Name: Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Öğrenin, peptit zenginleştirme ve kütle spektrometresi kullanarak ubiquitinasyon sitelerini nasıl saptayacağınızı. Bu yöntem, ubiquitinome analizinde daha derin kapsama ve güçlü tekrarlanabilirlik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) tarafından Ulusal Yol Haritası Büyük Ölçekli Araştırma Tesisleri (proje numarası 184.032.201) kapsamında finanse edilen Hollanda Proteomik Merkezi'nin bir programı olan "Proteins at Work" projesinin bir parçasıdır. ).

Burada açıklanan tüm yöntemler Erasmus MC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (EDC) tarafından onaylanmıştır.
1. Örnek hazırlama
<ol><li>Kültürlü hücreler<ol>
<li>İlgi çekici bir hücre hattı (örneğin, HeLa veya osteosarkom [U2OS] hücreleri) seçin ve Dulbecco'nun Minimal Eagle Medium (DMEM) hücreleri% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve 100 adet/ mL penisilin / streptomisin ile takviye hücreleri büyümek.</li>
		<li>Kantitatif proteomik deneyler için, DMEM kültür hücreleri arginin ve lizin yoksun. Ortam %10 diyalizfetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 100 ünite/mL penisilin/streptomisin ve alanin-glutamin ile desteklenmelidir. Konvansiyonel lizin ve arginin ('Işık' Orta) veya lizin-8(13C6; 15N2) ve arginin-10 (13C6; 15N4) ('Ağır' Orta), sırasıyla.</li>
		<li>Heavy Medium kültüründeki tüm proteinlerin ağır kararlı izotop içeren olarak etiketlenmelerini sağlamak için genişleme ve tedaviden önce en az altı katlama için Light Medium (yani etiketlenmemiş) ve Heavy Medium (yani etiketlenmemiş) ve Heavy Medium'daki hücrelerin kültür toplu lukları amino asitler.</li>
		<li>Hücreleri 8 saat boyunca 10 μM proteozomib veya eşdeğer bir DMSO hacmi ile sahte bir tedavi olarak tedavi edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, %1 tripsin/EDTA kullanarak ayırın ve hücreleri peletleyin.</li>
		<li>Hücre peletini bir 150 cm2 kültür plakasından 2 mL buz gibi 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) ve %0,5 sodyum deoksikoilat (DOC) test edin. Lysat'ı 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve 10 dakika sonicate (Malzeme Tablosundalistelenen sonicator için "H" ayarı) 4 °C'de kaynatın. N-etilmaleimid (NEM) gibi deubiquitinaz inhibitörlerinin kullanılmasını önermiyoruz, çünkü bu peptit tanımlamasını zorlaştırabilecek istenmeyen protein modifikasyonlarına neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In vivo fare beyin dokusu<ol>
<li>In vivo doku kullanırken, 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 12 mM sodyum DOC ve 12 mM sodyum N-lauroylsarcosinate17içeren buz gibi bir tampon doku lyse . 4 °C'de 10 dakika (Malzeme Tablosundalistelenen sonicator için "H" ayarı) için lysate'yi sonicate edin ve 95 °C'de 5 dakika kaynatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kolorimetrik absorbe BCA protein teşp kiti kullanarak toplam protein miktarını hesaplatın. Başarılı bir diGly peptid immünopresipitendivarı (IP) için toplam protein miktarı en az birkaç miligram olmalıdır. SILAC deneyleri için, hafif ve ağır etiketli proteinler toplam protein miktarına göre 1:1 oranında karıştırılır.</li>
	<li>5m 1,4-dithiothreitol kullanarak tüm proteinleri 50 °C'de 30 dakika boyunca azaltın ve daha sonra karanlıkta 15 dakika boyunca 10 mM iyodoacetamid ile alkilleyin. Protein sindirimini Lys-C (1:200 enzim-substrat oranı) ile 4 saat boyunca, ardından 30 °C'de veya oda sıcaklığında (RT) tripsin (1:50 enzim-substrat oranı) ile gece sindirimini gerçekleştirin.</li>
