Name: Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Keşfedin, ışık sayfalık mikroskobu kullanarak fare modelinde akciğere yönelen insan lenfositlerinin görüntülenmesi ve kantifikasyonu. Bu yöntem, alerjik iltihaplanma koşullarında T hücresi akciğer göçünü incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar DFG işbirlikçi araştırma merkezleri SFB 1181 ve TRR 241 tarafından finansman minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. Optik görüntüleme Merkezi Erlangen (anlatım) ve belirli Ralf Palmisano, Philipp Tripal ve Tina Fraaß (proje Z2, DFG CRC 1181) ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme için uzman teknik destek için kabul vardır.

M.F. Neurath Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda ve Boehringer için bir danışman olarak hizmet vermiştir. Kalan yazarların herhangi bir çatışma açıklanmaz.

Burada açıklanan deneysel ayarı içinde vitro yapışma ve kemotaksisi birincil insan bağışıklık hücreleri içinde vivo inflamatuar koşulları ve böylece relevantly tamamlar altında akciğer izleme kapasitesini klasik izlemek için fırsat gerçekleştirilen sağlar deneyleri. Akciğer hesap belirli anatomik organ özellikleri almak için bağışıklık hücre (dahil kemotaksisi ve hücre dağıtım hedef organ içinde) yanı sıra klinik önemi ve lisans alınan veri transferi homing önemli yönlerini aldık Üç teknik an...

