Rad51 tarafından aracılı DNA Strand Exchange tepki gerçek zamanlı gözlem
13 Şubat 2019
DNA'ın sistemleri tarafından Rad51 aracılı Satım tepki strand floresans rezonans enerji transferi tabanlı gerçek zamanlı gözlem için geliştirilmiştir. Burada sunulan iletişim kurallarını kullanarak, biz tepki ara ürün ve ayrıca reaksiyon enzimatik kinetik analiz ederken onların dönüşüm ürünlerde, oluşumu tespit edebiliyoruz.
Bu yöntem DNA iplikçik değişimindeki adımların deşifre edilmesine yardımcı olabilir ve onarım sırasında kombinasyonda yer alan farklı proteinlerin molekül rollerini ortaya koymaktadır. Bu teknikle DNA iplikçik değişimini reaksiyonda herhangi bir bozulma olmadan gerçek zamanlı olarak izleyebilir ve her reaksiyon adımının kinetiklerini belirlemek için ameliyathaneyi kullanabiliriz. Bazı küçük ayarlamalarla, bu teknik memeliler ve bitkiler gibi diğer türlerden elde edilen saflaştırılmış rekombinasyon proteinlerinin faaliyetlerini incelemek için uygulanabilir.
Prosedürü gösteren Kentaro Ito, benim laboratuvar bir Post Doc olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre tepki arabelleği A'yı hazırlayın. Daha sonra, DNA eşleştirme testi için tampon36-nanomole 16FA-oligonükleotid ekleyin.
Karışımı 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın. Rad-51 proteinini karışıma 1,5 mikro benlik son konsantrasyonunda ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Karışıma 0,15 mikro benlik son konsantrasyonunda SWI5-SFR1 proteinini ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika daha kuluçkaya yatırın.
1.0 ile 1.0 cm kuvars cuvette manyetik karıştırıcı içeren karışımın 1,5 mililitre aktarımı. Bir spektroflorometre içine cuvette yerleştirin ve sıcaklık denetleyicisi ve manyetik karıştırıcı ayarlamaya devam edin. FAM floresan emisyon değişikliğini 525 nanometrede, uyarma üzerine 493 nanometrede bir saniye aralıklarla 100 saniye boyunca kaydedin.
Son olarak, bir şırınga ile, cuvette içine 36 nano benler son konsantrasyonda ROX etiketli çift iplikli DNA enjekte. Floresan emisyondaki değişikliği 30 dakika boyunca bir saniye aralıklarla kaydedin. Yüzeyler ve son ürünler arasındaki floresan spektrumları karşılaştırmak için RAD-51 içeren 16 FA-oligonükleotiti içeren her bir cuvette'yi bir spektroflorometreye ve inkübatöre 5 dakika boyunca 37 derece santigrat derecede yerleştirin.
Daha sonra, 493 nanometre de uyarma üzerine 500 ila 600 nano metre FAM floresan emisyon kaydedin. RAD-51'in floresan spektrumları üzerindeki etkisini test etmek için RAD-51'i 1,5 mikro benlikson konsantrasyonunda ekleyin. Ve karışımı 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.
Son olarak, 493 nanometre de uyarma üzerine 500 ila 600 nanometre floresan spektrum kaydedin. Tüm tek iplikli DNA substratı eşleştirme testinde çift iplikli DNA'ya dönüştürüldüğünde, maksimum FRET verimi floresan şiddetinde maksimum azalma ölçülerek elde edilir. Ya da tüm çift iplikli DNA substratı yer değiştirme testinde tek iplikli DNA'ya dönüştürüldüğünde yoğunluktaki maksimum artışı ölçerek.
Her iki tahlilde de RAD-51 proteininin eklenmesi FAM floresan salınımını veya kayaçların söndürme verimliliğini etkilemedi. Substrat DAA'ları ile sonraki fotoğraf beyazlatma arasındaki spontan reaksiyonların etkileri küçüktür. RAD-51 olmadan FAM emisyonunda ihmal edilebilir değişiklikler gösterildiği gibi, RAD-51 ile görülen önemli değişiklikler ile karşılaştırıldığında.