	<li>Sindirilmiş numuneye trifloroasetik asit (TFA) ekleyin ve tüm deterjanları çökeltmek ve çıkarmak için numuneyi 10.000 x g'de 10.000 x g olarak santrifüj edin. Sonraki fraksiyonu için peptidler içeren supernatant toplamak.</li>
</ol>2. Çevrimdışı peptid fraksiyonu
<ol><li>Triptik peptidleri fraksiyonetmek için boş bir sütun kartuşuna yüklenen polimerik sabit faz malzemesiyle (300 Å, 50 μM; bkz. Malzeme Tablosu)yüklü yüksek pH ters faz (RP) C18 kromatografisi kullanın. Sabit faz yatak boyutu kesirli olması için protein sindirimi miktarına ayarlanmalıdır. ~10 mg protein sindirimi için 0,5 g sabit faz malzemesi ile doldurulmuş boş bir 6 mL sütun kartuşu hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu). Protein sindirimi nin sabit faz oranı yaklaşık 1:50 (w/w) olmalıdır.</li>
	<li>Peptitleri hazırlanan kolona yükleyin ve kolon %0,1 TFA'nın yaklaşık 10 sütun hacmi yle yıkayın ve ardından yaklaşık 10 sütun hacmi H2O'yu takip edin.</li>
	<li>Peptitleri sırasıyla %7, %13,5 ve %50 asetonitril (AcN) ile 10 mM amonyum formatı çözeltisi (pH = 10) olmak üzere 10 sütun hacmine sahip üç fraksiyona ayırın. Tamlığa tüm kesirleri lyophilize.</li>
	<li>DiGly peptidlerin immünzenginleştirilmesi için protein a agarose boncuklar konjuge ubiquitin kalıntı motifi (K-ε-GG) antikorları kullanın. Boncuk toplu başına antikor tam miktarı tescilli bilgi ve üretici tarafından açıklanmadığından, karışıklık önlemek için üretici yaptığı gibi boncuk bir toplu için aynı tanımı kullanılması tavsiye edilir. Bu boncuklardan bir parti 2x PBS ile yıkayın ve boncuk bulamacını altı eşit kesire bölün. Ayrıntılı bir deneysel şema için Şekil 1'e bakın.</li>
	<li>Adım 2.3'te toplanan üç peptit fraksiyonunu 50 mM MOPS, 10 mM sodyum fosfat ve 50 mM NaCl (pH = 7,2) oluşan bir tamponun 1,4 mL'sinde çözün ve enkazı aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Kesirlerin süpernatantlarını diGly antikor boncuklarına ekleyin ve bir rotator ünitesinde 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Boncukları aşağı çevirin ve süpernatant'ı yeni bir antikor boncuk partisine aktarın ve 4 °C'de 2 saat boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Sonraki küresel proteom (GP) analizi için süpernatantları saklayın.</li>
	<li>Boncukları korumak için boncukları her fraksiyondan GF/F filtre fişi ile donatılmış 200 μL'lik pipet ucuna aktarın. Boncuklu pipet ucunu santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe koyun. Boncukları 3x 200 μL buz gibi IAP tamponu yla yıkayın ve daha sonra 3x 200 μL buz gibi miliQ H2O. Her yıkama adımından önce 2 00 x g'de 2 dk'da kolona doğru çevirin, ancak sütunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin. %0,15 TFA'nın 50 μL'lik 2 döngüsü kullanılarak peptidleri eute.</li>
	<li>C18 kademeli uç (aslında iki C18 diskli 200 μL pipet ucu) kullanarak peptidleri tuzlayın ve vakum santrifüjü kullanarak tamlığa kadar kurulayın.</li>
</ol>3. Nanoflow LC-MS/MS
<ol><li>Nanoflow LC sistemine bağlı hassas bir kütle spektrometresi üzerinde LC-MS/MS deneyleri yapın.</li>
