Name: Floresan Isotiyoyanat-polisucrose 70 ile Farelerde Glomerüler Geçirgenliğin Yüksek Hassas Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, farelerde glomerüler geçirgenliği yüksek hassasiyetle ölçmek için floresan izotiyosiyanat-polisucrose 70 kullanımını. Bu yöntem, nefroloji araştırmalarında küçük değişiklikleri tespit etmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Christina Schwandt, Blanka Duvnjak ve Nicola Kuhr onların olağanüstü teknik yardım ve Dr Dennis Sohn floresan tarama ile yaptığı yardım için teşekkür ederiz. Bu araştırma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18'in L.C.R. ve L.S. için verdiği bir hibe ile desteklenmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Araştırmalar, Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanımı Rehberi'nde (ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Yayın No. 85-23, revize 1996) belirtilen esaslara göre yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal onaylara uygun olarak yapılmıştır (devlet hükümeti Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referans numarası 84-02.04.2012.A397).
1. Alet, çözeltin ve ekipmanların hazırlanması
<ol><li>FITC-polissucrose 70'i %0,9 steril sodyum klorür (NaCl) ile 10 mg/mL (yani 10 mL NaCl'de 100 mg) son konsantrasyona yeniden oluşturun.</li>
	<li>Diyaliz FITC-polisökroz 70 çözeltisi 4 °C'de bir gecede serbest FITC moleküllerini çıkarın (molekül ağırlığı kesme [MWCO] 10.000). FitC-polysucrose 70'in 10 mL'si başına %0,9 steril NaCl'nin 1 L'sini sürekli karıştırma altında kullanın. Işıktan koruyun. Aliquot diyaliz FITC-polysucrose 70 ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>FITC-polissucrose 70 bolus için, 4 μL 10 mg/mL FITC-polissucrose 70 çözeltisini %0,9 NaCl'nin 996 μL'sine ekleyin (FITC-polissucrose 70 son konsantrasyonu: 40 g/mL).</li>
	<li>Denge infüzyon çözeltisi için, 10 mg/mL FITC-polisucrose 70 çözeltisinin 20 μL'sini 9,98 mL'lik steril NaCl'nin %0,9'luk son konsantrasyonuna ve20 g/mL'ye ekleyin.</li>
	<li>Deneysel çözüm için, infüzyon çözeltisine ilaç veya madde ekleyin (örneğin, anjiyotensin II [Ang II] [100 ng/kg/dk] için 25 g fare için, 1 mM'lik bir çözeltinin 3 μL Ang II'sini ekleyin).</li>
	<li>Ameliyat için, bir tıraş, iki cerrahi kelepçe, bir çift cerrahi makas, iki cımbız, iki ince cımbız, bir çift ince makas ve bez hazırlayın. Ligasyon işlemleri için iki adet 10 cm ipek iplik (4-0-6-0) hazırlayın.</li>
	<li>Merkezi venöz kateterin yerleştirilmesi için 21 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın. İğneucunu 30 cm uzunluğunda bir katetere (iç çapı 0,58 mm olan ) yerleştirin. 0,58 mm kateteri 10 cm'lik bir katetere bağlayın (0,28 mm kimlikle). Juguler ven içine tanıtılan keskin bir ipucu oluşturmak için küçük kateter eğik ucunu kesin.</li>
	<li>Anestezihazırlamak (yani, intraperitoneal anestezi ketamin, vücut ağırlığı 100 mg /kg, ve ksilazin, vücut ağırlığı 5 mg /kg).</li>
	<li>İğneyi atarak ve kateteri ucundan 1 cm uzakta işaretleyerek 22 G anjiyokateter hazırlayın. Isıtma yastığını 37 °C'ye Önceden ısıtın.</li>
	<li>Bir kan basıncı cihazı hazırlayın ve gerekirse kan basıncı ölçüm zarını değiştirin.</li>
</ol>2. Hazırlık aşaması
<ol><li>İdrar kateteri NOT: Bölüm 2.1, Reis ve ark.7tarafından açıklanan protokolü izler. Şekil 1 ve Ek Şekil 1 dişi farelerde idrar kateterinin yerleştirisini göstermektedir.<ol>
<li>Ketamin/xylazine ile fareyi anesthetize edin (bkz. adım 1.8). Uygun anesteziyi onaylamak için parmak ucutu testini kullanın. Anesteziyi korumak için, 60 dk.dan sonra anesteziyi (örneğin, yarım dozla) tekrarlayın. NOT: Bu protokolde dişi FVB fareler kullanılmaktadır.</li>
		<li>Fareyi 37 °C'lik bir ısıtma yastığıüzerinde dorsal recumbency'ye yerleştirin. Alt karın sıkın ve üretral ostium bulmak (örneğin, bir mikroskop altında).</li>
		<li>22 G anjiyokateterkatenin kateterinin plastik kısmını kullanın ve ksikolosain jeli ile yağlatın. Distal üretral eksene paralel olarak üretral ostiuma 3 mm dikkatlice tanıtılar (Şekil1A).</li>
