri ve sonunda, hayvan modelleri kullanılarak test olması zorunludur. Bu çalışmada, gerçek zamanlı in vitro potens testin etkili CAR'lerin tasarımını nasıl bilgilendirebileceği ne üzere bir protokol ve iş akışı sağladık.
Özellikle üretim amaçlı, potens analizi her türlü tasarımında, bu tetki, sağlam, tutarlı hassas olması zorunludur ve mümkün olduğunca eylem mekanizmasına yakın16,17,41. Burada açıklanan gerçek zamanlı potens tsay doğrudan yerine sitokin serbest gibi bir vekil marker kullanarak CAR T hücresinin sitolitik aktivitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Daha da önemlisi, teşp, boyalar veya reaktifler gibi, ispon plakası (E-Plaka) ve hücrelerin bakımı için önerilen ortam dışında ek bileşenler gerektirmez. Ayrıca, tahlil son derece hassas ve diğer etiket tabanlı tahliller42,43,44ile karşılaştırıldığında son derece çoğaltılabilir veri sağlar. Ayrıca, xCELLigence tsay belirli sitolizin değerlendirilmesi için ideal olan çok düşük efektör-hedef oranları kullanarak münasiptir.
KCELLigence sisteminin esnekliğini ve faydasını göstermek için hematolojik kökenli tümörler ve solid tümörler olmak üzere iki tümör tipiüzerinde yoğunlaştık. CD22-yönettiği CAR T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için, Raji hücreleri (yani, bir B hücreli lenfoma hücre hattı) bir anti-CD40 antikor kullanılarak E-Plakalar bağlı edildi. Raji hücrelerinin E-Plates'in dibine tethering'i, kuyudaki Raji hücrelerinin canlılığını ve sayısını yansıtan bir empedans sinyali ile sonuçlanır. CD22-CAR T hücrelerinin eklenmesinden sonra Raji hücreleri seçici olarak zaman ve efektöre bağlı bir şekilde öldürülür ve empedans sinyalinde zamana bağlı bir azalma yla sonuçlanır. Empedanstaki düşüş sitoliz veya Raji hücrelerinin canlılığının17. Antikorlar kullanarak bu selektif tethering yaklaşım diğer sıvı tümör hücre hatları genişletilebilir. Hematolojik kökenli tümör hücre hatları kullanarak alternatif bir strateji, cd19 HeLa hücrelerinde ifade gibi tümör antijenleri stably ifade etmek için tasarlanmış yapışık kanser hücreleri kullanmaktır. Bu yaklaşımın avantajı ebeveyn HeLa hücreleri kolayca kullanılabilir ve özgüllük için olumsuz bir kontrol olarak kullanılabilir olmasıdır. Böyle bir yaklaşım zaten CHO-CD22 vs CHO hücreleri ve CHO-BCMAs vs CHO hücreleri29ile doğrulanmıştır. Bu tür farklı yaklaşımlar kullanılarak, CAR T-hücre tasarımı ve etkinliği kolayca test edilebilir. XCELLigence tsay doğal olarak esnektir ve doğal olarak ölçüm koşulları fizyolojik koşullara maksimum olarak yaklaşacak şekilde ayarlanabilir.
Burada açıklanan potens tsay önemli bir avantajı basit bir fonksiyonel tsay ve yüksek verimli bir şekilde optimum ve etkili CARs tasarlamak için genetik mühendislik teknikleri ile birlikte kullanılabilir olmasıdır. EGFR-pozitif kanser hücrelerini hedeflemek için tasarlanmış CAR T hücreleri için burada gösterildiği gibi, tsay farklı CAR yapıları / mutantlar göreli aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Örneğin, GITR etki alanı CD3 etki alanının yukarısında bulunduğunda, CD3 etki alanının aşağı akışına göre çok daha sağlam sitolitik etkinlik gösterdiğini gösterdik.
In vivo CAR T hücre aktivitesi ile mükemmel bir ilişki olmamasına rağmen, in vitro sitokin salınımı tarihsel CAR T hücre potens bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Burada açıklanan xCELLigence bazlı potens tahlili, üretim sırasında veya klinik uygulama için piyasaya sürülmeden önce hücre bazlı tedavilerin değerlendirilmesi için kullanılabilse de, bu sonuçların in vivo etkinliği ile ne kadar iyi ilişkili olduğu henüz Kurulan. In vivo etkinlik, in vitro bir töz de recapitulated olmayabilir faktörler ve değişkenler bir dizi bağlıdır. Bu değişkenler şunlardır: tümörün siteye CAR T hücrelerinin homing, stimülasyon ve CAR T hücresiaktivasyonu ve yeteneği hasta içinde devam etmek, ve tümör mikroçevre. Daha fazla arıtma ile xCELLigence tsay bu karmaşık süreçlerin bazı in vitro modelleme yeteneğine sahip olabilir.
