Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması
March 23rd, 2020
Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.
Proteinlerin küçük protein ubiquitin tarafından post çevirisel modifikasyonu hücredeki birçok olaya dahil edilir. Bu çalışma protein her yerde analiz için araç kutusuna orijinal bir ek sunar. Biz derin ubiquitinome ortaya çıkarmak için zenginleştirme teknikleri ve kütle spektrometresi kullanın.
Biz her yerde proteinler kaynaklanan diGly peptidlerin analizinde çeşitli iyileştirmeler yaptık. Bunlar arasında zenginleştirme den önce ham peptid fraksiyonu ve Orbitrap'ta daha gelişmiş peptid parçalanma ayarlarının uygulanması sayılabilir. Tamamen bu ubiquitinome daha büyük bir kapsama sonuçları.
Protokolün çeşitli yönlerini kelimelerle açıklamak zordur. Bu analizleri farklı bir laboratuvarda farklı bir operatör tarafından tekrarlayabilmek için bazı önemli adımların görselleştirilmesi esastır. Prosedür Karel Bezstarosti, benim laboratuvarda kıdemli bir teknisyen tarafından gösterilecek.
Deney için kültürlü hücreleri veya fare beyin dokusu hazırlayarak başlayın. Hücrelerle çalışıyorsanız, hücre peletini 150 santimetre karelik bir kültür plakasından iki mililitre buz soğuk, %0,5 sodyum deoksikolat ile 50 milimolar Tris HCL şeklinde inceltin. Lysate'yi 95 derecede beş dakika kaynatın.
Sonra 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede sonicate. In vivo fare beyin dokusu kullanıyorsanız, 100 milimolar Tris HCL, 12 milimolar sodyum deoksiol atve 12 milimolar sodyum N-lauroylsarcosinatiçeren buz gibi bir tampon içinde lyse. Lysate'yi 10 dakika 4 santigrat derecede sonicate edin.
Sonra 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Daha sonra, başarılı diGly peptid immünopresidivar için en az birkaç miligram olması gereken bir kalorimetrik absorbans BCA protein analiz kiti kullanarak toplam protein miktarını ölçün. SILAC deneyleri için, toplam protein miktarına göre hafif ve ağır etiketli proteinleri bire bir oranında karıştırın.
50 santigrat derecede 30 dakika beş milimolar DTT ile tüm proteinleri azaltın. Ve daha sonra karanlıkta 15 dakika boyunca 10 milimolar iodoacetamide ile alkilleyin. Daha sonra lys-c ile protein sindirimini dört saat boyunca gerçekleştirin.
Ve tripsin bir gecede 30 santigrat derecede veya oda sıcaklığında sindirim. Ertesi gün, iki mililitre Eppendorf tüpleri içine örnek bölün ve 10 dakika boyunca 10, 000 kez G 10 dakika son konsantrasyona sindirilmiş örnek TFA ekleyin ve tüm deterjan kaldırmak. Sonraki fraksiyonu için supernatant içeren peptid toplamak.
Triptik peptidleri fraksiyonetmek için yüksek pH ters faz C18 kromatografisi kullanın. Yaklaşık 10 miligram protein sindirimi için 0,5 gram sabit faz malzemesi ile doldurulmuş boş altı mililitrelik bir sütun kartuşu hazırlayın. Hazırlanan kolon üzerine peptidler yükleyin ve yaklaşık 10 hacimleri ile yıkayın 0.1% TFA, su 10 hacimleri takip.
Peptidleri sırasıyla yedi, 13,5 ve %50 asetonitril ile 10 milimolar amonyum formatı 10 sütun hacmi kullanarak üç fraksiyona ayırın. Sonra, litholyse tüm kesirler. Proteina konjuge ubiquitin kalıntısı motif antikorlarının bir kısmı agarose boncuk bulamacı altı eşit fraksiyona ayrılır.
Üç peptit fraksiyonunu el yazması yönlere göre eritin ve enkazı aşağı doğru döndürün. Diğer üç fraksiyonu buzüzerinde tutarken boncuk bulamacına üç fraksiyonun supernatants ekleyin. Ve onları bir rotator ünitesinde dört santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
O zaman boncukları aşağı çevir. Supernatant'ı yeni bir boncuk partisine aktarın. Ve kalan üç boncuk bulamaç fraksiyonları ile kuluçka tekrarlayın.
Sonraki küresel proteom analizi için süpernatantları saklayın. Ve boncukları GFF filtre fişi ile donatılmış 200 mikrolitrelik pipet ucuna aktarın. Bir santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mililitre tüpler içine ipuçları koyun ve buz gibi soğuk IAP tampon 200 mikrolitre ile boncuk üç kez yıkayın, buz gibi saf su ile üç yıkama takip.