		<li>Ucu üretral ostium içinde tutarak ve üretra eksenini koruyarak anjiyokateterin üst kısmını 180° çevirin (Şekil1B).</li>
		<li>Kateteri 7 mm daha fazla farenin içine tanıtılar, böylece mesanenin içine yerleştirilir (Şekil1C). Kateteri direncin ötesine zorlamayın. Direnç hissedilirse kateterin konumunu baştan düzeltin. İdrar kateterinin pozisyonu doğruysa, idrarın kateter içinde görünebileceğini unutmayın.</li>
		<li>İdrar toplamak için anjiyokateterin üstüne 1,5 mL kahverengi bir tüp yerleştirin. İdrar üretimini artırmak için 1 mL %0.9 NaCl deri altı uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Santral venöz kateter
	<ol>
<li>Farenin boynunu tıraş edin ve baş Cerraha doğru baş ile recumbency yerleştirin. Farenin başını bir bantla genişletin.</li>
		<li>% 70 isopropanol ile boyun dezenfekte. Bir cızırtı ve makas kullanarak çene çizgisinin altında küçük bir deri kesi (5 mm) yapın. Sternumun ortasına ulaşınakadar deriyi göğüs kafesi yönünde yaklaşık 1 cm kesin.</li>
		<li>Dikkatle boynun sağ tarafında deri incelemek, bir makas kullanarak. Boyun yumuşak doku ortaya çıkarmak için farenin sağ tarafına deri dikdörtgen bir kesi olun. Bir makas ve cızırtıcı kullan. Deri kapaklarını iki kelepçeyle düzeltin. NOT: Juguler ven tiroid bezinin sol tarafı boyunca çalışır veya hafif tiroid bezinin sağ lob ile kaplıdır. Bu adımdan sonra, ameliyat için bir mikroskop kullanın.</li>
		<li>İnce cızırtının ucunu kullanarak, künt hazırlıkla juguler damarı dikkatlice ortaya çıkar. Damar dallarının yaralanmasını önleyebilirsiniz. NOT: İnce makaslı dokuların çıkarılması gerekebilir. Kanama riskini artırır gibi doku kaldırmak için makas kullanırken dikkatli olun.</li>
		<li>Görünür şah damarının distal kısmına (farenin başına doğru) ipek iplikle (4-0-6-0) bir bağ yerleştirin ve kapatın. Şah damarı üzerinde hafif bir gerginlik sağlamak için bir bant ile ipek iplik sabitleme ile ligatür üzerinde gerginlik koyun. Juguler venin proksimal kısmı etrafında bir bağ hazırlayın.</li>
		<li>Kateteri denge infüzyon çözeltisi ile doldurun (bkz. adım 1.4) ve kateterin şah damarını hizalaması için kateteri bir bantla düzeltin. Hava embolisi önlemek için kabarcıklar için kontrol.</li>
		<li>Ekleme yerinde ince cımbız ile juguler ven kaldırın (ekleme sitesi ligatür 1-2 mm proksimal). Boruyu şah damarına paralel hizala. Lümeni hedefleyen juguler veni delin ve yaklaşık 2-4 mm boyunca, juguler ven eksenine paralel olarak yerleştirin. Herhangi bir tempolu hareketleri kaçının.</li>
		<li>Kateteri onarmak için bağı kapatın. Mikroskop üzerinden dikkatlice inceleyerek bağın sıkılığını kontrol edin. Ameliyat mahallinin üzerine nemli bir bez koy.</li>
	</ol></li>
	<li>Kan basıncı ölçümü
	<ol>
<li>Fare sırt recumbency yatıyor ise fare kuyruk alt kısmında kuyruk-manşet yerleştirin. Ölçümleri başlatın ve zaman noktası başına 10x tekrarlayın. Ölçümlerden bir ortalama oluşturun.</li>
		<li>Kan basıncı ölçümleri doğru görünmüyorsa ve yanlış veri üretiliyorsa kuyruk manşetinin pozisyonunu ayarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Denklik aşaması
<ol><li>Denge fazı başlamadan önce idrar toplama tüpünü değiştirin ve buz üzerine yerleştirin.</li>
	<li>FITC denge fazı çözeltisi ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga (bkz. adım 1.4) 21 G iğne ve daha büyük kateter (0,58 mm kimlikli) ile şırınga pompasına yerleştirin.</li>
	<li>Kat bir bez ve juguler ven içine tanıtıldı küçük damar kateter (0,28 mm bir kimlik ile) etrafında koyun. Kateteri bezin içine koy. Retrograd kan akışını veya hava embolizmini ortadan kaldırmak için bezin üzerine bir kelepçe yerleştirin. 27 G'lık bir iğneyi FITC bolus ile doldurulmuş 1 mL şırınga ile küçük damar kateterin in sonuna bağlayın.</li>
	<li>Kelepçeyi açın ve FITC bolus (100 μL) uygulayın. Kelepçeyi tekrar kapatın ve daha büyük kateteri daha küçük kateterle bağlayın. Şırınga pompasını 0,008 mL/dk (0,480 mL/h) ile çalıştırın. 60 dk boyunca infüzyona devam edin.</li>
</ol>4. Deneysel faz
NOT: Bu aşamada ilaçların glomerüler permselectivity üzerindeki etkisi araştırılabilir.