Burada sağlanan protokol çoğu yapışık kanser hücre hatları ve bazı sıvı tümör hücre hatları için geçerlidir. Birincil kanser hücreleri gibi klinik örnekler, ancak, daha fazla test edilmesi ve tümör türleri ve aşamalarının karmaşıklığı nedeniyle optimize edilmesi gerekir. Kesinlikle burada açıklanan in vitro potens tsay sistemi sadece CAR T hücrelerinin potansiyel aktivitesini yansıtmak için kanser hücre hatları kullanır dikkati çekiyor. İnsan vücudunun içinde gerçek tümör durumu çok daha karmaşıktır, özellikle sağlam bir tümör hedeflendiğinde, dinamik tümör ortamı ve gelişimi nedeniyle. Bu nedenle, potens değerlendirme sonucu test EDILEN CAR T hücrelerinin klinik etkinliğine çok iyi bir şekilde çevrilmeyebilir.
Özetle, sunulan empedans tabanlı xCELLigence platformu, hücre öldürmenin etiketsiz olarak 10 güne kadar uzun bir süre izlenmesine olanak tanır. Veri toplama için bu kadar uzun bir zamansal ölçek için bu kapasite, teknolojiyi şu anda kullanılmakta olan ve zaman noktası toplama ve zahmetli numune işleme için birden fazla deneysel kopya oluşturmayı gerektiren diğer tahlillerden ayırır. Ayrıca, efektör bağışıklık hücrelerinin minimal sinyal katkısı veri analizini kolaylaştırır. Yazılım verileri otomatik olarak işleyebilir ve sitoliz, KT50, vb yüzdesi gibi yararlı parametreler oluşturabilir. Teknoloji zaten yüksek duyarlılık göstermiştir (1:20 gibi düşük E:T oranları ile) ve büyük bir dinamik aralık (E:T oranları ile 20:1 için 1:20), hangi kolayca diğer tahliller ile elde edilmez. Genel olarak, bu teknolojinin uygulanması car T-hücre reaktiflerinin gelişimini artıracak daha yüksek bir iş verme ölçeğinde daha doğru bir veri analizi ne izin vermelidir, çok daha yüksek bir hızda alan ilerleyen.

Son yıllarda, CAR T-hücre tedavisi nüks etmiş ve refrakter hematopoetik maligniteler için kanser immünoterapisinde en önemli atılımlardan biri olmuştur. Son ABD ile. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) akut lenfoblastik lösemi için CD19 yönettiği CAR T hücrelerinin onayı, non-Hodgkin lenfoma, ve diffüz büyük B-hücreli lenfoma, ve B-hücreli olgunlaşma antijeni için atılım tedavi atama (BCMA)-multipl miyelom için CAR T hücreleri yönettiği, bu teknoloji bilimsel toplumda büyük heyecan yarattı ve çok sayıda temel yakıt vardır, uygulanan, ve klinik çalışmalar dünya çapında ,1,3, 4,5. Ocak 2019'da, klinik deney veritabanında (clinicaltrials.gov) 700'den fazla klinik çalışma kaydedildi; Bu çalışmaların yaklaşık 450'si ya başlamak üzereydi ya da aktif olarak hasta ları işe almak üzereydi. Klinik çalışmaların çoğu hematolojik maligniteler üzerinde duruldu, ve CD20 hedefleyen CAR T hücreleri kullanan klinik çalışmalar, CD22, ve BCMA, CD19 ek olarak, de devam ediyor6,7. Çalışmaların çoğu otolog CAR T-hücre tedavisi kullanırken, bunların önemli bir kısmı da allojenik CAR Thücrelerininyarar keşfetmek 8,9,10. Hematolojik maligniteler ile umut verici sonuçlara rağmen, solid tümörleri hedeflemek için CAR T hücrelerinin kullanımı, sadece tümör de ifade edilen iyi hedeflerin eksikliği de dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli nedenlerle klinikte çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır, katı tümörler ve tümör heterojenite "kaçış", ve zorluk CAR T hücrelerinin tümör mikroçevreerişen var11,12,13,14, 15. Etkinliği ve "hedef-off tümör" toksisitesi sorunu bu engelleri aşabilir katı tümöre özgü CAR T hücrelerinin geliştirilmesi için kritik bir ihtiyaç vardır. In vitro ve in vivo yaklaşımlar çok sayıda tasarım ve CAR T hücrelerinin test garanti ederken, sağlam ve tahmine dayalı in vitro potens testi birincil öneme sahiptir16,17.
