Mikroelektrot Impalement yöntemi bir kanüle orta serebral arter membran potansiyelini kaydetmek için
July 2nd, 2019
Bu makalenin birincil amacı, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemini kullanarak orta serebral arter membran potansiyelinin (Vm) nasıl kaydetilme ayrıntılarını sağlamalıdır. Kanüle orta serebral arter miyojenik tonu elde etmek için dengelenmiş, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotları kullanılarak kazığa olduğunu.
Bu protokol, normal ve hastalıklı kan damarlarının membran potansiyelini ölçmek ve membran potansiyelini, vasküler tonuve kan akışını modüle eden farmakolojik ajanları değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknikten üretilen membran potansiyelleri, damar içindeki vasküler düz kaslar bir senitoyumda olduğundan fizyolojik menzile yakındır. İşleme başlamadan önce, çift kanallı diferansiyel elektrometre amplifikatörü istediğiniz yere yakın bir damar odasına yerleştirin.
Amplifikatör kanalı A veya B çıktısını dijitalleştiricinin kanal girişine bağlamak için BNC-BNC kablosu kullanın. Sondayı mikromanipülatöre monte edin ve mikromanipülörü titreşimsiz bir masaya mikroskopa ve miyografa doğru çevirin. Düğmeleri ve anahtarları kılavuzda açıklandığı gibi deney için uygun konumlara amplifikatörün önüne yerleştirin.
Daha sonra banyo zeminini uygun bir elektrotla amplifikatörün devre zeminine bağlayın ve kafesin amplifikatörün şasisine toprakladığından emin olun. Borosilikat cam mikroelektrotları hazırlamak için, daha az bir mikrometre çapı ile kısa, kademeli, sekiz ila 10 milimetrelik konik elde etmek için standart bir çekmece kullanın, daha yüksek dirençler ve daha küçük ipuçları için iki kez döngü. Üç molar potasyum klorür ile mikroelektrot doldurmak için bir mikrofiber şırınga kullanın, yavaş yavaş sıvı doldurmak için alan sağlamak ve mikroelektrot içinde kabarcıklar oluşumunu önlemek için enjeksiyon sırasında piston geri çekerek.
Tam yüklü mikroelektrotu mikroelektrot tutucuya yerleştirin ve elektrot sapını sıkılmış delikten tutucuya dikkatlice itin. Laboratuvar dokusu olan fazla sıvıyı çıkarın ve elektrot tutucu tertibatını amplifikatör sondasına bağlayın. Elektrot direncini ölçmek için bir elektrot testi yapın.
Ardından kayıt yazılımını açın, dosyaya bir ad atayın ve dosyayı gelecekteki çözümlemelere kaydedin. Daha sonra, normal fizyolojik tuz çözeltisi beş mililitre veya PSS ile oda yüklemeden önce distile su ile miyograf odası nı birkaç kez durulayın. Beş veya 10 mililitrelik şırınga kullanarak, her iki cam kanülleri ve bağlı tüpü herhangi bir hava kabarcığı getirmeden filtrelenmiş normal PSS ile doldurun ve 10-0 monofilament naylon dikişlerde yarım düğüm yapmak için künt forseps kullanın.
Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında diseksiyon forsepskullanarak, ipuçları biraz uzakta her iki kanüller üzerinde kısmen kapalı dikiş düğümleri yerleştirin. Orta serebral arter izolasyonu için, sıçan beyninin 100 ila 200 mikrometrelik iç çapı olan orta serebral arterin dallanmamış bir bölümünü tanımlamak ve incelemek için yay makasve forsepskullanın. Cam kanüller üzerine orta serebral arter monte etmek için ince forceps kullanın, ve kanül arter güvenli dikişleri sıkın.
Distal kanülü kapatArak arter içinde akış olmayacak ve giriş pipetini PSS rezervuarına bağlayın. Ters mikroskop ve görüntüleme yazılımı üzerine monte edilmiş şarj lı bir cihaz kamera kullanarak kanüle edilmiş orta serebral arteri görselleştirin. MCA'nın eksenel uzunluğunu, ne sert ne de sarkık görünecek şekilde yaklaşık bir uzunluğa ayarlayın.
Banyo çözeltisini %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede dengeleyin. Amplifikatörün zeminini miyografın PSS'sinde batırın. Kap odasını aydınlatın ve banyo çözeltisindeki mikroelektrotun ucunu mikroskop aracılığıyla görselleştirin.
Mikromanipülörü kullanarak, mikroelektrotun ucunu kan damarının dış duvarına yaklaştırın ve kaydı başlatın. Mikroelektrotun ucunu yavaşça damara doğru hareket ettirin ve geminin merkezine doğru ilerleyin. Ucu damara yakın geldiğinde, kas zarını kazımak için elektrotileri hızlı bir hareketle ilerletin.
Membran delindikten sonra membran potansiyelinde değişiklikler gözlemlenebilir. Membran kazındıktan sonra mikromanipülatöre dokunmayın. Membran potansiyel değişiklikleri kaydedildiğinde, tek bir hızlı hareketle mikroelektrotu çıkarmak için manipülatörü kullanın ve veri dosyalarını kaydetmeden önce kaydı durdurun.
