Name: Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Öğrenin, boyuna floresans mikroskobu ile kortikal nöronlarda tek hücre düzeyinde hayatta kalma izleme yöntemini. Bu protokol, nörodejeneratif hastalıklarda hücre ölümü mekanizmalarını anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Steve Finkbeiner ve üyeleri Finkbeiner lab robot mikroskobu öncü için teşekkür ederim. Biz de ilk yazılım görüntü işleme için gerekli ve sağkalım Analizi otomatik bina için Dan Peisach teşekkür ederim. Bu eser nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) R01-NS097542, Michigan Üniversitesi'nde Protein katlanır hastalığı girişimi ve Ann Arbor etkin ALS karşı için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Tüm omurgalı hayvan iş kullanımı ve bakımı hayvanlar Michigan Üniversitesi (iletişim kuralı # PRO00007096) Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyleri dikkatle hayvanlar kurban sayısını en aza indirmek için planlanmaktadır. Hamile kadın vahşi tipi (WT), transgenik olmayan uzun Evans fareler (Rattus norvegicus) ev sahipliği yaptığı tek başına çevre zenginleştirme ile donatılmış ve Michigan Üniversitesi'nde Laboratuvar hayvan Tıp (ULAM) için birimi tarafından yapılan bakım odalarında NIH destekli Rehberi uygun bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları. Bütün fareler için ötenazi, ötenazi Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi kurum ve Michigan Üniversitesi yönergeler önerileri ile tutarlı önce mümkün olduğunca az zaman tarafından ötanazi yöntemleri konut rutin tutuldu Türler yönergeleri.
1. malzeme hazırlama
<ol><li>19 – 20 fare pups ve kültür için 4 gün vitro, poli-D-lizin kaplamalı plakalar üzerinde mililitre başına 106 hücre x 0.5, kortikal nöronlar13,14daha önce açıklandığı gibi fare embriyonik günden kortikal nöronlar incelemek, 15,16,17,18,19.</li>
	<li>Plazmid DNA bir endotoksin-Alerjik plazmid DNA izolasyon tarafından anlatılan adımları takip ilgi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Bir spektrofotometre kullanarak sonuç DNA ölçmek.</li>
	<li>4 (DIV4), aliquot, filtre sterilize ve 37 ° c 6 mL, aşağıdaki ortam kuluçkaya tüp bebek günde 25 mL nöronal serum medya (RSM; örneğin., OptiMEM), düşük bazal medya (Koyulmus), 40 mL NBKY (Koyulmus + 1 mM kynurenic asit + 10 mM MgCl27 pH için ayarlanabilir,. 4), 10 mL NBC (Koyulmus + 1 x nöronal hücre kültür özel sayı + 1 L-glutamin takviyesi x + 1 kalem Strep x). Not: Listelenen birimler transfecting bir 96-şey plaka için yeterlidir. Malzemeler tablo belirli reaktifler için başvurun.</li>
</ol>2. sıçan kortikal nöronların transfection
<ol><li>Sağlanan örnek transfection sayfası değiştirmek (bkz. ek dosya 1) plaka tipi, plaka harita, DNA'lar, sayısını ayarlayarak DNA konsantrasyon ve wells (yeşil kutuları) sayısı. Not: Toplam DNA özetliyor şey, başına 0.2 µg için ne olursa olsun, ister bir (e.g., DNA'a) veya daha fazla (örneğin, DNA B ve C) DNA yapıları eklenir her şey için.</li>