	<li>CSH130 reçine (3,5 μm, 130 Å) ile paketlenmiş 75 μm iç çapı ile bir şirket içi paketlenmiş 50 cm ters faz lı kolon kullanın ve 300 nL/dk'da 120 dk'nın üzerinde %2−28 (AcN, %0,1 FA) bir degrade ile peptidleri yakınlaştırın, alternatif olarak benzer özelliklere sahip ticari olarak mevcut LC sütunları kullanın. Sütunu bir sütun fırını kullanarak 50 °C'de tutun (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Kütle spektrometresi analizini yapın.<ol>
<li>Kütle spektrometresi veriye bağlı kazanım (DDA) modunda çalıştırılmalıdır. MS1 kütle spektrumları yüksek çözünürlükte (örn. 120.000), otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef ayarı 4E5 ve Orbitrap kütle spektrometresi durumunda maksimum 50 ms enjeksiyon süresi ile toplanmalıdır.</li>
		<li>Önce "Önce En Yüksek Yoğunluk" modunda kütle spektrometresi analizini yapın. Bu şekilde, en yoğun iyon parçalanma için ilk seçilir, daha sonra ikinci en yüksek, ve benzeri, 3 s toplam çevrim süresi ile en yüksek hız yöntemi kullanılarak. Daha sonra, "Önce En Düşük Yoğunluklu" modunda ikinci bir DDA MS analizi turu gerçekleştirin, böylece en az yoğun iyon önce, sonra ikinci en düşük ve benzeri seçilir. Bu strateji, çok düşük bolluk peptidlerin en iyi şekilde algılanmasını sağlar.</li>
		<li>Öncül iyonları şarj durumlarına (2-7 şarj) ve monoizotopik atamaya göre filtreleyin. Daha önce sorgulanmış öncülleri 60 s. Dörtkutuplu kütle filtresi 1,6 Th genişliğe ayarlanmış peptid öncülerini izole edin.</li>
		<li>Maksimum enjeksiyon süresi 50 ms ve HCD çarpışma enerjisi %30 olan 7E3 AGC'de iyon kapanında MS2 spektrumlarını toplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Andromeda arama motoru18,dayalı serbestçe kullanılabilir MaxQuant yazılım paketi gibi uygun bir arama motoru kullanarak kütle spektrometresi ham dosyaları analiz ,19. MaxQuant'ta, aşağıda belirtilen birkaç uyarlamaiçeren varsayılan ayarları seçin. Enzim özgüllüğünü tripsin olarak ayarlayın ve en fazla kaçırılan dekolte sayısı üçe yükseltilir. DiGly kalıntısı (+114.04 Da) ile lizin ayarlayın, metiyonin ve N-terminal asetilasyonunun oksidasyonu değişken modifikasyonlar olarak ve sistein karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın.</li>
	<li>Veritabanı aramalarını, örneğin, Tek prot deposu<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">(https://www.uniprot.org/downloads)</a>ile birlikte indirilen protein dizilerini içeren bir FASTA dosyasına karşı gerçekleştirin ve otomatik olarak MaxQuant tarafından sağlanan standart bir ortak kirletici veritabanıile birlikte yapın. Yanlış bulma oranını (FDR) %1'e ayarlayın ve değiştirilmiş (diGly) peptidler için minimum puanı 40 (varsayılan değer) olarak ayarlayın. C-terminal diGly modifiye lisin kalıntısı ile tanımlanan peptidleri daha ileri analizlerden dışlayın.</li>
	<li>SILAC deneme dosyalarının nicel analizi için, çokluğu "2" olarak ayarlayın ve 4.2 adımını yineleyin.</li>
	<li>MaxQuant yazılım paketinin Perseus modülü20 ile tüm downstream analizlerini (örn. istatistikler, gen ontoloji analizleri) gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Burada açıklanan protokol, kültür hücreleri ve in vivo doku gibi çeşitli biyolojik kaynaklardan alınan örneklere uygulanmıştır. Her durumda, toplam protein giriş miktarının en az 1 mg olması koşuluyla binlerce diGly peptid tespit ettik. Spesifik antikorlar kullanılarak zenginleştirme, ubikitinated proteinler veya diGly peptidler için hiçbir zenginleştirme prosedürleri uygulanmış ise sadece en fazla 100-150 çok düşük bol diGly peptidler tüm hücre lysates tespit edildiği göz önüne alındığında, son derece etkilidir. Açıkças...