Negatif değerlere hızlı bir sapma olduğunda, membran potansiyeli en az 30 saniye boyunca sabit olduğunda ve elektrotun çıkarılmasıyla voltaj aniden sıfır milivolta döndüğünde impalement başarılı kabul edilir. Başarılı bir impalement ve membran potansiyeli stabilizasyonundan sonra, ilgi çekici ilaçlar banyoya nüfuz edebilir ve membran potansiyelindeki değişiklikler kaydedilebilir. Bu temsili deneyde, potasyum klorür ile perfüzyon membranı yaklaşık altı milivolt depolarize ederken, büyük iletkenlik kalsiyum aktivatörü ile perfüzyon membranı yaklaşık dört milivolt hiperpolarize etti.
Hatırlanması gereken en önemli şey, mikrometreçapı daha az olan kısa ve kademeli koniklere sahip yüksek dirençli mikroelektrotları çekmektir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, mikroelektrot batırma yöntemi kullanılarak orta serebral arterden zar potansiyeli (V m) kaydetme protokolünü detaylandırmaktadır. Teknik, hem normal hem de hastalıklı kan damarlarındaki zar potansiyellerinin ölçülmesine izin vermektedir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Elektrofizyoloji
- Vasküler Biyoloji
- Farmakoloji
Arka Plan
- Orta serebral arter, serebral kan akışı için kritik öneme sahiptir.
- Zar potansiyelini anlamak, vasküler tonu değerlendirmek için hayati önem taşır.
- Bu yöntem, kan akışını etkileyen farmakolojik ajanları değerlendirebilir.
- Zar potansiyelleri, vasküler düz kas sinşitiumu nedeniyle fizyolojik aralıklara yakındır.
Çalışmanın Amacı
- Zar potansiyeli ölçmek için detaylı bir protokol sağlamak.
- Farmakolojik ajanların vasküler ton üzerindeki etkilerini değerlendirmek.
- Sağlık ve hastalıkta kan akışı düzenlemesinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çift kanallı diferansiyel elektrometre amplifikatörün kullanılması.
- Amplifikatörün BNC-BNC kablosu ile bir dijital dönüştürücüye bağlanması.
- Probun hassas konumlandırma için bir mikromanipülatöre monte edilmesi.
- Amplifikatör ayarlarının deney kılavuzuna göre ayarlanması.
Ana Sonuçlar
- Orta serebral arterde zar potansiyelinin başarılı şekilde ölçülmesi.
- Tekniğin hem normal hem de hastalıklı damarlarda uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Kayıt edilen zar potansiyellerinin fizyolojik alakasının doğrulanması.
- Farmakolojik ajanların vasküler ton üzerindeki modülasyonuna ilişkin bilgiler.
Sonuçlar
- Mikroelektrot batırma yöntemi, vasküler fizyolojiyi incelemek için etkilidir.
- Bu protokol, vasküler durumları hedef alan terapötik ajanların değerlendirilmesine yardımcı olabilir.
- Dahası araştırmalar, vasküler sağlıkta zar potansiyelinin etkilerini genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of vascular smooth muscle membrane potential enables mechanistic de-risking of ion channel modulators in preclinical cardiovascular and cerebrovascular programs. This method supports target validation by linking electrophysiological readouts to vascular tone and blood flow regulation, providing predictive confidence for lead optimization. It bridges discovery biology with translational assessment of pharmacological agents affecting cerebral perfusion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on ion channel and electrogenic pump function in vascular smooth muscle.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating membrane potential changes with vascular tone modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that depolarize or hyperpolarize membrane potential in resistance arteries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (cannulated middle cerebral artery) for compound screening with stable membrane potential baselines.
- Quantitative Output: Generates reproducible membrane potential measurements in millivolts, enabling dose-response analysis of pharmacological agents.
- Screening Reproducibility: Standardizes impalement technique across vessels to ensure consistent electrophysiological readouts for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to diseased vessel models to assess ion channel dysfunction in hypertension, stroke, or vascular inflammation.
- Translational Continuity: Connects electrophysiological mechanism to functional outcomes like cerebral blood flow regulation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on membrane potential shifts induced by test compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to functional validation in resistance arteries, supporting lead identification and preclinical efficacy assessment.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about ion channel contribution to resting membrane potential in vascular smooth muscle.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with stable impalement recordings for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative membrane potential readouts (mV) that enable comparison of compound effects on vascular excitability.
- Translational Research: Links electrophysiological modulation to downstream functional assays of vascular tone and perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for multiple vascular beds and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular pharmacology by directly measuring electrophysiological consequences of target modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible membrane potential data across laboratories and vascular preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target electrophysiological effects early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of compounds with favorable vascular safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microelectrode preparation, vascular dissection, and electrophysiology recording.
- Depends on low-noise electrometers, digitizers, micromanipulators, and vibration-free imaging setups.
- Necessitates standardization of impalement success criteria (e.g., 30-second stability, return to zero) across users.
- Adaptation to other resistance arteries (e.g., mesenteric, coronary) may require vessel-specific cannulation and tone equilibration.
- Limited by technical success rate of impalement and susceptibility to movement artifacts during recording.