	<li>Elektronik tablodan çalışan, RSM ve DNA uygun miktarda bir tüp içinde birleştirmek. RSM ve transfection reaktifi (örneğin, Lipofectamine) ayrı bir tüp uygun miktarda birleştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA ve transfection reaktif RSM karışımları birleştirin ve RT 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Bu kuluçka adımı sırasında bir çok kanallı pipet kullanın ve yıkamak için steril plastik kaplar hücreleri 2 x 100 µL Koyulmus kuyu başı ile. Klimalı ortam (CM) ayırma ve 37 ° C'de depolayın Bu ve aşağıdaki adımları için nöronlar havaya maruz zamanı en aza indirmek için özen gösterin.</li>
	<li>Koyulmus medyayı çıkarın ve NBKY kuyu başına 100 µL yerine.</li>
	<li>20 dk geçti sonra transfection reaktif/DNA karışımdan 50 µL dropwise her şey için ekleyin.</li>
	<li>Transfection reaktif/DNA komplekslerinde 37 ° C'de 20 dk için hücrelerle kuluçkaya</li>
	<li>2 x NBKY ile durulayın ve cm 100 µL ve NBC 100 µL iyi ücret ile değiştirin.</li>
	<li>Başarılı bir şekilde transfected hücreleri floresan mikroskopi transfection 16-24 h içinde tarafından görünür olmalıdır. Verimliliği ölçmek için floresan mikroskop transfection 37 ° C'de gecede kuluçka sonra denetlemek için kullanın. Not: Bu teknik bir genel transfection verimlilik % 5-10 içinde sonuçlanır.</li>
</ol>3. görüntüleme
<ol><li>Plaka motorlu bir sahne ile floresan mikroskop yer ve plaka yansıma her zaman hizalamak kullanıcının izin verir (örneğin, kalenin dibinde bir işareti) bir güvene kurmak. Bu başvuru için Mütevelli görüntüsünü kaydedin.</li>
	<li>İlgi alanına gidin ve x-y koordinatları göreli olarak güvene dikkat edin.</li>
	<li>Transfected hücreleri floresan bir etiket ifade üzerinde odaklanın.</li>
	<li>Floresan görüntü uygun kanal veya kanalları (örneğin, kırmızı floresan protein [RFP], yeşil flüoresan protein [GFP], ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), el ile veya otomatik bir şekilde alabilir. Düzenli aralıklı aralıklarla birkaç görüntü alarak, iyi bir montaj görüntü işleme sırasında birleştirilebilecek (bkz. Adım 4). Not: Boşluğu büyütme, optik mikroskop ve dedektör boyutu da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Genel olarak, optik aralığı bitişik görüntüler arasında arasında 90 – 95 oranında görüntü örtüşme küçük bir derece için izin ve hizalama özelliği için tek tek her görüntünün boyutunu olacak.</li>
	<li>Bu gerekli, özgün güvene kaydırılmasını sıklıkta her zaman adımları tekrarlayın. Sağkalım analizi için hücre tipi ve deneme amacı bağlı olarak her 6-24 h görüntüleme gerçekleşir.</li>
</ol>4. görüntü işleme
Not: Resim alma, işleme adımları bir dizi görüntü analizi önce gerekli. Bunlar, bunlarla dikiş, istifleme ve arka plan çıkarma (Şekil 1) için sınırlı değildir. Bir görüntü yığını veya hücreleri açıkça ayırt kendi arka plan ve birden çok kez puan üzerinden takip edilmesi kolay olan saat serisi oluşturmak için aşağıdaki adımları hedefidir. Adanmış bir FIJI makro (Image_Processing.ijm, ek dosya 2' ye bakın), temel dikiş, istifleme, gerçekleştirir ve arka plan çıkarma. Her adım ve görüntü işleme işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak parametreleri açıklaması tartışma bölümünde sağlanmıştır.