CAR T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için çeşitli in vitro yöntemler geliştirilmiştir. Genel olarak, bu potens tahlilleri,(i)CAR T hücrelerinin hedef tümör hücrelerine karşı sitolitik aktivitesini doğrudan ölçüp ölçmediklerine bağlı olarak iki geniş kategoriye ayrılabilir, ya da (ii) hedef hücreleri öldürürken CAR T hücreleri tarafından salınan sitokinler gibi taşıyıcı belirteçleri ölçerler. Doğrudan sitolitik aktiviteyi ölçmek teknikleri krom-51 serbest tahlil (Cra)18,floresan problar 19 kullanarak hedef hücrelerin apoptosis ölçmek görüntüleme tabanlı tahliller19,20, ve apoptotik hedef hücreleri tespit akış sitometri tahliller21. Bu tahlillerde, CAR T hücreleri genellikle radyoaktif veya floresan problarla önceden etiketlenmiş hedef hücrelerle birlikte yetiştirilir ve bunu uygun ölçümle takip eder. Uzun duyarlılığı nedeniyle alanında altın standart olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, MKK bazı dezavantajları vardır. İlk olarak, bir uç nokta tsömültüs ve kinetik bilgi sağlamaz. İkinci olarak, hedef hücrelerin krom-51 ile etiketlenmiş olması gerekir hangi hücrelerin leach eğilimindedir ve önemli ölçüde arka plan gürültü artırabilir22. Son olarak, uygun önlemler ve radyoaktif atık bertaraf gerektirir. Potens in bir göstergesi olarak hedef hücreler ile CAR T-hücre etkileşiminin yan ölçüt alternatif tahliller, ya akış sitometri tabanlı yöntemler veya enzime bağlı immünosorbent tahlilleri kullanarak CAR T hücreleri tarafından yayımlanan çeşitli sitokinlerin nicel sayımı içerir. Bir kez daha, bu belirli bir zaman noktasında sitokinlerin kümülatif salınımını ölçmek ve böylece, mutlaka CAR T hücrelerinin gerçek sitoklitik aktivitesini yansıtmayabilir uç nokta tahlilleri vardır.
Bir potens analizi geliştirirken, özellikle bir CAR T-hücre gibi bir hücre tabanlı tedavi için serbest kalma kriterleri tanımlayan, her etkileşim için hesaba ihtiyacı olan ve genel sağlamlık ve test tutarlılığını azaltabilir başka bir değişken olduğu için test minimal manipülasyonlar ve eller-zaman içeren önemlidir. Ayrıca, tümör hücreleri ile CAR T hücrelerinin etkileşimi dinamik bir süreçtir ve sitolyz oranı gibi bu dinamik etkileşimler hakkında bilgi sağlamak, potens değerlendirme için birincil önemtaşımaktadır. Bu kriterleri göz önünde bulundurarak, xCELLigence gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) platformlarını kullanan CAR T hücreleri için etiketsiz kinetik potens testini geliştirdik. xCELLigence, her kuyunun dibine gömülü altın biyosensörler içeren özel mikrotiter plakalar (E-Plakalar) kullanır. Ya yapışık katı tümör hücreleri ile çalışma, ya da belirli antikorlar kullanılarak bağlı olan sıvı kanser hücreleri, bu biyosensörler hedef hücre numarası, hücre büyüklüğü, hücre-substrat eki gücü ve hücre-hücre etkileşimleri (yani bariyer fonksiyonu)17,23,24,25,26,27,28gerçek zamanlı CAR T hücre kaynaklı değişiklikleri izlemek . İş akışı basittir ve hedef hücrelerin sadece E-Plaka kuyularına tohumlamayı ve ardından car T hücrelerinin farklı efektör-hedef oranlarına eklenmesini içerir(Şekil 1). Daha sonra, biyosensörler hedef hücrelerin canlılığını sürekli olarak izledikçe veriler otomatik olarak gerçek zamanlı olarak görüntülenir.