Sütunları 200 kez G'de iki dakika boyunca yıkarak sütunun kurumasını beklemeyin. Son yıkamadan sonra, %0,15 TFA'nın 50 mikrolitresi ile iki çevrim ile peptidleri eute. Bir C18 sahne ucu ile peptidler desalt ve vakum santrifüj ile kuru.
Nanoflow LC sistemine bağlı hassas bir kütle spektrometresi üzerinde LC-MS/MS deneyleri yapın. Sütun el yazması talimatlara göre ayarlanır ve 50 santigrat derecede tutulur. Veribağımlı edinme modunda kütle spektrometresini çalıştırın.
MS1 kütle spektrumlarını otomatik kazanç kontrollü hedef ayarı 4E5 ve maksimum enjeksiyon süresi 50 milisaniye ile yüksek çözünürlükte toplayın. Toplam üç saniyelik çevrim süresiyle en yüksek hız yöntemini kullanarak kütle spektrometresi analizini en yoğun ilk modda gerçekleştirin. Daha sonra en az yoğun ilk modda ikinci bir DDA MS analizi gerçekleştirin, bu da düşük bolluk peptidlerinin en iyi şekilde algılanmasını sağlayacaktır.
Öncül iyonları yük durumlarına ve monoisotopik atamaya göre filtreleyin. Ve daha önce sorgulanmış öncülleri 60 saniye boyunca dinamik olarak hariç tut. 1.6 Thomson genişliğinde bir quadrupole kütle filtresi ile peptit öncüleri izole.
Daha sonra maksimum enjeksiyon süresi 50 milisaniye ve HCD çarpışma enerjisi ile 7E3'ün otomatik kazanç kontrolünde iyon kapanında MS2 spektrumları toplayın ve %30 HCD çarpışma enerjisi, Andromeda arama motoruna dayalı serbestçe kullanılabilir MaxQuant yazılım paketi gibi uygun bir arama motoru kullanarak kütle spektrometresi ham dosyalarını analiz edin. MaxQuant'ı açın ve uygun ham veri dosyalarını seçin. İşlemci sayısını ayarlayın ve gruba özgü parametreler sekmesine tıklayın.
Sindirim seçin ve üç cevapsız dekolte için izin. Ardından değişiklikleri seçin ve değişken değişikliklere diGly ekleyin. Küresel parametreler sekmesini seçin ve doğru protein sırası veritabanını ekleyin.
Diğer ayarları varsayılan olarak bırakın ve veritabanı aramasını gerçekleştirmek için başlat'a basın. SILAC deneme dosyalarının nicel analizi için, çokluğu ikiye ayarlayın ve ağır amino asit etiketlerini seçin. Arama tamamlandığında metin dosyalarını Perseus'a aktarın.
Bu protokol, nanoakış LC-MS/MS ile diGly peptidler tespit edilerek kültürlü hücrelerden ve in vivo materyalden proteinlerde her yerde bulunan bölgeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Mevcut protokolde çeşitli iyileştirmeler yapıldı ve bu da tespit edilen diGly peptidlerin sayısının artmasıyla sonuçlandı. İmmünyağıştan önce üç fraksiyona ham bir fraksiyon yapıldı.
Kesirlerden biri ubiquitin kendi K48 modifiye triptik diGly peptid içerir, LC kromatogramgeniş bir tepe ile karakterizedir. Ayrıca, peptit parçalanma rejimi, 4.000'den fazla ek benzersiz diGly peptid ler üretilen veri analizi prosedüründe en yüksek ilk ve en düşük ilk parçalanma rejimleri ile LC-MS çalışır birleştirmek için ayarlandı. 23'ten fazla, 000 diGly peptidler rutin bir proteozom inhibitörü ile tedavi HeLa hücrelerinin tek bir örnek lem tespit edilebilir.
Üç biyolojik çoğaltma ekranı üzerinde tanımlanan tüm diGly peptidler, 9,000'den fazlası her üçünde de mevcuttu, 17.000'den fazlası ise üç kopyadan en az ikisinde mevcuttu. Peptit tanımlamalarının sayısı giriş materyalinin miktarına göre oldukça fazladır. Tanımlanan diGly peptidlerin yaklaşık sayısı başlangıç malzemesine bağlı olarak beklenebilir, ancak bu sayılar sadece tahminlerdir ve aynı zamanda kullanılan kütle spektrometresinin türüne de bağlıdır.
Bu protokolü gerçekleştirirken, kütle spektrometresi temelli proteomik yöntemler ve dakika numune miktarlarının işlenmesi ve analiz edilmesi ile ilgili daha önceki deneyimler kesinlikle avantajlı olacaktır. MaxQuant yazılımı başka bir veritabanı arama algoritması ile değiştirilebilir. Ayrıca farklı tipte kütle spektrometresi de kullanılabilir.