Klasik enflamatuar bozuklukları gibi Alerjik astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akciğerin Akciğer doku1,2aktive lenfositler artan bir işe tarafından yönlendirilmesi için bilinen. Lenfosit yayımlanan sitokinler (örneğin, Il-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN γ ve TNF-α) daha fazla kemotaksisi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücrelerinin desteklemek, fibrotik hava yolu remodeling teşvik veya doğrudan zarar akciğer parankimi2. Şimdiye kadar akciğer dokusu içinde lenfositler patolojik birikimi sorumlu temel mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılır değil. Gut ve cilt giriş için açıklanan doku-seçici T hücre sürecinden için cümle içinde pulmoner dendritik hücreler (DC) üzerinde Periferik T hücre için tercihli akciğer infiltrasyonu, en azından kısmen CCR4 ifade indüksiyon yoluyla Başbakan belli ki edebiliyoruz yüzey lenfositler3. CCR4 yanı sıra, hava yolu infiltre T hücreleri da Kemokin reseptörlerinin CCR5 ve CXCR3 T hücrelerinin periferik kan1,4,5içinde karşılaştırıldığında özellikle artan bir ifade ile karakterizedir. Genel olarak, varolan veri akciğer posta fizyolojik veya inflamatuar koşullar altında T lenfositlerin farklı Kemokin reseptörleri ve onların anılan sıraya göre ligandlar, içerir ve bu nedenle en önemlisi üzerinde bağlıdır konsepti ile tutarlı bir yakından Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri1arasında işbirliği kontrol. Özellikle, patojen veya alerjen pozlama başlangıç aşamasında TLR stimülasyon veya derhal serbest bırakılmasını LTB4, CCL1, CCL17 gibi farklı chemoattractants tarafından IgE aracılıklı cross-linking doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin yanıt, CCL22, CCL20, CXCL10 ve PGD21,6,7. Bir ilk örnek olarak PGD2 chemoattractant reseptör etkileşimini CRTh2 kemotaksisi Th2 hücrelerinin için özel öneme sahip olduğu bilinmektedir ve böylece astım klinik yönetim olarak umut verici terapötik hedef ortaya çıktı. Gerçekten de, orta astımı olan hastaların bir iyileşme belirtileri ve tedavi sonrası bir saniye (FEV1) zorunlu Ekspiratuar hacminin önemli bir artış ile plasebo grubu8 ' e göre bir seçici CRTh2 antagonisti gösterdi ,9. Bir daha ilerledi inflamatuar yanıt, zaten işe T hücreleri daha da pulmoner lenfosit birikimi yolu ile belgili tanımlık serbest bırakmak Il-4 ve IL-13 olarak güçlü bir çekim gücü pulmoner DCs için yükseltmek mümkün durumdadır. Daha sonra bu elde edilen Miyeloid doğuştan gelen hücreler yukarı-CCL17 ve CCL22 ifade STAT6 bağlı bir şekilde1,10,11düzenler.  Açıklanan senaryo karmaşıklığı hala T hücre akciğer homing tam bir anlayış engel rağmen enflamatuar veya Alerjik göğüs hastalıkları potansiyel olarak en iyi duruma getirilmiş bir tedavi kontrolü için moleküler hedeflerin bir bolluk sunmaktadır. Bu nedenle, daha da derinleştirmek ve bilgimizi T hücre kemotaksisi ve akciğer posta alanında tamamlayıcı edebiliyoruz yenilikçi deneysel teknikleri acil ihtiyaç yoktur.
Akciğer posta lenfositler insan vücudu içinde birden çok hücresel, humoral ve fiziksel parametrelerini1tarafından etkilenir nedeniyle gerçeğini, varolan deneysel yöntemlerin çoğu immünolojik bu işlem tüm karmaşıklığına modellemek mümkün değildir. Bunun yerine, seçmeli olarak homing akciğer analizi için birçok standart protokolleri belirli bir yönü lenfosit cazibe, adezyon, geçiş ve kalıcılık çağlayan dahil odaklanmak. Yanı sıra tamamen tasvir tayini periferik veya akciğer infiltre lenfositler üzerinde integrinler ve Kemokin reseptörlerinin mRNA veya protein ifade deseni ve kan, ilgili Kemokin düzeyleri tamamlayıcı ölçümü bronchoalveolar lavaj (BAL) ya da akciğer doku12,13,14,15, köklü in vitro hücre kültürü deneyleri lenfosit yapışma veya kemotaksisi işlevsel bir karakterizasyonu izin ver üzerine deneysel koşullar16,17,18tanımlı. Prensip olarak, statik içinde vitro yapışma deneyleri bir endotel monolayer veya rekombinant endotel adezyon molekülleri (örneğin, MAdCAM-1, VCAM-1), kaplamalı cam slaytlara kültürlü lenfositlerin Bağlama kapasitesi standart tüp bebek izlemek kemotaksis deneyleri genellikle bir transwell sistemi19Kemokin Gradyanda birlikte geçirmek için yeteneği lenfositlerin ölçmek için uygulanır. Tüp Bebek her iki ayar kontrollü ayarlama ve modülasyon deneysel koşullar etkinleştirir ancak öte yandan önemli değişkenler eleştirel içinde vivo kemotaksisi ve lenfositlerin adezyon etkisi bilinen eksikliği. Ağırlıklı olarak, statik hücre kültürü deneyleri kalıcı kan akışı19 tarafından neden kesme Kuvvetleri etkisi göz ardı ve potansiyel olarak çevredeki immünolojik çevre ve etkileşen lenfosit bağışıklık hücreleri katılımı ihmal, ikisi de canlı bir organizma. Bu sınırlamalarının üstesinden gelir için statik tüp bebek kemotaksisi veya bağlılık deneyleri içinde alınan sonuçları yorumlanması gerekir daha fazla doğrulama dinamik yapışma deneylerde akışı koşulları20,21 altında ve inç içinde vivo modelleri inflamatuar organ patoloji19. Gerçekten de, önemli sonuçlara T hücre akciğer iltihabi veya Alerjik koşullarda homing düzenlenmesinde hayvan çalışmaları çekilmiş olabilir genetik analiz tanımlanmış modeller farklı göğüs hastalıkları3, farelerde değiştirilme tarihi 22 , 23. köklü ve genel olarak kullanılan bir araç belirli hücresel etkisini tanımlamak için belirli bir gen ilgi temsil ettiği için wildtype fareler ve fareler bir eksikliği olan arasında lenfositler infiltre akciğer nicel karşılaştırılması yollar veya hastalık odaklı model T hücre dağıtım üzerinde reseptörleri. Ancak, aksine in vitro hücre kültürü deneyleri, tartışılan önce klasik hayvan modelleri alan bir çalışma tasarım analiz ve birincil insan T hücreleri doğrudan kan veya hastaların bir inflamatuar akciğer acı BAL elde izlemek için yeteneği yoksun hastalık. Böylece, işlevsel olarak bir tanıyla belirtilen akciğer hastalığı için tercihli akciğer tropism ve ne kadar klinik parametreler bu senaryo üzerinde etkisi olabilir insan lenfosit Künye mümkün olup olmadığını doğrulamak için zorlu kalıyor. Son zamanlarda, çok