<ol><li>Ham veriler veya Şekil 2' de gösterilen biçimlendirmesiyle eşleşecek şekilde giriş dizini ayarlayın.</li>
	<li>Eğer zaman puan bitişik olmayan (örneğin, T1, T2, T3), klasörü yeniden adlandırın bu böylece bunlar olur. Image_Processing makro kaza değil emin olmak için kritik bir adımdır yığınlama sırasında.</li>
	<li>Açık bilgisayar programı, o zaman'ı tıklatın ve Image_Processing makro Fiji çubuğuna sürükleyin için Fiji simgesini çift tıklatın. Bu makro Fiji içinde açılacaktır.</li>
	<li>Giriş dizini içeren görüntüleri, istenen çıkış dizinini dikişli ve yığılı karakterler görüntüler için görüntüleme timepoints sayısı, floresan kanalları ve plaka biçimi belirtmek için Image_Processing makro 2-7 satırlık ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleri elde sırasını belirler. Bu test etmek için el ile bir montaj FIJI görüntülerin eklentileri damla aşağı yemek listesi | manevra tarafından dikiş Dikiş | Kılavuzu/koleksiyonunda dikiş. Doğru bir şekilde dikişli görüntü üretilen kadar açılan menüleri türü ve Düzen içinde ayarları.</li>
	<li>8 ve 9 bu seçimleri eşleşecek şekilde Image_Processing makro hatlarında GRID_TYPE ve STITCH_ORDER değişkenleri ayarlayın.</li>
	<li>İyi başına çekilen fotoğraf sayısı hat 10 Image_Processing makrosunda ayarlayarak belirtin. Not: Görüntüleri için bir 2 x 2 Montaj DIM bu satırı okur musunuz = 2.</li>
	<li>Arka plan çıkarma gerekiyorsa, satır 14 BGSUB Image_Processing makrosunda ayarlamak = true.</li>
	<li>Image_Processing makro içini kaplamak 15 ayarlayarak haddeleme topu yarıçapı ayarlayın. Not: En iyi sonuçlar için yarıçapı için en az ayarlayın çapı görüntüdeki en büyük ön plan nesnesinin.</li>
	<li>Image_Processing makro başlatmak için Çalıştır ' ı tıklatın. Bir kez başladı, Image_Processing otomatik olarak dikiş, istifleme ve arka plan çıkarma ilerler.</li>
</ol>5. hücre ölümü Puanlama
Not: Tartışma bölümünde daha fazla bilgi için bkz: skor hücre ölümü ve sansür üzerinde.
<ol><li>Görüntü yığınları Image_Processing komut dosyası tarafından üretilen bulun. Bunlar Fiji'de açın.</li>
	<li>Aracı gelin FIJI içindeki tek tek her hücre bir sayı ile etiketlemek için kullanın. Her noktası hücre tanımlayıcı ROI (bölge ilgi) Yöneticisi için katacak sonunda t tuşuna basın. Not: Tanımlayıcılar için etiketleri ve Tümünü göster onay kutularını ROI Yöneticisi'nde tıklatarak görüntülenmeyecektir.</li>
	<li>
Her görüntü yığını ve kaydına her hücre zaman ya ölür ya da Survival_spreadsheet.csv (bakınız ek dosya 3) dosyasında sansür gerekiyor timepoint timepoints yoluyla ilerleme.
	<ol>
<li>Her hücre nerede onun de karşılık gelen ve yatırım getirisi sayısı o kadar iyi içinde her hücre için benzersiz bir tanımlayıcı (kimlik) oluşan elektronik tablo, tek bir satır kaplar. tp_death bir hücre ölüm saat içinde gerçek zaman time_death temsil ederken yaşadığın için gözlenen son saat noktasıdır. Her hücre için bu veri girişi. Hayatta kalma kullanarak daha sonraki analiz için bu yapısını korumak için çok önemlidir. R (bkz. ek dosya 4). Not: hücre ölümü belirlemek için ölçütleri açısından büyük önem taşıyor ve hücre türüne bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Üç ana kriterler ölü nöronlar11,20 (Şekil 3) tanımlaması kullanılır: floresan yoğunluğu (örneğin, 69 s nöron 1) kaybı hücre vücut (örneğin, 188 s nöron 2) ve neurite kaybı yuvarlama bütünlüğü veya blebbing (örneğin, 188 s nöron 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaydı son sütununda hücreyi sansür durumunu. Not: Burada, kendine özgü biçimi nedeniyle sansür ele alınır sansürsüz hücreleri 1tarafından işaretlenmiş ise R, 0tarafından sansürlü hücreleri işaretlenir. Son zaman noktası yaşamak tüm hücreleri sansür ve bu nedenle 0işaretlenmiş unutmayın.</li>
</ol>6. Cox orantılı performans analizi ve görselleştirme sonuçları tehlikeleri
<ol><li>Gerekirse, https://cran.r-project.org/mirrors.html, R studio indirin.</li>