<ol><li>İdrar tüpünü (zaman noktası 0 dk) başka bir 1,5 mL kahverengi tüpe çevirin. Küçük damar kateterinin etrafına bir bez koyun ve adım 3.3'te belirtildiği gibi bir kelepçeyi kapatın.</li>
	<li>Büyük kateteri küçük kap kateterinden ayırın. Şırıngaları deneysel faz çözümleriyle değiştirin (bkz. adım 1.5). İnfüzyon pompası, büyük kateterin denge çözeltisi ile doldurulması için çalıştırın.</li>
	<li>Hava embolisi kaçınırken kateterleri yeniden bağlayın ve kelepçeyi yeniden açın. Şırınga pompasını 0,008 mL/dk'dan başlatın.</li>
	<li>60 dakika boyunca şırınga pompası çalıştırmaya devam edin ve bundan sonra idrar tüpü içinde idrar toplamak (idrar 60 dk). İdrar tüpünü buza yerleştirin.</li>
	<li>Anestezi sırasında servikal çıkığı ile fareyi kurban edin. Farenin bertaraf edilmeden önce 5 dakika boyunca ölü olduğundan emin olmak için gözlemlenir.</li>
</ol>5. İdrar analizi
<ol><li>
Floresan ölçümü
	<ol>
<li>İdrar havuzunu eritin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1:10 seyreltin. NOT: İdrar havuzu, metabolik bir kafeste 12-24 saat idrar toplama sağlıklı farelerden toplanan bir idrar havuzudur.</li>
		<li>Floresan ölçümü için standartlar hazırlayın. 10 kahverengi 1,5 mL tüp alın ve boş (1:10 seyreltilmiş idrar havuzu) ve aşağıdaki FITC-polysucrose 70 konsantrasyonları (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ve 160 μg/mL) için etiketleyin.</li>
		<li>Pipet 246 μL seyreltilmiş idrar havuzu 1,5 mL kahverengi tüp içine ve 4 μL FITC-polysucrose 70 stok konsantrasyonu (bkz. adım 1.1) 160 μg/mL FITC-polysucrose 70 son konsantrasyonelde etmek için ekleyin. Seyreltilmiş idrar havuzunun 100°L'lik kısmını diğer tüm tüplere yerleştirin.</li>
		<li>160 μg/mL FITC-polisuçoz 70 borunun 100 μL'sini 80 μg/mL tüpe dönüştürerek 1:2 seyreltin ve diğer konsantrasyonlarla devam edin. Seyreltilmiş konsantrasyonların uygun karışımını temin edin (örneğin, devam etmeden önce tüpü girdaplayarak).</li>
		<li>Seyreltilmiş idrar havuzu ile fare idrar örnekleri (0 dk, 60 dk) 0:10 seyreltin.</li>
		<li>Pipet 5 μL her standart FITC-polysucrose 70 konsantrasyonu ve siyah 384-iyi plaka triplicates olarak fare idrar örnekleri. Kabarcıkları önlemek için 15 s için 1.000 x g plaka santrifüj.</li>
		<li>Bir tabak okuyucu384-iyi plaka analiz edin. 496 nm'de uyarma yapın ve floresan'ı 525 nm'de ölçün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kreatinin ölçümü
	<ol>
<li>Üreticinin talimatlarına uyun. Kısacası, 1 mM standart bir çözüm hazırlamak için 990 μL kreatinin test tamponu ile 100 mM kreatinin standart çözeltisinin 10 μL'sini seyrelterek kreatinin standartlarını hazırlayın.</li>
		<li>0, 2, 4, 6, 8 ve 10 μL 1 mM kreatinin standart çözeltiyi 96 kuyulu bir tabağa ekleyerek sırasıyla 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 nmol/well standartları oluşturun. Hacmi 50 μL'ye çıkarmak için her kuyuya kreatinin istine arabelleği ekleyin.</li>
		<li>42-44 μL kreatinin gutaraffer, 2 μL kreatinase, 2 μL kreatininaz enzim karışımı ve 2 μL kreatinin probu ekleyerek reaksiyon karışımlarını hazırlayın. Boş lar için 44 μL kreatinin çıktırıcı tamponu, 2 μL kreatinase, 2 μL kreatinin enzim karışımı ve 1-2 μL kreatinin probu kullanın.</li>
		<li>96 kuyulu plakadaki her kuyuya uygun reaksiyon karışımından 50 μL ekleyin ve 37 °C'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında plakayı ışıktan koruyun. Bir plaka okuyucu üzerinde 570 nm de absorbans ölçün.</li>
		<li>Tüm okumalardan boş değeri çıkararak kreatinin konsantrasyonlarını hesaplayın. Sonuç birim nanomoles / mikrolitre olacaktır. Molekülnanogram/mikrolitreyi almak için kreatinin in moleküler ağırlığıyla (113,12 ng/nmol) kreatinin konsantrasyonu çarpın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>FitC-polisökroz 70 idrar konsantrasyonu standart eğriden hesaplayın.</li>
	<li>Fitc-polisökroz 70 idrar konsantrasyonlarını temsili idrar örneğindeki kreatinin konsantrasyonlarına başvurun.</li>
	<li>Referans idrar 60 dk örnekleri idrar 0 dk kontrolleri ve tedavi fareler örnekleri.</li>
</ol>