zarif bir içinde vivo yaklaşım bağlamında bu sınırlamaların çoğunu aşmak başardı ve bağırsak lenfosit24 homing üzerinde gelişmiş translasyonel çalışmalar için yeni yollar açtı, iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD), tanıtıldı . Solvent bazlı doku takas kesitsel ışık sayfalık Floresans mikroskobu güçlü görüntüleme aracı olarak ardından protokollerde yararlanarak, infiltrasyon ve dağıtım adoptively transfer edilen insan T hücrelerinin görselleştirmek mümkün colitic immünyetmezligi fareler24bağırsaklarda. Özellikle, uygulanan bu deneysel ayarı iki ana yenilikler: (1) birincil insan bağışıklık hücreleri analiz deneysel olarak tanımlanmış içinde vivo koşullarda; (2) bir büyükçe alanı hastalıklı organ (yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm) 3D-imar tarafından takip yüksek çözünürlük kalitesinde görüntüsü. Ayrıca, birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda başarılı solvent bazlı doku takas ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu kullanımı gelişmiş akciğer25,26görüntüleme için önemli araçlar olarak kurdu. Bu teknolojik ilerlemeden pulmoner İmmünoloji alanında faydalanmak için şimdi akciğer posta analiz için sistem evlat edindik.
Burada sunulan Protokolü nasıl arındırmak ve fluorescently birincil insan T transfer içine indüklenen akciğer iltihabı ile fareler için hücreleri ve ayrıca, ışık sayfalık sonraki süreci ayrıntılı olarak açıklayan etiket adım adım bir giriş niteliğindedir. Floresans mikroskobik görüntüleme, organ hazırlık ve görüntü işleme de dahil olmak üzere. Genel olarak, karmaşık, ama yine de mümkün, deneysel model insan lenfosit akciğer posta içinde vivo koşulları üzerine izleme tanıtarak enflamatuar veya Alerjik akciğer hastalıkları alanında gelecek translasyonel çalışmaları desteklemek umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Agarose NEEO Ultra</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFlour594 anti-insan CD45 antikoru</td><td>BioLegend, San Diego, ABD</td><td>304060</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>K2981</td><td></td></tr><tr><td>Kanül 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, ABD</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Hücre proliferasyon boyası eun670</td><td>eBioscience Inc., San Diego, ABD</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, insan</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (etilendiamintetraasetik asit)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum-EDTA kan alma tüpü, 9 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>21066001</td><td></td></tr><tr><td>Ethly cinnamate (ECi)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya</td><td>112372-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol & %99,5 (EtOH)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>5054.3</td><td></td></tr><tr><td>FBS (fetal sığır serumu) Good Forte</td><td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Almanya</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 100 ve mikro; m&nbsp;</td><td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Almanya</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Görüntü Analiz Yazılımı 9.0.2</td><td>Bitplane AG, Zürih, İsviçre</td><td>n.a.ImspectorPro</td><td></td></tr> <tr><td>yazılımı</td><td>Abberior Instruments GmbH, G&ouml; ttingen, Almanya</td><td>n.a.Ketamin</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya</td><td>3617KET-V</td><td></td></tr><tr><td>LaVision UltraMicroscope II</td><td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Almanya</td><td>n.a.MACS</td><td></td></tr> <tr><td>MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Multifly kanül 20 G</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>851638035</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğne</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Almanya</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Almanya</td><td>C-1003</td><td></td></tr><tr><td>Pattex Tutkal</td><td>Henkel AG & Co, D&uuml; sseldorf, Almanya</td><td>PSK1C</td><td></td></tr><tr><td>LS sütunu</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Lenfosit Ayırma Ortamı (Yoğunluk 1.077 g/mL)</td><td>anprotec</td><td>AC-AF-0018</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Merck</td><td>1,071,440,025</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (fosfat tamponlu tuzlu su)</td><td>Biochrom GmbH, Berlin, Almanya</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-insan CD4</td><td>BioLegend, San Diego, ABD</td><td>317428</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 fare IgG2b, &kappa; izotip Ctrl</td><td>BioLegend, San Diego, ABD</td><td>400337</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehit)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>0335.1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidrojen karbonat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet 10 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>86.1254.001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 1 mL</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Almanya</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 5 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, ABD</td><td>260067</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 20 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, ABD</td><td>260069</td><td></td></tr><tr><td>Tüp 1.5 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Tüp 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72.695.400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tüp 2 mL, kahverengi</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72.695.001</td><td></td></tr><tr><td>Tüp 15 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tüp 50 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separatör</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (Rompun 2%)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya</td><td>KPOBD32</td><td></td></tr></tbody></table>

akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Son derece aktif bağışıklık hücreleri doku birikimi ezici çeşitli kronik inflamatuar hastalıklar damgasını temsil eder ve çekici bir terapötik hedef etkilenen hastaların klinik yönetim olarak ortaya çıktı. Daha fazla patolojik olarak dengesiz doku infiltrasyonu pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri tedavi düzenlenmesi nişan stratejileri iyileştirmek amacıyla bu gelişmiş anlayışlar içine hastalık ve organ özel ulaşmak için özellikle önem olacak Periferik lenfositler izleme özellikleri. Burada açıklanan deneysel protokol fluorescently etiketli ve adoptively transfer edilen insan lenfosit bağlamında papain kaynaklı akciğer iltihabı, akciğer birikimi izlemek için izin verir. Bağışıklık hücre göç ve kemotaksisi analizi için sık kullanılan standart tüp bebek deneyleri aksine şimdi tanıtılan içinde vivo hesap akciğer özgü yönlerini doku organizasyon ve karmaşık inflamatuar etkisi çıkar canlı fare organizma meydana senaryo. Ayrıca, üç boyutlu kesit ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme sadece Nicel veri bağışıklık hücrelerinin infiltre sağlamaz ama aynı zamanda bağışıklık hücre yerelleştirme iltihaplanmış akciğer içinde desen gösteriyor. Genel olarak, biz yüksek değeri sağlanan adım adım iletişim kuralı takip ederek kolayca uygulanabilir kronik inflamatuar akciğer hastalıkları alanında immünolojik araştırma için yeni bir teknik tanıtmak edebiliyoruz.