Son 15 yıl içinde xCELLigence tsay doğal katil (NK) hücrelerinin potens değerlendirmek için doğrulanmıştır , T hücreleri, CAR T hücreleri, kontrol noktası inhibitörleri, bispesifik antikorlar, onkolitik virüsler, ve bazı kombinasyontedavileri 17,29,30,31,32,33,34. Son zamanlarda, xCELLigence potens tsay t-hücre reseptörü (TCR)-mühendislik T-hücreleri35üretimi için değerlendirildi. Burada, klinik tedavilerde katı tümörleri ve sıvı tümörleri hedeflemek üzere tasarlanmış CAR T hücrelerinin in vitro potensini değerlendirmek için RTCA sisteminin işe yaradığı bildirilmektedir.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40, sıvı tümör öldürme test kiti</td><td>ACEA Biosciences</td><td>8100005</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan F (ab')2</td><td>Jackson İmmünoaraştırma laboratuvarları.</td><td>109-116-088</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>317318</td><td></td></tr><tr><td>Deney ortamı RPMI1640</td><td>yaşam teknolojileri. Corp</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>CAR-T hücre donmuş çözeltisi CryostorCS10</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>#07930</td><td></td></tr><tr>ProMab <td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td><td>12055-091'den CAR-T hücre ortamı 12055-091</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 kaplı mikro boncuklar, Dynabeads</td><td>Thermofisher</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GElifesciences.com</td><td>SH30243.02</td><td></td></tr><tr><td>FACS tamponu</td><td>Promab yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza.com</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Thermo Fisher</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>INFg ELISA kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Ambalaj Karışım</td><td>Sistemi Biosciences</td><td>VP100</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X kantitatif RT-PCR titrasyon kiti (Clontech)</td><td>Takara</td><td>631235</td><td></td></tr><tr><td>Promab hedef hücreler için ortam</td><td>Hücre hatlarına</td><td></td><td></td>göre değişir</tr><tr><td>Gerçek zamanlı Hücresel Analyer</td><td>ACEA Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İletim geliştirme ajanı, Virüs İletim Arttırıcı (Alstem)</td><td>Transplus, Alstem</td><td>V020</td><td></td></tr><tr><td>İletim seyreltme çözeltisi, Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi, NanoFect reaktifi</td><td>Alstem</td><td>NF100</td><td></td></tr></tbody></table>

katı ve hematolojik kanser hücrelerini hedefleyen İmhimik antijen reseptör t hücreleri için gerçek zamanlı potens tsay

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Kanser için şemerik antijen reseptörü (CAR) T-hücre tedavisi çocukluk akut lenfositik lösemi gibi dirençli ve refrakter hematolojik maligniteler için önemli klinik fayda sağlamıştır. Çabalar şu anda diğer hematolojik kanserlere ek olarak katı tümörler için bu umut verici tedavi genişletmek için devam etmektedir. Burada, katı ve sıvı tümör hücrelerinde benzersiz veya tercihli ekspresyon ile antijenleri hedefleyen güçlü CAR T hücrelerinin geliştirilmesini ve üretimini açıklıyoruz. Bu CAR T hücrelerinin in vitro potens sonra son derece hassas empedans tabanlı xCELLigence test kullanılarak gerçek zamanlı olarak değerlendirilir. Özellikle glukokortikoid kaynaklı tümör nekroz faktör reseptörü (TNFR)'e bağlı protein (GITR) gibi farklı kostimulatör sinyal etki alanlarının CAR T hücrelerinin in vitro gücü üzerindeki etkisi incelenmiştir. Bu rapor için protokoller içerir: lentiviral gen transdüksiyonu kullanarak preklinik çalışmalar için CAR T hücreleri üreten, CAR T hücrelerinin genişletilmesi, CAR ekspresyonunun doğrulanması, ve xCELLigence potens testleri nin çalıştırılması ve analiz imal edileb.

CAR lentivirus hazırlık ve CAR T-hücre üretimi ve potens değerlendirmesi CAR lentivirus preparatlarının titreleri, üreticinin protokolüne göre nicel RT-PCR kiti (Malzeme Tablosunabakınız) kullanılarak belirlendi. Titrasyon protokolü önce rna virüsünü çıkardı ve sonra enfeksiyöz viral partikül miktarını gösteren lentiviral RNA kopya numarasını ölçtü. Yukarıdaki protokolü kullanarak bir 150 mm çanak üretilen virüs titresi genellikle 109-1010 viral kopya / mL arasında değişmektedir. Şekil 2A, RT-PCR çevrim numarasını temsili nicel BIR PCR sonucunun sinyal mukavemetine karşılık verir. Virüs kalitesi tatmin edildikten sonra, titre 1 x 108 pfu/mL'den büyük olduğunda, sonraki T hücre transdüksiyonu için donduruldu. CAR T hücreleri lentivirüs ile transekten sonra, T hücreleri 1x 106 ila 2 x 106 hücre/mL civarında yoğunluklarını koruyarak 12-14 gün daha kültürlendi. CAR T hücreleri daha sonra bir akış uygulama önce bir akış sitometre kullanılarak anti-ScFv özgü antikor ile kontrol edildi veya donduruluyor. Şekil 2B'deiyi bir temsili toplu iş sonucu gösterilmiştir. Bir anti-ScFv antikor kullanarak, CAR T hücrelerinin yaklaşık% 50 pozitif lekeli (Q2 50.6% vs T hücreleri 1%), T hücrelerinin yaklaşık% 50 CAR ifade gösteren. Daha sonra, RTCA potens tayini CAR T hücrelerinin her toplu dondurulmuş ve gelecekteki uygulamaya hazır önce sitolyz belirlenmesi için yapıldı. CAR T-hücre tasarımı, nesil ve değerlendirme prosedürü bir döngü yaklaşık 1 ay sürdü.