<ol><li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li>
<li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+%28ANG+II%29+infusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li>
<li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li>
<li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li>
<li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li>
<li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513(2016).</li>
<li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity%3A+effects+of+molecular+size%2C+shape%2C+charge%2C+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li>
<li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+Effects+of+Tempol%2C+NOS-%2C+RhoA-+and+Rac-1-inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li>
<li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo%2C+dependent+upon+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li>
<li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reactive+oxygen+species+%28ROS%29-dependent+effects+of+IL-1beta%2C+TNF-alpha%2C+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+%28GFB%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li>
<li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li>
<li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability%3A+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li>
<li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hyperglycemia+induces+rapid%2C+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li>
<li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+effects+of+Tempol%2C+NOS%2C+RhoA%2C+and+Rac-1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li>
<li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li>
<li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sunulan yöntem, araştırmacının farelerde glomerüler geçirgenliği çok hassas bir şekilde bir izleyici kullanarak test etmesini sağlar. Bu yöntemle glomerüler geçirgenlikte kısa süreli artışlar sadece az miktarda idrar kullanılarak teşhis edilebilir. Bu tekniği başarılı bir şekilde ustalaşmak için en kritik adımlar 1) fare cerrahisinde manuel uzmanlık geliştirmek, özellikle merkezi bir damarın kanülasyonunda, 2) idrar kateterini mukozaya zarar vermeden yerleştirmek ve 3) elle işleme de manuel uzmanlık Küçük hacimli numunel...