Sunulan Protokolü izleme ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu ile akciğer adoptively transfer edilen insan T lenfositler birikimi miktarının sağlar bir deneysel fare modeli açıklar. Resim 1 A deneysel zamanlama içinde vivo adımlardan şematik bir genel bakış sağlar. Güvenilir sonuçlar sağlamak için o izole ve fluorescently iyi kalite sağlamak için önemli önemi insan CD4 etiketli+ T hücreleri, daha sonra fareler aktarılır. Şekil 1<stro...

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Tekniğimiz in vivo inflamatuar koşullarda akciğer birikmiş insan bağışıklık hücrelerinin kesin görüntüleme T hücre akciğer homing sürecine heyecan verici anlayışlar sağlayan sağlar. Bu protokol, T hücreli akciğer homing üzerine çeviri araştırmadestekler ve böylece inflamatuar veya alerjik akciğer hastalıklarının optimize edilmiş bir tedavi için yeni hedeflerin belirlenmesinde yardımcı olabilir. Özellikle hastalığa özgü immün hücre özellikleri, pulmoner doku organizasyonu ve inflamatuar ortamın T hücre liakciğer homing üzerindeki etkisini göz önünde bulundurma yeteneği bu yöntemi son derece avantajlı kAlmıştır.Genel olarak, tekniğimiz kronik inflamatuar akciğer hastalıkları alanında immünolojik araştırma için yüksek değer, genellikle aktif bağışıklık hücrelerinin ezici bir doku birikimi tarafından tahrik edilir. En az 16 gram, altı haftalık, anestezik C57 siyah 6J fare de parmak sıkışma yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, yavaş yavaş farenin bir burun deliği içine taze hazırlanmış papain çözeltisi 10 mikrolitre teslim etmek için bir micropipet kullanın üç gün üst üste. Son papain uygulamasından bir gün sonra, insan periferik kanı altında 10 mililitre Ficoll ortamının tabakası, merkezleme ile yoğunluk gradyan ayrımı için PBS'de bir ya da iki oranında önceden seyreltilmiş sağlıklı bir gönüllüden elde edilir.Periferik mononükleer kan hücresi veya PBMC interfaz tabakasını yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve santrifüj ile hücreleri toplayın. Daha sonra, üreticinin protokolüne göre CD4 pozitif hücrelerin manyetik mikrop izolasyon gerçekleştirin. Boncuk izole CD4 pozitif T hücrelerinin pbs konsantrasyonunun en az 500 mikrolitre başına yedinci T hücrelerinin bir katına kadar on katına kadar yeniden askıya alınması.Hücreleri uygun bir kırmızı ışık uyarılabilir hücre çoğalması boyasıyla 37 santigrat derecede 10 dakika etiketleyin. Kuluçka sonunda, beş cilt RPMI orta ile beş ciltlik etiketleme reaksiyonunu %10 FBS ile buz üzerinde beş dakika boyunca durdurun ve ardından orta daki üç yıkAyım. İnsan CD4 pozitif T hücrelerinin papain maruz kalan alıcı farelere benimsenmesi için, floresan etiketli T hücrelerini PBS'deki mililitre konsantrasyonbaşına 10 kat 10'a kadar askıya alın ve 100 mikrolitre hücreyi alıcı hayvan başına 30 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin, sonra bir şırıngadan kuyruk damarına tüm hücre hacmini enjekte edin. hücre süspansiyon taburcu önlemek için hücre tesliminden beş saniye sonra.Kabul hücre transferinden üç saat sonra, her ötanazi li farenin sağ ventrikülünü bir katetere bağlı 21 kalibrelik kanülle delin ve sol ventrikülde bir kesi yapın. Yavaş yavaş beş milimolar EDTA ile takviye buz gibi PBS 20 mililitre ile akciğer perfuse buz gibi iki mililitre 4% paraformaldehit. Tüm fiksatif doku yoluyla temizlenmiş zaman, tükürük bezleri kaldırmak ve bir forceps hava tüpü dokusu ortaya çıkarmak için trakea altında kaydırılmış izin sternal hyoid kas kesti.Dokuda daha fazla hasar oluşmasını önlemek için iğneyi künt 30 kalibrelik bir kateterle değiştirmeden önce 30 kalibrelik bir iğneyle maruz kalan trakeanın ilk delinmesini gerçekleştirin. Yerleştirilen kateter ve trakea arasındaki kavşağı mühürlemek için bir iğne tutucu kullanın ve akciğer tamamen açılıncaya kadar hava yollarını yaklaşık 37 santigrat derece %0,75 agarose ile dikkatlice doldurun. Kateter ve trakea arasında sıkı bir kavşak, akciğerin fizyolojik boyutuna genişlemesi ve görüntüleme için doku mimarisinin korunması açısından kritik öneme sahiptir.Agarose tamamen katılaşmış olduğunda, kateteri çıkarın ve dikkatlice% 4 paraformaldehdye ile dolu karanlık, iki mililitrelik tüp içine akciğer aktarın. Daha sonra, dakikada 31 rotasyon ve kuluçka başına dört saat boyunca belirtildiği gibi dört santigrat derece sürekli rotasyon altında sıralı etanol kuluçka ile doku dehydrate. Tam dehidratasyondan sonra, doku yarı saydam görünene kadar oda sıcaklığında bir gecede kuluçka için eti cinnamate içine örnek aktarın.Hafif bir floresan mikroskopi için, akciğeri mikroskopun numune tutucuya yapıştırmak ve akciğer lobunu düpedüz bir pozisyonda tutucuya ayarlamak için küçük bir damla organik çözücü kararlı tutkal kullanın. Numune tutucuyu odasına yerleştirin ve deney için uygun lazerleri cihaz yazılımında seçin. Daha sonra, optik altında kaydırıcıları kullanarak tüm organı veya belirli bir ilgi bölümünü düzgün bir şekilde ortaya getiren sayısal