Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

Bu protokolün amacı kültür bağırsak mikrobiyota in vitro etmektir. Bu modern bir bileşenin katkısını dikkate almak zorunda kalmadan mikrobiyota dinamikleri çalışma için izin verecektir. Bu çok aşamalı in vitro sistemi kullanarak, biz lumin geliştirmek için mikrobiyota topluluk saymak ve kolon çok bölgelerin mukozal üzerinde aynı anda başlatılabilir.

Bu yöntemin görsel bir gösteri bu in vitro sistemin karmaşıklığı nedeniyle yararlıdır. Tanımlanan orta 500 mililitre ile yükselen kolon doldurarak başlayın, tanımlanan orta 800 mililitre ile enine kolon, ve tanımlanan orta 600 mililitre ile azalan kolon. Reaktörün hacmiile orantılı bir miktarda kolon bölgelerine müsin tarım taşıyıcıları ekleyin ve her reaktörden fazla tanımlı ortamı çıkarmak için numune tüpünü ve şırıngayı kullanın.

Her reaktördeki pH'ı ayarlamak için pH problarını kullanın. Ve nitrojen floşu20 dakika aç. Daha sonra, fekal homojen numune ile 60 mililitrelik bir şırınga yüklemeden önce üreticinin yönergelerine göre dışkı homojen eritin.

Daha sonra, pH kontrolü ile bir gecede kültür için her reaktör hacminin% 5 eşit homojen bir miktar ile örnek liman aracılığıyla her kolon reaktör aşılamak. Ertesi sabah, her biyoreaktörün örnek portundaki luer kilidini alkolle temizleyin. Bağlantı noktaları kuruduğunda, tüm havadan temizlenen 30 mililitrelik şırıngayı numune bağlantı noktalarından birine bağlayın.

Biyoreaktörden kültürün süpernate'inin 15 mililitresini azarlamadan önce gemi bileşenlerinin iyice karıştırılmasını sağlamak için pistonu 3-5 kez çekin. Daha sonra parlak örneği steril bir Falcon tüpüne aktarın ve buzüzerinde yerleştirin. DNA analizi için, beş mililitrelik bir şırınga kullanarak 1-3 mililitre luminal sıvı toplayın.

Aynı şekilde diğer biyoreaktörler supernate formu toplamak. Kısa zincirli yağ asidi analizi için numune malzemesini bir kenara koymak için, 15 mililitre lik ilgi örneğini santrifüj edin ve şırınga filtresi eksi 80 santigrat derece depolama için 0,2 mikrometrelik gözenek filtresinden geçirin. DNA analizi için örnek malzemeyi ayırmak için, bir mililitre parlak sıvıyı santrifüj edin ve peleti eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Mukozal numune hasadı için, hazırlanan müsin taşıyıcıları dört santigrat derece depolamadan çıkarın ve azot floş'u açın. Reaktör kapağını hızla açın ve her reaktördeki taşıyıcıların %50'sini yenileriyle değiştirin. Tüm taşıyıcılar değiştirildiğinde, kapağı hızla kapatın ve nitrojen floş'u 20 dakika daha koruyun.

Sonra aliquot 0.25 için 0.5 musin taşıyıcı agar gram dna çıkarma kadar eksi 80 derece santigrat depolama için bireysel iki mililitre tüpler içine. Günde üç kez sistem otomatik olarak döngüye sayılsa. Bu, mide biyoreaktörüne 140 mililitre tanımlanmış ortam aktarılması ve ardından pH kontrolü ile bir saatlik kuluçka ile başlar.

Kuluçka sonunda, mide içeriği pankreas suyu 60 mililitre ile birlikte ince bağırsak içine aktarılır. İnce bağırsak biyoreaktöründe pH otomatik olarak 6.7 ila 6.9 olarak ayarlanır ve içeriği 90 dakika kuluçkaya yatırılır. Bu kuluçka sırasında, her sistem için azot floş toplam 10 dakika açık.

Bu kuluçka sonunda, ince bağırsak içeriği artan kolon içine aktarılır, artan kolon dan enine kolon, enine kolon dan alçalan kolon için, ve azalan kolon atık için. Bu temsilci ana koordinat analizinde, topluluk birinci ve yedinci günler arasında amortismana uygun olarak değişti. Ancak, 11.

Üç belirgin kısa zincirli yağ asitlerinin ölçümü, propiyonik asit, Butanoik asit ve Asetik asitin deneyin başlangıcından 15. 15. günden sonra, her kolon bölgesinde üretilen bu asitlerin miktarları deney sonuna kadar sadece minimal değişiklikler ile sabit kaldı. Her kolon bölgesinin luminal ve mukozal fazı için istikrarlı bir topluluk analizi in vitro sistemin bireysel kolon bölgelerinde gelişen toplulukların dışkı inokül kompozisyonuna benzediğini göstermektedir.

İn vitro sistemin alfa çeşitliliğinin karşılaştırılması, artan bölgeden alınan luminal örnekler hariç tüm bölgeler için inoküldekine benzer bir çeşitlilik düzeyini ortaya koymaktadır. In vitro kültür sisteminin hem kompozisyon hem de çeşitlilik açısından dışkı inokülle karşılaştırılabilir bir topluluk üretebildiğini gösteren. Bu protokolü kullanarak istikrarlı bir bağırsak mikrobiyota topluluğu oluşturmak için, çözümlerin doğru şekilde hazırlanmasını ve anerobik koşulların ve pH parametrelerinin deney boyunca korunmasını sağlamak çok önemlidir.

Bu prosedürü takiben, örnekler biyoinformatik analiz ve metabolomik kullanarak işlevsellik için sonraki gen DNA sıralaması kullanılarak topluluk kompozisyonu için analiz edilebilir.