Glomerüler filtrasyon bariyerindeki fonksiyonel veya yapısal bozukluklar glomerüler geçirgenliği arttırarak albümine (albuminüri) albumin saptanır. Albuminüri kardiyovasküler sonucu tahmin eder ve glomerüler yaralanma için önemli bir belirteçtir1. Hatta düşük albuminüri düzeyleri, normal aralıkta yalan, artmış kardiyovasküler risk ile ilişkilidir1.
Fizyolojik koşullar altında, albumin glomerulus yoluyla süzülür ve neredeyse tamamenboru sistemi 2,3emilir . Farelerde, idrarda albumin tespiti genellikle idrar toplama 24 saat bir albumin enzim bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) tarafından yapılır. 24 saat idrar toplama veya spot idrardan idrar kullanılırsa, taht hassasiyeti problemleri nedeniyle albümin konsantrasyonlarında küçük farklılıklar gözden kaçabilir. Çoğu araştırmacı, bu nedenle, hangi albuminüri toksinler, ilaçlar ve böbrek cerrahisi nedeniyle sağlam böbrek hasarı ile indüklenen hayvan modelleri kullanın.
Bu nedenle glomerüler geçirgenlikteki küçük ve geçici değişiklikleri saptamak için hassas bir yöntemin bulunması alan için çok önemlidir. Rippe ve ark. bir floresan etiketli tracer uygulayarak glomerüler geçirgenliği test etmek için bir sıçan modeli sunduk, yani FITC-polysucrose 70 (yani, FITC-Ficoll 70), albumin boyutunda4. Tracer uygulaması glomerüler geçirgenlik kısa vadeli değişikliklerin test sağlar (dakika içinde) ve çok hassas4. İki çalışmada farelerde izleme yöntemi kullanılmıştır5,6. Faydalarına rağmen, bu yöntem, ne yazık ki, dezavantajları vardır: teknik olarak çok karmaşık, radyoaktif, ve invaziv. İdrar ın daha fazla analizi sadece jel filtrasyon veya boyut dışlama HPLC5,6kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu yazıda, floresan fitc-polissucrose 70 etiketli farelerde glomerüler geçirgenliği ölçmek için alternatif, hassas, radyoaktif olmayan ve hızlı bir yöntem salıyoruz. Transüretral kateter getirilerek, idrar toplama mesane delinmesi, üretrotomi ve suprapubik kateter uygulamasına göre daha az invazivdir ve idrar ın en az her 30 dakikada bir (5°L) kullanılarak idrar toplamasına izin verir. floresan plaka okuyucu. İdrarda tracer konsantrasyonları enzimatik kreatinin testi kullanılarak idrardaki kreatinin konsantrasyonlarına normalleşir.
Bu nedenle, bu yeni yöntem artmış glomerüler geçirgenlik ile erken glomerüler yaralanma çalışma için hassas bir araç sunuyor.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td> Fare cerrahisi için <td>Motic</td><td>SMZ168BL</td><td>mikroskobu</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Pulch ve Lorenz mikroskobu</td><td>150500</td><td>fare cerrahisi için ışık</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>ince makas</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>boyun kesimi için</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, Ameliyat için Aesculap</td><td>BD215R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pr&auml; ameliyat için parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>ipek iplik</td></tr><tr><td>Ketamin %10</td> <td>Medistar</td><td></td><td>anestezi</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) %2</td> <td>Bayer</td><td></td><td>anestezi</td></tr><tr><td>İnce Delikli Polietilen Boru ID 0.28mm OD 0.61mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>Kateter</td></tr><tr><td>İnce Delikli Polietilen Boru ID 0.58mm OD 0.96mm</td><td>Portex</td><td>800/100/200</td><td>Kateter</td></tr><tr><td>Harvard aparatı 11 Plus</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-2209</td><td>şırınga pompası</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381823</td><td>&nbsp; üriner</td></tr><tr><td>kateter Çok Modlu Dedektör DTX 880</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>plaka okuyucu</td></tr><tr><td>384 kuyulu mikrotitre plaka</td><td>Nunc</td><td>262260</td><td>384 kuyu platte</td></tr><tr><td>Kreatinin Test Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK080</td><td>kreatinin konsantrasyonunu ölçmek için</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Nunc</td><td>260836</td><td>kreatinin testi için & nbsp;</td></tr><tr><td>FITC etiketli polisuçroz 70</td><td>TBD Danışmanlığı</td><td>FP70</td><td></td></tr><tr><td>Glomerüler geçirgenliği test etmek için kullanılan</td>FITC-ficoll<td>Anjiyotensin II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td></tr><tr><td>Kan basıncı ölçümü için</td><td>BP-98A</td><td>Softron</td><td></td></tr><tr><td>OTS 40.3040</td><td>Medite</td><td>01-4005-00</td><td>fare cerrahisi için ısıtma plakası</td></tr><tr><td>Instillagel 6mL</td><td>Farco-Pharma GmbH</td><td></td><td>üriner kateter</td></tr><tr><td>Exacta</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>tıraş makinesi</td></tr> için</tbody></table>