diyafram açıklığını belirleyen bir sayfa genişliği ayarlayın.Seçilen her lazer için lazer iletim kontrolü altında lazer yoğunluğunu ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın ve Uygula'yı tıklatın. Homojen bir şekilde aydınlatılmış görüntü oluşturmak için sol ve sağ ışık yapraklarını birleştirmek için Gelişmiş ölçüm ayarlarını kullanın. Z yığınının başlangıç ve bitiş konumlarını tarayın aralığı altında ölçülecek şekilde tanımlayın ve adım boyutunu beş mikrometreye ayarlayın ve ardından dosyaları otomatik olarak kaydetmek için otomatik kaydetme'yi seçin ve görüntüleri yakalamak için ölçümü başlatın.Tüm görüntüler elde edildiğinde, 3B görüntüleme sonrası analiz yazılımındaki Aşma düğmesini etkinleştirin ve seçilen Z yığınının diğer tüm görüntülerinin açılışını ve otomatik 3D rekonstrüksiyonunu başlatmak için ilk görüntüyü bir Z yığınından yükleyin, ardından Ekran Ayarlaması altında, her kanal için yoğunluğu, siyah düzeyi ve kontrastı ayarlayın. Farklı örnekler arasında pulmoner doku içinde insan hücrelerinin birikimini karşılaştırmak için, belirli bir hacim ile bir akciğer küpü tanımlamak için Edit ve Kırpma 3D seçin. Tanımlanan akciğer küpündeki etiketli hücreleri ölçmek için araç çubuğuna Yeni Noktalar Ekle'yi açın, otomatik oluşturmayı atla'yı tıklatın, el ile düzenle'yi tıklatın ve 640 nanometre kanalını seçin.Yarıçap ölçeğini 10,00 mikron olarak ayarlayın, Seç'i tıklatın ve Edit'in altında, her floresan hücreyi bir noktayla tek tek işaretlemek için sol fare düğmesiyle Shift tuşuna basın. Sayılan hücrelerin toplam sayısı istatistiklerde görüntülenir. Bir görüntüyü yakalamak için anlık görüntü aracını kullanın ve bir video çekmek için animasyon aracını kullanın.Mikrobead bazlı hücre zenginleştirme ve daha sonra floresan etiketleme tipik olarak en az% 95 bir CD4 pozitif saflık ve akış sitometri tarafından belirlenen bu hücrelerin başarılı bir etiketleme neden gösterir. Etil cinnamate bazlı doku temizleme başarılı bir kırılma indeksi eşleştirme gösteren organ şeffaflık yüksek düzeyde elde eder. Akciğer dokusunun otofloresan sinyali, ortalama yoğunluk projeksiyonu olarak veya yüzey modunda görüntülenebilen ışık sayfası mikroskobu ile akciğerin anatomik yapısını görüntülemek için yararlı bir araç sunar.Konvansiyonel mikroskopi ile karşılaştırıldığında, ışık sayfası mikroskopi tüm organ görüntüleme ve daha sonra 3D rekonstrüksiyonu, proliferasyon boya etiketli, aktarılan insan T hücrelerinin tüm organ bağlamında tanımlanması ve görselleştirilmesi sağlayan avantajı sunuyor, ayrıca, papain maruz hayvanların iltihaplı akciğer dokusu içinde seçici birikimi için transfer insan T hücrelerinin tercihi insan CD4 pozitif T hücreleri hayvanların bağırsak alıcı dan elde edilemez gerçeği ile daha da desteklenir. Farklı koşullar arasında insan CD4 pozitif T hücrelerinin pulmoner birikiminin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması için, etiketli hücreler de gösterildiği gibi tanımlanan hacmin çeşitli akciğer küpleri sayılabilir. Akciğer perfüzyonu, şişirme ve doku temizleme gibi dikkatli doku hazırlama, yüksek çözünürlüklü ışık sayfası mikroskobik görüntülerin optimize edilmiş üretimi için son derece önemlidir.Aktarılan insan lenfositlerinin başarılı diyadiklerini doğrulamak için, bu protokol kolayca minrik bronkoalveoler lavaj içinde insan lenfositlerin akış sitometrik nicelik ile kombine edilebilir. In vivo koşullarda bireysel hastalardan elde edilen bağışıklık hücrelerini izlemek için yeteneği belirli bir hastalık veya tedavi tarafından baskılı bağışıklık hücrelerinde fonksiyonel değişikliklerin belirlenmesini destekler.

advanced-imaging-lung-homing-human-lymphocytes-an-experimental-vivo

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı...

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

İntravital floresan mikroskopi, lökosit-endotel etkileşimlerini ve kılcal perfüzyonu gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir akciğer görüntüleme sistemi kullanarak pulmoner mikrosirkülasyondaki bu parametreleri görüntüleme ve ölçme yöntemlerini açıklar.

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) kardiyak hasarın üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu, ilişkili hastalığı etkileyen paternlerin aslına uygun olarak ölçülmesini ve birlikte lokalizasyonunu sağlar. Burada, kardiyak hasarın, risk altındaki alanın ve bağışıklık hücresi tepkisinin eşzamanlı ölçümü için otomatikleştirilebilir bir ışık tabakası kılavuzluğunda görüntüleme yaklaşımı sağlanmıştır.

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

Keşfedin, ışık sayfalık mikroskobu kullanarak fare modelinde akciğere yönelen insan lenfositlerinin görüntülenmesi ve kantifikasyonu. Bu yöntem, alerjik iltihaplanma koşullarında T hücresi akciğer göçünü incelemek için değerlidir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş (Video) | JoVE Journal

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Daha fazla video keşfet