Raji lenfoma B hücrelerinin CD22-CAR T hücreleri ile öldürülmesi Anti-CD40 sıvı tümör tethering kiti (MalzemelerTablosubakınız) 4 μg/mL konsantrasyonda bir E-Plakayı 37 °C'de 3 saat kaplamak için kullanılmıştır. Kuyular tethering tamponu ile yıkandıktan sonra, B hücreli lenfoma hücreleri 30.000 hücre/kuyu yoğunluğunda E-Plaka'ya eklendi. Hücrelerin 30 dakikaya yerleşmesine izin verildikten sonra E-Plaka xCELLigence aletinin içine geri yerleştirildi ve hücre eki ve çoğalmasını yakalamak için hemen empedans okumaları başlatıldı. Ertesi gün, cd22-CAR T hücreleri, Mock CAR T hücreleri veya transemeedilmemiş T hücreleri eklendi. Şekil 3'tetüm hücre tipleri için 10:1 E:T oranı kullanılmıştır. CD22-CAR T hücreleri ile tedavi EDILEN CD22-pozitif Raji hücreleri, negatif kontrollere (transed edilemeyen T hücreleri ve Mock CAR T hücreleri) göre anlamlı öldürme (yeşil iz) göstermiştir.
CD47-CAR T hücreleri tarafından pankreas kanseri hücrelerinin etkili öldürülmesi CD47 immünglobulin süper familyasının transmembran yüzey glikoproteinidir. Bir integrin ilişkili protein olarak, yüksek hem hematolojik kanserlerde ifade edilir (lösemi, lenfoma, ve multipl miyelom) ve katı kanserler (yumurtalık gibi, küçük hücreli akciğer kanseri, pankreas, glioblastoma) ve kanserlerin diğer türleri36,37. CD47 aynı zamanda makrofajlar için bir do-not-eat-me sinyal olarak bilinir, hangi bazı kanserlerde potansiyel bir terapötik hedef yaptı. CD47-CAR T hücreleri üretildi ve CD4738yüksek düzeyde ifade BxPC3 pankreas kanseri hücrelerine karşı test edildi,39. BxPC3 hücreleri 1.gün 10.000 hücre/kuyu yoğunluğunda E-Plate'de tohumlandı. Gerçek zamanlı izleme, bu hücrelerin 16 saat sonra biraraya geldiğini gösterdi. Bu noktada, CAR T hücreleri 10:1(Şekil 4A)E:T oranına eklenmiştir. Transeneden olmayan T hücreleri ve Mock CAR T hücreleri gibi kontrol efektörü hücreleri de eklendi. Sonuçlar açıkça CD47-CAR T hücreleri seçici hedef BxPC3 hücreleri29öldürmek göstermektedir. Ayrıca Şekil 4B, CD47-CAR T hücreleri boş bir kuyuya eklendiğinde empedans sinyalinin hedef BxPC3 hücreleri tarafından oluşturulan empedans sinyalinden önemli ölçüde daha düşük olduğunu göstermektedir. Cd47-CAR T hücrelerine sahip kuyulardan gelen Hücre İndeksi değeri maksimum 0,14'e ulaşmıştır ve bu da yalnızca sadece ortamdan gelen sinyalden biraz daha yüksektir (0,02). Bu, bu heterojen öldürme testinde empedans sinyalinin neredeyse sadece hedef kanser hücrelerinden elde olduğunu gösterir.
GITR etki alanı tarafından CAR T hücrelerinin costimulation Bir EGFR-GITR-CD3 CAR ifade edildiğinde, GITR kostimulatör etki alanı daha önce EGFR-pozitif SKOV3 kanser hücrelerinin değil, EGFR-negatif MCF-7 kanser hücrelerinin öldürülmesini artırmak içinbildirilmiştir 30. GITR etki alanının rolünü daha iyi açıklığa kavuşturmak için, tam uzunlukta GITR etki alanını içeren CAR yapıları veya etki alanının silinmiş veya yeniden düzenlenmiş sürümleri, CAR T hücrelerini bir arada etkinleştirme yeteneği için oluşturulmuş ve test edilmiştir(Şekil 5A). Şekil 5B,C'deki xCELLigence verileri, GITR kostimulatör etki alanının, GITR etki alanından yoksun orijinal CAR yapısında gözlenenin üzerinde EGFR pozitif hedef hücrelerin IN CAR T hücre öldürmesini artırdığını göstermektedir. Ayrıca, GITR etki alanından 10 amino asit silmesi (amino asitler 184-193) bu uyarıcı etkinliği ortadan kaldırmıştır. Buna karşılık, CAR yapısı içinde GITR etki alanının göreli konumlandırma yeniden düzenlenmesi onun uyarıcı yetenekleri için daha az zararlı olduğunu kanıtladı. Son nokta verilerini kullanarak, T-hücre aktivasyonunun bir sureti olarak IFNγ üretimi de GITR etki alanının uyarıcı etkinliğini göstermiştir (Şekil 5B). Sadece bir "anlık çekim" olan uç nokta verilerinin aksine, xCELLigence cihazının sürekli empedans profili farklı tedavilerin öldürücü kinetikteki ince farklılıkları açıkça aydınlatır(Şekil 5C). Burada elde edilen sonuçlar bir in vivo çalışma30ile tutarlıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> Şekil 1: XCELLigence gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemi, hedef hücrelerin efektör hücreler tarafından öldürülmesini algılar. Hedef kanser hücrelerine karşı CAR T efektör hücrelerinin öldürme aktivitesini ölçmek için üç ana kavram adımı vardır. Adım 1: Hedef hücreleri (yani tümör hücrelerini) bir E-Plate kuyununa tohumlayın. Hücreler altın biyosensör mikroelektrotlarına bağlanır ve bu da elektrotlar arasındaki elektrik akımının akışını engeller. Bu empedans değeri ölçülür ve Hücre Dizini adı verilen birimsiz bir parametre olarak çizilir. Hücreler büyüdükçe hücre dizini değeri artar ve hücreler yaklaştıkça bir platoya ulaşır. Adım 2: Effector hücreleri-nonadherent bağışıklık hücreleri-sonradan eklenir. Bu hücreler altın mikroelektrotlara uymadıkları için doğrudan empedans değişimine neden olmazlar. Adım 3: Eğer etki hücreleri hedef kanser hücrelerine saldırırsa, tümör hücrelerinin yok edilmesi zaman içinde Hücre Indeksi'ndeki bir azalma ile yansır. Efektör hücrelerin bu sitalizitik aktivitesi veya efektör hücrelerin gücü hassas ve hassas bir şekilde izlenebilir. XCELLigence sisteminden empedans verilerinin sürekli olarak elde edilmesi, aynı anda birden fazla koşul için gerçek zamanlı öldürme kinetik analizini sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> Şekil 2: CAR T hücrelerinin lentivirüs ve akış sitometrisinin titer tayini. (A) Lentiviral titretintisi. Farklı renk çizgileri, döngü numarası vs delta Rn için temsili örneklerdir. Düşük çevrim numaraları, örneklerde bulunan nispeten yüksek miktarda virüs RNA şablonunu gösterir. (B) Transdüksiyondan sonra CAR T hücreleri 2 x 106 hücre/mL'den daha az bir yoğunlukta kültürlendi ve muhafaza edildi ve daha sonra akış analizine tabi tutuldu. Yekseni, Q1 ve Q2 alanlarına yansıyan pozitif değerlerle T hücreleri için boyamayı yansıtır. Her iki örnek de T hücreleri için 0 pozitiftir. CAR scFV ifadesi scFv'ye özgü Ab(x-ekseni)kullanılarak belirlenir. Sonuç, CD22-CAR T hücrelerinde T hücrelerinin P'den fazlasının scFv pozitif olduğunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> Şekil 3: Cd22-CAR T hücrelerinin Raji Burkitt lenfoma hücrelerine karşı öldürme dinamiği. Kırmızı eğri tek başına Raji hücreleri iken, yeşil eğri CD22-CAR T hücreleri ile tedavi Raji hücreleridir. Pembe ve mavi eğriler Mock CAR T-hücre tedavisi ve transdükse olmayan T-hücre tedavisi, sırasıyla vardır. E:T oranı 10:1'dir. Hata çubukları standart sapmadır. Daha fazla veri noktası bulunmasına rağmen, zaman ölçeği kolay görüntülenmek için 2 saat aralıklarla ayarlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> Şekil 4: CD47-CAR T hücrelerinin pankreas katı tümör hücrelerine karşı etkinliği. (A) Pembe hedef BxPC3 hücreleri tek başına, kırmızı CD47-CAR T hücreleri eklendi BxPC3 ise. Yeşil nontransduced T hücrelerinin eklenmesi ile BxPC3, ve mavi Mock CAR T hücreleri ile. E:T oranı 10:1'dir. (B) Aynı ayarda, kırmızı boş (hedef hücreleri eksik) sadece CD47-CAR T hücreleri ile kontrol kuyuları ve yeşil sadece orta. Hata çubukları standart sapmadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> Şekil 5: GITR etki alanı EGFR-pozitif tümör hücre hatlarına karşı CAR T hücre sitotoksik aktivitesini artırır. (A) Farklı ARAÇ yapıları. (B) Farklı CAR yapıları için % sitolysis çubuk çizimleri 4 saat (sol) ve 24 h (orta). IFNγ üretimi sağda gösterilmiştir. (C) Tüm yapılar için sürekli öldürme değerlendirmesi. Siyah eğri sadece BxPC3 yumurtalık kanseri hücrelerinin büyüme eğrisidir. Yeşil eğri sadece T hücreleri ile tedavi hedef hücreleri, mavi eğri Mock CAR T hücreleri ile tedavi hedef hücreleri, kırmızı eğri EGFR-GITR-CD3-CAR T hücreleri ile tedavi hedef hücreleri, pembe eğri EGFR-ΔGITR-CD3-CAR T hücreleri ile tedavi hedef hücreleri, ve kahverengi eğri EGFR-CD3-GITR-CAR T hücreleri ile tedavi hedef hücreleridir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence gerçek zamanlı hücre analizi, etiketsiz koşullar altında ve birden fazla gün boyunca bağışıklık hücreleri tarafından kanser hücrelerinin öldürülmesini kantitatif olarak izlemenizi sağlar. Bu sistem, hedef oranları düşük etkili de çok sayıda yapı, efektör hücre tipleri veya kombinasyon tedavileri eşzamanlı tarama sağlayan hedef kanser hücresi öldürme tam bir zaman ders sağlar. 