floresan isotiyoyanat-polisucrose 70 ile farelerde glomerüler geçirgenliğin yüksek hassas Ölçümü

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

İdrarda albumin kaybı (albuminüri) kardiyovasküler sonucu tahmin eder. Fizyolojik koşullar altında, az miktarda albumin glomerulus tarafından süzülür ve emme sınırına ulaşıncaya kadar tübüler sistemde tekrar emilir. Patolojik albumin filtrasyonundaki erken artışlar albuminüri analiz edilerek gözden kaçabilir. Bu nedenle, glomerüler permselectivity test etmek için izleyicilerin kullanımı avantajlı görünür. Floresan etiketli tracer fluorescein izotiyoyanat (FITC)-polissökroz (yani, FITC-Ficoll), glomerüler permselectivity çalışma için kullanılabilir. FITC-polissucrose molekülleri glomerulus tarafından serbestçe süzülür, ancak boru sisteminde emilir. Fare ve sıçanlarda FITC-poliskroz, teknik olarak karmaşık prosedürler (yani radyoaktif ölçümler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi [HPLC], jel filtrasyon) kullanılarak glomerüler geçirgenlik modellerinde araştırılmıştır. Farelerde FITC-polysucrose 70 (albumin boyutu) glomerüler geçirgenlikte erken ve küçük artışları test etmek için FITC-polissucrose tracer tabanlı protokolü modifiye ettik ve kolaylaştırdık. Bu yöntem, küçük idrar hacimleri (5 μL) ile tekrarlayan idrar analizleri sağlar. Bu protokol, fitc-polisökroz 70'in intravenöz olarak nasıl uygulandığı ve basit bir idrar kateteri ile idrarın nasıl toplandığı hakkında bilgi içermektedir. İdrar bir floresan levha okuyucu ile analiz edilir ve bir idrar konsantrasyonu belirteci normalize (kreatinin), bu şekilde teknik olarak karmaşık prosedürler kaçınarak.

Şekil2'de de belirtildiği gibi, farelerde glomerüler geçirgenliği test etme yöntemi üç aşamada oluşturulmuştur. İlk evre, üriner kateter ve santral venöz kateterin yerleştirildiği hazırlık evresi olarak adlandırılır. İkinci faz, FITC-polissucrose 70'in intravenöz bolus enjeksiyonu ile başlayıp 60 dk boyunca FITC-polissucrose 70'in sürekli infüzyonu ile başlayan denge fazı olarak adlandırılır. Son aşamaya deneysel faz denir. Bu aşamada, FITC-polisökroz 70 infü...