SWI5-SFR1 kompleksinin eklenmesi RAD-51'in eşleştirme etkinliğini güçlü bir şekilde uyarır. Eşleştirme reaksiyonu, ilk üç iplikli ara nın oluşumu, ikinci ara ara ile geçiş ve tek iplikli DNA'nın serbest bırakılması ve hetero dubleks oluşumundan oluşan üç aşamalı bir model kullanılarak simüle edilir. Üç adımlı modelin iki adımlı bir modelle karşılaştırılması, üç adım modelinin SWI5-SFR1 kompleksi olmadan veya swi5-SFR1 kompleksi olmadan veya ile DNA eşleştirmesini simüle etmek için daha uygun olduğunu gösterir.
SWI5-SFR1 ile veya SWI5-SFR1 olmadan her reaksiyon adımının hesaplanan denge sabiti, SWI5-SFR1 kompleksinin ilk üç iplikli ara ipliğin oluşumunu uyarmadığını, ancak iki üç iplikli ara madde ile SS DNA'sının salınımını güçlü bir şekilde uyardığını gösterir. Saflaştırılmış proteinher toplu nükleaz ve helicase kontaminasyon ücretsiz olduğunu doğrulamak için gereklidir.
Genel Bakış
Bu makale, floresan rezonans enerji transferi kullanarak Rad51 aracılı DNA zincir değişimi reaksiyonlarının gerçek zamanlı gözlemi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, reaksiyonu bozmadan reaksiyon ara ürünlerinin tespit edilmesine ve enzimatik kinetiğin analiz edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Genetik
Arka Plan
- DNA zincir değişimi, DNA onarımında kritik bir süreçtir.
- Rad51, homolog rekombinasyonda önemli bir rol oynar.
- Bu reaksiyonun kinetiğinin anlaşılması, DNA onarım mekanizmaları hakkında derinlemesine bilgi sağlayabilir.
- Gerçek zamanlı izleme teknikleri, bu karmaşık biyokimyasal süreçlerin incelenmesini geliştirir.
Çalışmanın Amacı
- DNA zincir değişimini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için bir sistem geliştirmek.
- Reaksiyonda farklı proteinlerin rollerini analiz etmek.
- DNA zincir değişim sürecindeki her bir adımın kinetiğini belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- DNA eşleşme analizleri için reaksiyon tamponunun ve oligonükleotidlerin hazırlanması.
- RAD-51 ve SWI5-SFR1 proteinlerinin DNA substratları ile inkübasyonu.
- Floresan değişimlerini izlemek için bir spektroflorometre kullanımı.
- Floresan emisyon ölçümleri aracılığıyla reaksiyon ara ürünlerinin ve ürünlerin analizi.
Ana Sonuçlar
- SWI5-SFR1 ilavesi, RAD-51'in eşleşme aktivitesini önemli ölçüde stimüle eder.
- Üç aşamalı bir model, DNA eşleşme simülasyonuna iki aşamalı bir modele kıyasla daha iyi uymaktadır.
- Çalışma, DNA zincir değişimi kinetiği üzerine kantitatif veriler sağlamaktadır.
- Floresans ölçümleri, spontan reaksiyonların etkilerinin minimal olduğunu göstermiştir.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, DNA zincir değişiminin ayrıntılı kinetik analizine olanak tanır.
- SWI5-SFR1, RAD-51'in DNA eşleşmesindeki verimliliğini artırır.