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit bir gecede kuluçka için 150 mililitrelik hücre kültürü çanak DMEM kültür orta yedi HEK293FT hücreleri 1,5 kez 10 tohumlama ile başlayın.Ertesi sabah, transfeksiyon seyreltme çözeltisi beş mikrogram lentiviral vektör plazmid DNA ve 22,5 mikrogram lentiviral ambalaj karışımı ile 2,5 mililitre transfeksiyon seyreltme çözeltisi transfeksiyon reaktif82,5 mikrolitre ile takviye transfeksiyon seyreltme çözeltisi 2.5 mililitre karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçkadan sonra, reaksiyon damlasını HEK293FT hücrelerinin kabına akıllıca aktarın ve hücreleri ikinci bir gece kuluçka için kuvöze geri döndürün. Ertesi sabah, supernatant taze DMEM kültür orta 19 mililitre ile değiştirin ve gece kuvöz hücreleri geri dönün.Çözeltiden herhangi bir hücre veya enkaz kaldırmak için ikinci sabah santrifüj ile lentivirus sedimenting önce dört derece Santigrat depolama için tek bir 50 mililitrekonik tüp içine supernatant toplamak. Ultra centrifugation için ultra net bir santrifüj tüp supernatant içeren lentivirus yaklaşık bir mililitre hariç tüm aktarın. Ultracentrifugation sonra, dikkatle supernatant içeren artık virüs aspire, yavaşça pelet dMEM 100 mikrolitre ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde tüp yerleştirin.Kuluçka sonunda, çözeltiyi hafifçe karıştırın ve lentivirus çözeltisini eksi 80 santigrat derecede depolamak için önceden soğutulmuş steril tüplere yerleştirin. Daha sonra üreticinin talimatlarına göre kantitatif RT-PCR ile lentivirus titresini belirleyin. CAR-T hücre üretimi ve genişlemesi için, hücre kültürü kuvözdeki 24 kuyulu bir plakanın bir kuyuda 24 saat boyunca eşit sayıda CD3/CD28 kaplı mikroboncuk içeren bir mililitre CAR-T hücre ortasında altı periferik kan mononükleer hücresine 1-2 kez 10'u etkinleştirin.Takip eden iki sabah, bir mikrolitre transdüksiyon arttırıcı ajanı hücrelerle karıştırın ve ardından beşe bir enfeksiyon adedinde lentivirus ilavesi ilave edin. T hücresi büyümesini her iki ila üç günde bir, hücreleri mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye 1-2 kat 10 oranında tutmak için gerekli olduğu kadar taze CAR-T hücre ortamı ekleyerek izleyin. Akış sitometrisi ile T hücre CAR ifadesini tespit etmek için, üç kez 10 beşinci CAR ve non-transduced T hücreleri bireysel 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine aktarın.Santrifüj ile hücreleri toplamak ve FACS tampon 200 mikrolitre içinde pelet resuspend 1% insan serumu ile takviye. Her hücre örneğini buz üzerinde tek tek beş mililitre likit polistiren FACS tüplerinde 100 mikrolitrelik aliquot'a bölün. Beş dakika sonra, her hücre tipinde bir tüpe biyotinylated FAB2 fab2 parçaları nın bir mikrolitresini ve her hücre tipinin diğer tüpüne iki mikrolitre PE etiketli anti-tag antikor ekleyin.Buz üzerinde 30 dakika sonra, taze FACS tampon üç mililitre ile hücreleri yıkayın ve supernatants decant santrifüj sonra. Kalan supernatant pelet resuspend ve Her tüp için APC anti-CD3 ve 7-AAD iki mikrolitre iki mikrolitre ekleyin. Anti-FAB2 antikor ile boyanmış tüp kısa karıştırma ile PE etiketli Streptavidin bir mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tüm tüpler inkübed.Kuluçka sonunda, t hücrelerini ileri dağılıma karşı yan dağılım ve CD3'e karşı 7-AAD ekspresyonuna göre gating standart protokollere göre akış sitometrisi ile hücreleri analiz edin. Gerçek zamanlı sitoksis potens analizi için, bir e-plakanın her kuyusuna 50 ila 100 mikrolitre hedef hücre kültürü ortamı ekleyin ve bir hücre analiz cihazındaki arka plan