Burada, farelerde çok hassas, radyoaktif olmayan bir izleyici kullanarak glomerüler geçirgenliği test etmek için bir protokol sıyoruz. Bu yöntem küçük idrar hacimleri ile tekrarlayan idrar analizleri sağlar.

Floresan Isotiyoyanat-polisucrose 70 ile Farelerde Glomerüler Geçirgenliğin Yüksek Hassas Ölçümü

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Bu yöntem böbrek hastalığında glomerüler geçirgenliğin rolü hakkında nefroloji alanındaki anahtar soruların cevaplanabilmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, glomerüler geçirgenliğin küçük ve geçici artışlarının floresan kurşun etiketli bir tracer kullanılarak tespit edilmesidir. Anesteziden sonra, kadın fare bir idrar kateteri yerleştirin.Fareyi dorsal recumbency'de konumlandırın. Alt karın sıkın ve üretral ostium bulabilirsiniz. 22 G anjiyokateterkatenin kateterinin plastik kısmını elde edin ve ksikolosain jeli ile yağlatın.Alt karın üzerinde dikkatli gerginlik yerleştirmek için sol işaret parmağını kullanın ve distal üretral ekseni paralel iken üretral ostium içine kateter üç milimetre tanıtmak. Ucu üretral ostium içinde tutarak ve üretra eksenini koruyarak anjiyokateterin üst kısmını 180 derece çevirin. Daha sonra kateteri farenin içine yedi milimetre daha ileri tanıtım, böylece mesanenin içine yerleştirilir.İdrar toplamak için anjiyokateterin üstüne 1,5 mililitrelik kahverengi bir tüp yerleştirin. İdrar üretimini artırmak için bir mililitre %0.9 sodyum klorür uygulayın. Farenin boynunu tıraş edin ve baş Cerraha doğru baş ile recumbency yerleştirin.Hiper bir ba

highly-sensitive-measurement-glomerular-permeability-mice-with

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini...

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi için altın standarttır. Burada iki aşamalı bir üstel bozulma modeli ile plazma ve GFR hesaplanmasında tek bolus enjeksiyon, floresein izotiyosiyanat belirlenmesi (FITC)-inulin kullanarak bilinçli farelerde GFR belirlenmesinde sağlayan yüksek verimli yöntem açıklanmaktadır.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

Glomerüler filtrasyon hızının (GFR) belirlenmesi, genel böbrek fonksiyonunu değerlendirmek için altın standarttır. Bununla birlikte, bu parametreyi ölçmek için geleneksel prosedürler zahmetlidir ve büyük bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, GFR'yi transkutanöz olarak belirlemek için daha hızlı ve minimal invaziv bir yöntem tanımlanmıştır.

Bilinçli Kemirgenler Böbrek Fonksiyon Transkutanöz Değerlendirmesi

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Burada tarif biz bilinçli, glomerular filtrasyon debisi (GFR) ölçmek için bir protokol bir transdermal GFR monitör kullanarak fareler serbestçe hareket.

Farelerde Glomerular filtrasyon transdermal ölçümü

Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR), böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için ideal bir belirteçtir. Bununla birlikte, seri kan ve idrar analizi ile inülin enjeksiyonu kullanan standart ölçüm yöntemi pratik değildir. Bu makalede, domuz yavrularında GFR'yi transdermal olarak ölçmek için pratik bir yöntem açıklanmaktadır.

Mekanik Havalandırmalı Domuz Yavrularında Glomerüler Filtrasyon Hızının Transdermal Ölçümü

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin, farelerde glomerüler geçirgenliği yüksek hassasiyetle ölçmek için floresan izotiyosiyanat-polisucrose 70 kullanımını. Bu yöntem, nefroloji araştırmalarında küçük değişiklikleri tespit etmeye olanak tanır.

Floresan Isotiyoyanat-polisucrose 70 ile Farelerde Glomerüler Geçirgenliğin Yüksek Hassas Ölçümü

Daha fazla video keşfet