- Bu teknik, çeşitli türlerden rekombinasyon proteinlerinin incelenmesi için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Rad51 aracılı DNA zincir değişiminin gerçek zamanlı gözlemlenmesi, rekombinasyon proteini fonksiyonunun değerlendirilmesi için kantitatif bir çerçeve sunarak DNA onarım yollarındaki hedef doğrulamasını destekler. FRET tabanlı analiz, geçici ara ürünleri çözümleyerek mekanistik hipotezlerin kinetik risklerinin azaltılmasını sağlar ve homolog rekombinasyon modülatörleri için öncü bileşik tanımlama sürecine veri sağlar. Bu yaklaşım, protein aktivitesini fonksiyonel DNA onarım sonuçlarıyla ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: DNA onarım yolaklarındaki terapötik hedefleri doğrulamak için Rad51 aracılı zincir değişiminin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Üç zincirli DNA ara ürünlerinin oluşumunu ve olgunlaşmasını çözerek Swi5-Sfr1 gibi yardımcı proteinlerin etki mekanizmasını aydınlatır.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşimi ve yolak modülasyonu tahminlerine olan güveni artıran üç aşamalı kinetik modellemeyi destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Farklı protein koşulları altında zincir değişimi kinetiğini ölçmek için kantitatif floresan okumaları üretir.
- Operasyonel Değer: Bileşik taraması için spektroflorometrik saptama ile uyumlu, homojen ve çözelti tabanlı bir analiz formatı oluşturur.
- Analiz Hazırlığı: Reaksiyonu bozmadan gerçek zamanlı izleme sağlayarak, hit doğrulaması için doz-yanıt ve zaman seyri analizlerini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Rekombinasyon proteini aktivitesinin türler arası karşılaştırmasını kolaylaştırarak, model sistemlerden insan homologlarına ekstrapolasyonu destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Aksesuar proteinlerin spesifik reaksiyon basamakları üzerindeki etkilerini ayırt ederek, mekanizma tabanlı biyobelirteç uyumundaki belirsizliği azaltır.
- Preklinik Süreklilik: Rad51 regülatörlerinin türler arasındaki fonksiyonel korunumunu değerlendirmek için standart bir yöntem sunarak hedef seçimini bilgilendirir.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu yöntem, DNA onarım proteinlerinin kinetik profillemesinin preklinik yatırımdan önce karar verme süreçlerini bilgilendirdiği, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürecine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Swi5-Sfr1'in Rad51 aracılı zincir değişiminde ara matürasyonu ve ssDNA salınımını nasıl stimüle ettiğini nicelendirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İnhibitör veya aktivatör etkilerinin reaksiyon kinetiği üzerinden karşılaştırılmasına olanak tanıyan, tekrarlanabilir ve gerçek zamanlı FRET sinyalleri sağlar.
- Analitik: Protein varyantlarının veya koşulların kantitatif karşılaştırmasına izin veren, adım çözünürlüklü hız sabitleri ve denge sabitleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Analizin memeli ve bitki rekombinasyon proteinlerine uygulanmasıyla evrimsel korunmuşluğun değerlendirilmesini sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Rekombinaz aktivitesini karakterize etmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturarak projeler arası tekrarlanan analiz geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Geçici ara ürünleri çözümleyerek ve hız belirleyici basamakları tanımlayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Küvet tabanlı bir formatta gerçek zamanlı floresan izleme yoluyla standartlaştırılmış, tekrarlanabilir kinetik veriler sağlar.
- Stratejik Değer: Aksesuar proteinlerin zincir değişimi basamaklarını nasıl modüle ettiğini nicelendirerek mekanistik belirsizliği azaltır ve devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kantitatif kinetik profiller ve evrimsel korunum verilerine dayanarak DNA onarım hedeflerinin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Protein saflaştırma, floresan spektroskopisi ve kinetik veri analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Manyetik karıştırma ve şırınga enjeksiyon kabiliyetine sahip, sıcaklık kontrollü bir spektroflorometreye erişime bağlıdır.
- Reaksiyon yorumlamasını karıştırabilecek nükleaz ve helikaz kontaminantlarını dışlamak için standartlaştırılmış protein hazırlığı gerektirir.
- Saptanabilir FRET sinyalleri sağlamak için her bir hedef tür için oligonükleotid işaretlemesinin ve konsantrasyonunun optimizasyonunu gerektirir.
- In vitro sistemlerle sınırlıdır; in vivo ortamda mevcut olan kromatin veya nükleer bağlam etkilerini kapsamaz.