	<li>R studio açın ve hayatta kalmak için simgesini çift tıklatın. R komut dosyası.</li>
	<li>İmleci hayatta kalma hat 2. R ve hayatta kalma kütüphane yüklemek için ana R studio penceresinde Çalıştır düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Hat 5 hayatta kalma değiştirin. R dosyasının konumunu eşleşmesi için komut dosyasını Survival_spreadsheet.csv. Bir dataframe olarak hayatta kalma verileri yüklemek için Çalıştır ' ı tıklatın.</li>
	<li>8 ve 9 satırları vurgulamak ve Cox orantılı tehlikeler analiz gerçekleştirmek için R studio konsol penceresinde Çalıştır düğmesini tıklatın. Sonuçları ve çıkış istatistik R studio konsol penceresinde görünür.</li>
	<li>Satırları 12-16 hayatta kalma vurgulamak. R ve R Studio araziler sekmesinde görünür ölüm Arsa toplu riski üretmek için çalıştırma düğmesine basın. Bu dosyayı arsa üzerinde Aktar düğmesini tıklayarak kaydedilebilir.</li>
	<li>Bu bir Kaplan-Meier eğrisi olarak hayatta kalma verileri çizmek için arzu edilir eğer hatları 19-24 hayatta kalma vurgulayın. R ve çalıştırma düğmesine basın.</li>
</ol>

<ol><li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li>
<li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+assays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li>
<li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death%3A+a+common+mechanism+in+necrosis%2C+apoptosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible%2C+ischemic+liver+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li>
<li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li>
<li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li>
<li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li>
<li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li>
<li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+survival+analysis+using+Cox%E2%80%99s+regression+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multivariate survival analysis using Cox’s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li>
<li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, doğrudan tek hücre olarak nöronal hayatta kalma izlemek için metodoloji sunulur. Ayrık zaman puan ve hücre tüm nüfus için sınırlı olan geleneksel deneyleri aksine hücre ölümü için çeşitli faktörlere hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme, gibi sürekli değerlendirilmesi için bu yöntem sağlar ve nasıl her faktörü hücresel hayatta kalma ileriye dönük bir şekilde etkilediği belirleyebilirsiniz.
Bu metodoloji deneysel ihtiyaçlarını geniş bir dizi uyacak şekilde değiştirilebili...

Anormal hücre ölümü kanser, ateş ve kontur1de dahil olmak üzere birçok hastalığın sürüş bir faktördür. Hücre ölümü için güçlü ve hassas deneyleri genişleterek veya daraltarak hücresel hayatta kalmak için bu bozuklukların karakterizasyonu yanı sıra tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gereklidir. Şu anda hücre ölümü, doğrudan veya vekil işaretleri2Ölçme teknikleri düzinelerce vardır. Örneğin, hücre ölümü görsel yardımıyla seçerek ölü veya canlı hücre3leke hayati boyalar veya plazma zarı4,5,6 belirli fosfolipitler görünümünü izleme tarafından tespit edilebilir . Hücre içi bileşenleri veya hücresel metabolitleri hücresel dağılması üzerine medya içine serbest ölçülerini, hücre ölüm7,8için proxy olarak da kullanılabilir. Alternatif olarak, hücre canlılığı metabolik aktivite9,10değerlendirmek tarafından yaklaşık. Bu yöntemleri hücre survival değerlendirirken bir hızlı yol sağlar rağmen onlar uyarılar değildir. Her teknik kültürü tek tek hücreler ve hayatta kalma kendi benzersiz oranları arasında ayırt etmek imkansız rendering tek bir nüfus olarak gözlemler. Ayrıca, bu tür nüfus tabanlı deneyleri hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme dahil olmak üzere hücre ölümü için önemli olabilir faktörler ölçmek mümkün değildir. Birçok durumda, bu deneyleri ayrık zaman puan için sınırlıdır ve hücreler sürekli gözlem altında zaman içinde izin vermez.