empedansını ölçün. Trippsin kullanarak kültür plakahedef kanser hücrelerini tespit edin.Taze kültür orta ve santrifüj 15 mililitre hücreleri yıkayın. Saymak için beş mililitre taze ortamda kanser hücresi pelet resuspend ve uygun hedef hücre konsantrasyonu için hücre yoğunluğunu ayarlayın. Kuyuların uygun sayıda hücreleri ekleyin ve hücrelerin kuyuların altına eşit yerleşmek için izin oda sıcaklığında 30 dakika e-plaka bırakın.Equilibasyon süresinin sonunda, plakayı gerçek zamanlı hücre analizörüne yerleştirin ve gece boyunca her 15 dakikada bir otomatik olarak empedans ölçümlerini başlatın. Hedef hücrelerin yapışmave çoğalması gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Ertesi sabah, efektör CAR seyreltmek ve tek tek tüplerde uygun konsantrasyona T hücreleri kontrol ve her kuyuda son hacmi 100 mikrolitre olacak şekilde e-plaka her kuyudan 50 ila 100 mikrolitre çıkarın.Daha sonra, efektör tohum ve uygun kuyularda kontrol T hücreleri uygun efektör de orta 100 mikrolitre de oranları iyi başına. Daha sonra hücre analiz sistemi için plaka dönmeden önce oda sıcaklığında 30 dakika e-plaka dengeleyin. Hedef kanser hücrelerinin T hücresi aracılı öldürme etkinliğini ölçmek için, 96 saat boyunca CAR-T aracılı öldürme izlemek.CAR-T hücrelerinin yaklaşık %50'si, T hücrelerinin yaklaşık %50'sinde CAR ekspresyonunu gösteren anti-tek zincirli değişken parça antikor için pozitif boyanmıştır. Bu temsili deneyde, tüm gruplar için 10'a bir efektör hedef oranı kullanılmıştır. Sadece Raji hücreleri ve CD22-CAR T hücresi raji hücrelerini tedavi eden sadece kontrol T hücresi ve Mock CAR-T hücre gruplarına göre önemli miktarda öldürme gösterdi.Bu deneyde, sadece CD47-CAR-T hücreleri pankreas kanseri hücrelerinin öldürülmesinde etkili oldu. Ayrıca, CD47-CAR-T hücrelerinden gelen empedans sinyali tek başına orta tek başına kuyularda ölçülen hücre indeksi sinyalinin sadece biraz üzerindeydi ve CAR-T hücreleri gibi süspansiyon hücrelerinden kaynaklanan empedans sinyalinin minimal olduğunu ve CAR-T hücreleri hedef kanser hücrelerine eklendiğinde genel empedans sinyaline katkıda bulunmadığını gösteriyordu. Özellikle, GITR co-uyarıcı etki daha epitel büyüme faktörü reseptör pozitif hedef hücreleri gitr etki alanı olmadan orijinal CAR yapıları ile karşılaştırıldığında CAR-T hücre öldürme artırılmasında etkili olduğu gözlenmiştir.E-plaka kuyularından orta alan, deney sırasında veya sonrasında sitokin profilini deney sırasında veya sonrasında zaman noktalarında analiz etmek için toplanabilir. Genel olarak, xCELLigence kombinasyon tedavileri immün kontrol noktası inhibitörleri için iki-spesifik T hücre meşgulve onkolitik virüsler arasında değişen çeşitli immünoterapilerin potens değerlendirme verimliliğini artırmıştır.

a-real-time-potency-assay-for-chimeric-antigen-receptor-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, gerçek zamanlı elektriksel empedans ölçümleri aracılığıyla kanser hücrelerine karşı CAR T hücresi aktivitesini izlemek için bir yöntemi göstermektedir. İmpedanstaki değişikliklerin izlenmesi, CAR T hücrelerinin kanser hücresi sitolizini indüklemedeki etkinliğini değerlendirir ve sitotoksik yetenekleri hakkında bilgi sağlar.

CAR T Hücrelerinin Gücünü Değerlendirmek için Gerçek Zamanlı İn Vitro Sitoliz Testi

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu...

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC'ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC'ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC'lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC) İn Vitro İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Keşfedin, kimerik antijen reseptör T hücrelerinin sitotoksisite potansiyelini değerlendirmek için gerçek zamanlı in vitro sitoliz analizi yöntemini. Bu teknik, hem sıvı hem de katı tümör hücrelerine karşı immünoterapi etkinliğini nicel olarak ölçer.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Daha fazla video keşfet