Peptit tanımlamaları açısından sonuçlar biraz farklı olabilir, ancak bu herhangi bir kütle spektrometresi tabanlı proteomik tahsin için tipiktir. Ubiquitin aracılı protein bozulması nın ilerlemesinde önemlidir, ama aynı zamanda hücredeki diğer birçok süreçlerde bir rol oynar. Bir post çevirisel modifikasyon olarak ubiquitin derin bilgi daha iyi işlevini anlamak için çok önemlidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, karmaşık biyolojik örneklerde ubikuitinleşmiş proteinlerden türetilen diGly peptitlerinin saflaştırılması, tespiti ve tanımlanması için yeni bir yöntem sunar. Yaklaşım, geliştirilmiş teknikler ve sağlam metodolojilerle ubikuitinomu analizini artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein ubikuitinasyonu
- Kütle spektrometrisi
- Biyolojik örnek analizi
Arka Plan
- Ubikuitinasyon, hücresel süreçlerde kritik bir post-translasyonel modifikasyondur.
- Ubikuitinomu anlamak, protein regülasyonu hakkındaki bilgiler için gereklidir.
- Mevcut diGly peptitleri analiz yöntemlerinin derinlik ve tekrarlanabilirlik açısından sınırlamaları vardır.
- Bu çalışma, bu sınırlamaları geliştirilmiş tekniklerle ele almayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Ubikuitinleşmiş proteinlerden diGly peptitleri analiz etmek için sağlam bir yöntem geliştirmek.
- Ubikuitinomu analizinin kapsamını ve derinliğini artırmak.
- Alandaki araştırmacılar için tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Zenginleştirme öncesi ham peptid fraksiyonlaması.
- Orbitrap kütle spektrometrinde gelişmiş peptid parçalanma ayarları.
- diGly peptitleri izole etmek için zenginleştirme teknikleri.
- Ubikuitinomunun detaylı analizi için kütle spektrometrisi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, mevcut tekniklere kıyasla üstün performans göstermiştir.
- Ubikuitinomunun önemli ölçüde daha geniş kapsamı elde edilmiştir.
- Tekrarlanabilirlik ve sağlamlık, birden fazla deneme ile doğrulanmıştır.
- Çalışma, gelecekteki ubikuitinasyon araştırmaları için değerli bir araç sağlamaktadır.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, ubikuitinleşmiş proteinlerin analizini geliştirir.
- Ubikuitinomu hakkında daha kapsamlı bir anlayış sunar.
- Bu yaklaşım, protein regülasyonu ve hücresel süreçler üzerindeki araştırmaları kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables deep profiling of the ubiquitinome, a critical post-translational modification network involved in protein degradation, signaling, and stress response. By improving detection of diGly peptides through fractionation and advanced mass spectrometry settings, it enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports reproducible, quantitative ubiquitination site mapping across cell types and tissues, informing portfolio decisions on targets linked to proteostasis and disease pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ubiquitination dynamics to clarify protein turnover pathways and functional target validation.
- Operational Value: Provides a robust workflow for identifying modification sites that support hypothesis-driven target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-confidence diGly peptide readouts for assay standardization in ubiquitin-focused screening campaigns.
- Operational Value: Enables scalable enrichment and LC-MS/MS protocols suitable for cross-lab reproducibility in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant ubiquitinome profiling in models like HeLa cells and mouse brain tissue to align with translational biomarker discovery.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing quantitative ubiquitination data across biological replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets regulated by ubiquitination-dependent degradation or activation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ubiquitin-mediated protein regulation and pathway clarification via site-specific modification mapping.
- Screening: Enables assay-ready preparation of ubiquitinated peptide pools for evaluating compound effects on ubiquitin ligase or deubiquitinase activity.
- Analytics: Generates quantitative diGly peptide measurements that allow comparison of ubiquitination states across conditions and time points.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo ubiquitinome profiles in tissues such as brain, supporting biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, fractionation-enhanced workflow for routine ubiquitinome analysis across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by reducing ambiguity in ubiquitination site assignment and functional impact.
- Operational Value: Improves reproducibility and sensitivity through offline fractionation and optimized ion routing, enabling consistent detection of over 23,000 diGly peptides per sample.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing deep ubiquitinome coverage that de-risks targets involved in protein homeostasis pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on ubiquitination dynamics and pathway involvement in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sample preparation, immunoprecipitation, and mass spectrometry-based proteomics.
- Dependent on access to high-resolution LC-MS/MS systems with data-dependent acquisition and ion trap capabilities.
- Necessitates standardization of lysis, digestion, and enrichment protocols across teams for reproducible results.
- Adaptation to different sample types (e.g., tissues vs. cultured cells) requires optimization of lysis buffer and input material quantity.
- Practical limitations include variability in peptide identification based on starting material mass and instrument sensitivity, as noted in replicate consistency.