Buna ek olarak, boyuna floresans mikroskobu doğrudan ve sürekli olarak bir tek hücre olarak11ölüm riski izler son derece esnek bir metodoloji var. Kısacası, boyuna floresans mikroskobu düzenli aralıklarla uzun bir süre hücre ölümü ve geliştirmek veya hücre ölümü bastırmak faktörler kesin tespitler izin, için izlenmesi gereken tek tek hücreleri binlerce sağlar. Kaidesi Yöntem geçici transfection veya hücre iletim flüoresan protein kodlama vektörleri ile içerir. Benzersiz yediemin ardından kurulan ve bu simgesel yapı ile ilgili olarak transfected her hücrenin konumu görüntü ve tek tek hücreler saat, gün veya hafta boyunca izlemek Kullanıcı sağlar. Bu görüntüleri ardışık olarak görüntülendiğinde, hücre ölümü floresan, Morfoloji ve parçalanma her hücre için ölüm zamanını atanması olanaklı kılmak hücre vücudun karakteristik değişiklikler tarafından işaretlenir. Hazard fonksiyonu tarafından belirlenen ölüm, hesaplanan oranı daha sonra nicelik arasında koşulları karşılaştırıldığında veya tekdeğişirli veya çok değişkenli Cox orantılı tehlikeler analiz12kullanarak hücresel özellikleri seçmek için ilgili. Birlikte, bu yaklaşımların oranları hücresel popülasyonlar arasında hücre ölümü ve hücre ölümü ve/veya hayatta kalma (Şekil 1) önemli ölçüde tahmin değişkenleri tanımlaması doğru ve objektif ayrımcılık etkinleştirin.
Bu yöntem her sonrası Mitotik hücre tür biçimleri kaplama çeşitli ve hayatta kalma izlemek için kullanılabilmesine rağmen bu iletişim kuralını transfecting ve fare kortikal nöronlar kültürlü bir 96-şey tabak içinde görüntüleme için koşullar anlatacağız.

<table><tbody><tr><td>Nörobazal Orta</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür Hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kinürenik Asit Hidrat</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>Poli D-Lizin</td><td>Kırlangıç</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Lysates veya birden fazla zaman noktalarda sabit hücreler topluluğu gerektiren standart sitotoksisite deneyleri, duyarlılık ve nöronal kaderini etkileyen faktörleri değerlendirmek için kapasitesi sınırlıdır. Bu deneyleri hücre ayrık zaman noktalarda ayrı nüfus gözlenmesi gerekir. Sonuç olarak, tek tek hücreleri prospektif ciddi puncta oluşumu veya protein mislocalization, gibi hücre altı olaylar hastalığın patojenik sürücüleri homeostatik yanıt olup ayrımcılık yeteneği sınırlı zaman içinde izlenemiyor, ya da sadece tesadüfi olaylar. Tek hücreli boyuna mikroskobu araştırmacı hayatta kalma nüfus arasındaki farklılıkları belirlemek ve nedensel ilişkileri gelişmiş hassasiyeti ile çizmek izin bu sınırlamalar üstesinden gelir. Bu video rehber tek hücreli hayatta kalma bir floresan protein marker ifade sıçan birincil kortikal nöronların ölçme deneyleri için temsil edici bir iş akışı açıklayacağım. Görüntüleyiciyi yüksek verimli transfections elde etmek, toplamak ve tek tek hücreler potansiyel izlemeyi etkinleştirme görüntüleri işlemek nasıl öğrenin ve nöron popülasyonları Cox orantılı tehlikeler analizi kullanarak göreli yaşama karşılaştırın.

Burada açıklanan transfection yordamı kullanarak, DIV4 sıçan kortikal nöronlar floresan protein mApple kodlama bir plazmid ile transfected. 24 saat sonrası transfection başlayarak, hücreleri floresan mikroskopi her 24 h 10 gün üst üste görüntüsü. Sonuç görüntüleri Şekil 2' de gösterildiği gibi düzenlenen sonra dikişli, yığılmış ve hücre ölümü (Şekil 1) attı. Şekil 3 gösterir bir zaman ders 3 temsilci...

Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Bu protokol, araştırmacıların hayatta kalma larını tek hücrebazında izlemelerine ve hücre ölümünü veya hayatta kalmayı önemli ölçüde öngören değişkenleri belirlemelerine olanak tanır. Konvansiyonel sitotoksisite tahlilleri hücre popülasyonlarını değerlendirmek ve bireysel hücreleri ayırt etme yeteneği eksikliği. Boylamsal mikroskopi, popülasyondaki her hücre için ölüm zamanının atanmasını sağlar.Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklar ve diğer durumlar için yeni tedavilerin değerlendirilmesi için uygundur. Bu yöntem nörodejeneratif koşullarda hastalık mekanizmaları keşfetmek için paha biçilmez kanıtlanmıştır, ve hücre ölümü ilgi olduğu diğer bozukluklara karşı eşit etkinlik ile uygulanabilir. Araştırmacılar gereksiz toksisite olmadan yeterli transfeksiyon verimliliği elde ile mücadele edebilir.Çok kanallı pipet ile pratik ve protokol aşinalık zaman içinde bu zorluk azalmalıdır. Mikroskopi doğal olarak görsel bir metodolojidir. Bu nedenle, tekniği okuma nın yanı sıra izleyerek daha kolay anlaşılabilir.Başlamak için, bir tüpte uygun miktarda azaltılmış serum media ve transfeksiyon reaktifini ve serum media ve DNA'yı ayrı bir tüpte birleştirin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında hem tüpler ve kuluçka içeriğini birleştirin.Kortikal nöronları her kuyuda 100 mikrolitre nöral bazal ortamla iki kez yıkamak için çok kanallı pipet ve steril plastik çukurlar kullanın. Ve şartlı medya ve diğer kalan ortamları 37 santigrat derecede saklayın. NBM'yi her kuyuda önceden hazırlanmış 100 mikrolitre NBKY çözeltisi ile değiştirin.20 dakika sonra, transfeksiyon reaktifi ve DNA karışımı nın 50 mikrolitrepipet her kuyuya damlacık. Hücreleri 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri NBKY çözeltisi ile iki kez durulayın.Daha sonra kuyulara 100 mikrolitre klimalı ortam ve 100 mikrolitre NBC çözeltisi ekleyin. Hücreleri görüntülemeye başlamak için, 96 kuyu plakasını floresan mikroskoba yerleştirin. Gelecekteki hizalama için bir başvuru olarak her plakaya özgü bir güven işareti kullanın ve bir görüntüyü gelecekteki başvuruiçin kaydedin.Ardından, ilgi alanlarına gidin ve işarete göre x ve y koordinatlarını kaydedin. Gelecekteki hizalama için bir başvuru olarak her plakaya özgü bir güven işareti kullanın ve bir görüntüyü gelecekteki başvuruiçin kaydedin. Son olarak, floresan etiketi ifade transfected hücreleri odaklanmak.Uygun floresan kanallarda düzenli aralıklarla birden fazla görüntü alın. Görüntü işleme ile başlamak için, Fiji simgesine çift tıklayın. Ardından, Fiji içindeki makroyu açmak için görüntünün alt çiziş makrosunu Fiji çubuğuna sürükleyin.Görüntünün iki ila yedi satırLarını metin protokolüne göre işleme makrosunu alt üst edin. Sonra, dikiş tıklayın ve sonra ızgara / toplama dikiş. Doğru dikişli bir görüntü üretilene kadar açılır menüler, tür ve sipariş teki ayarları ayarlayın.Bu seçimlere göre sekiz ve dokuzuncu satırlarda ızgara türü ve dikiş sırası değişkenlerini ayarlayın. Ardından, kuyu başına görüntü sayısını belirtmek için satır 10'u ayarlayın ve gerekirse arka plan çıkarma seçeneğini satır 14'e doğru ayarlayın. Yuvarlanan top yarıçapını metin protokolüne göre ayarlamak için satır 15'i ayarlayın ve Çalıştır'ı tıklatın.Son olarak, çıktı görüntü yığınlarını açın ve metin protokolüne göre ölü nöronları el ile tanımlayın. Verileri elektronik tablo dosyasına kaydedin. İstatistiksel analiz yapmak için, hayatta kalmak için simgeye çift tıklayın.R komut dosyası. İkinci satırı vurgulayın ve hayatta kalma kitaplığını yüklemek için çalıştır düğmesini tıklatın. Ardından, giriş elektronik tablosunu aramak için beşinci satırdaki yolu değiştirin ve çalıştır düğmesini tıklatın.Sekiz ve dokuz daki satırları vurgulayın ve Cox orantılı tehlike çözümlemesi gerçekleştirmek için çalıştır düğmesini tıklatın. 12-16 ve 19-24 arası satırları vurgulayın. Kümülatif ölüm riskini ve hayatta kalma verilerini Kaplan-Meier eğrisi olarak çizmek için çalıştır düğmesini tıklatın.Bu çalışmada, sıçan kortikal nöronlar floresan protein M elma kodlama bir plazmid ile dört gün sonrası kaplama transfected edildi. Transfeksiyon sonrası 24 saat, nöronlar floresan mikroskopi ile 10 gün üst üste her 24 saatte bir görüntülendi. Görüntü edinimi nin ardından görüntüler işlendi ve hücre ölümünü işaretlemek için sırayla incelendi.Her hücre için ölüm zamanı floresan, morfoloji ve hücre gövdesinin parçalanması değişiklikleri ile belirlendi. Mutant nöronların sağkalım verileri üzerinde yapılan cox orantılı tehlike analizi 2.2 tehlike oranı ile sonuçlandı. Bu sonuç, vahşi tip popülasyona kıyasla mutant nöronlarda daha hızlı bir ölüm oranı gösterdi.Bu yordamı çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, dikkatli bir şekilde borulamaktır. Hava maruziyetini en aza indirmek ve kabarcıklardan kaçınmak başarılı bir transfeksiyon için çok önemlidir. Transfeksiyondan sonra, uzunlamasına floresan mikroskobu hücre sağkalım ek olarak, protein lokalizasyonu, ciro ve ifade düzeyi de dahil olmak üzere hücre ölümüne katkıda bulunabilir çeşitli faktörlerin izlenmesi için kullanılabilir.Nöro dejenerasyon alanında, uzunlamasına mikroskopinin dinamik doğası, hastalıkla ilişkili proteinlerin toplanmasının toksik veya koruyucu bir olayı temsil edip etmediğine ışık tutmuştur. Bu reaktiflerin veya aletlerin hiçbiri tehlikeli değildir.

monitoring-neuronal-survival-via-longitudinal-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz uzun bir süre boyunca floresan mikroskobu ile yaşam nöronlar mitokondri görüntüleme sağlayan bir protokol açıklar. Uzun süre üzerinden Görüntüleme mitochondrially hedef floresan protein ve laboratuvarımızda tasarlanmış ve inşa edilmiştir ucuz bir sahne top inkübatör kullanımı lentivirüs aracılı ifade aracılığıyla gerçekleştirilir.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Kaynak: Krishnamurthy, K. et al. Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum biyosensörünü ifade eden ALS mutant nöronlarındaki sinaptik aktiviteyi izlemek için gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Nöronal sinaptik aktiviteyi yansıtan hücre içi kalsiyum seviyelerindeki gerçek zamanlı değişiklikleri ölçmek için nöronları görüntüleme, kalsiyum dinamiklerini...

Amyotrofik Lateral Sklerozun İn Vitro Modelinde Sinaptik Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Yaşlanmada hücre içi Ca2+ yeniden şekillenmesi, Ca2+ aşırı yükünün aracılık ettiği süreçler olan eksitotoksisiteye ve nöron hasarına katkıda bulunabilir. Bu çalışmada, bir nöronal yaşlanma modeli olan sıçan hipokampal nöronlarının uzun süreli kültürlerinde sitozolik ve mitokondriyal Ca2+'nın floresan ve biyolüminesans görüntülemesi kullanılarak yaşlanan beyinde Ca2+ yeniden şekillenmesini araştırmayı amaçladık.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Öğrenin, boyuna floresans mikroskobu ile kortikal nöronlarda tek hücre düzeyinde hayatta kalma izleme yöntemini. Bu protokol, nörodejeneratif hastalıklarda hücre ölümü mekanizmalarını anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için değerli bilgiler sunar.

Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

Daha fazla video keşfet