Proteinlere ubiquitin konjugasyonu proteozom tarafından bozulması için onları işaretler ve proteostaz önemli bir süreçtir. Ubikitin C-terminal karboksil grubu hedef protein1,,2lizin ε-amino grubu ile bir izopeptid bağ oluşturur. Buna ek olarak, ubikitin diğer ubikitin modülleri eklenebilir, homojen oluşumu ile sonuçlanan (yani, K48 veya K11) veya dallı (yani, heterojen veya karışık) poliubiquitin yapılar1,3. Ubiquitin en iyi bilinen fonksiyonu proteazomal bozulma rolüdür, K48 bağlı poliubiquitin aracılık. Ancak, hem mono-hem de poliubiquitination da proteozom tarafından bozulmabağımsız birçok süreçte rol oynadığı açık hale gelmiştir. Örneğin, K63 bağlı zincirleri hücre içi ticareti, lizomal bozulma, kinaz sinyalizasyonu ve DNA hasar yanıtı4,,5nondegradative rolleri var. Diğer altı bağlantı türleri daha az bol ve rolleri hala büyük ölçüde esrarengiz, hücredeki işlevleri hakkında ilk göstergeler ortaya çıkıyor olsa da, büyük ölçüde bağlantı-özel algılama sağlamak için yeni araçların geliştirilmesi nedeniyle6,7.
Kütle spektrometresi proteom analizleri için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir ve günümüzde hemen hemen her biyolojik kaynaktan binlerce farklı protein tek bir deneyde tespit edilebilir. Protein aktivitesini modüle edebilen proteinlerin (örn. fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon ve her yerde) posttranslational modifikasyonları (PtM'ler) ile ek bir karmaşıklık tabakası sunulur. PTM taşıyan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanması da kütle spektrometresi alanındaki gelişmelerle mümkün olmuştur. PBM'leri taşıyan peptidlerin, değiştirilmemiş muadillerine göre nispeten düşük stoiyometrisi teknik bir zorluk teşkil eder ve kütle spektrometresi analizi öncesinde biyokimyasal zenginleştirme adımları genellikle gereklidir. Son yirmi yılda, PTM'lerin analizi için birkaç farklı özel zenginleştirme yöntemi geliştirilmiştir.
Hücrede protein ubiquitination çok yönlü rolleri nedeniyle, proteinler üzerinde ubikitinasyon sitelerinin tespiti için analitik yöntemlerin geliştirilmesi için büyük bir talep var8. Kütle spektrometrik yöntemlerin uygulanması meyve sinek, fare, insan ve maya proteinleri9,10,,11,12,13,14tanımlanan ubiquitination sitelerin in sayısının bir patlamaya yol açmıştır . K-ε-GG kalıntısı motifine (ayrıca 'diglycine' veya 'diGly' olarak da adlandırılır) karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak peptid düzeyinde immünopreprezet bazlı zenginleştirme stratejilerinin geliştirilmesi ile önemli bir adım sunulmuştur. Bu diGly peptidler proteazolaraktripsin kullanarak her yerde proteinlerin sindirim üzerine üretilir15 ,16.
Burada, orbitrap kütle spektrometresi tarafından immünpurifikasyon ve sonraki tespiti kullanarak diGly peptidler için zenginleştirmek için optimize edilmiş bir iş akışı saiyoruz. Özellikle numune hazırlama ve kütle spektrometresi aşamalarında mevcut iş akışlarının çeşitli değişikliklerinin bir kombinasyonunu kullanarak, proteozom ile tedavi edilen Tek Bir HeLa hücresi örneğinden rutin olarak 23.000'den fazla diGly peptid tespit edebiliriz. inhibitörü ve tedavi edilmeyen HeLa hücrelerinden ~ 10.000. Bu protokolü, hücre kültüründe (SILAC) etiketli amino asitlerle etiketsiz ve kararlı izotop etiketlemeden gelen lysatlara ve beyin dokusu gibi endojen örneklere uyguladık.
Bu iş akışı, derin ubiquitinome ortaya çıkarmak için her yerde analiz için araçların repertuar değerli bir ek sunuyor. Aşağıdaki protokol, iş akışının tüm adımlarını ayrıntılı olarak açıklar.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditioeritritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Oktadesil diskler</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>ürünü Supelco'da durduruldu; CDS Analitik, yeni üretici (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr><tr><td>Amonyum format</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 reçinesi, 3.5 & m, 130 & Aring;</td><td>Sular</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF / F filtre tapası</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lizin, Arginin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizin-8 (13C6; 15N2), Arginin-10 (13C6; 15N4)</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizil Endopeptidaz (LysC)</td><td>Wako Saf Kimyasallar</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>NanoLC fırın</td><td>MPI tasarımı, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos kütle spektrometresi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &aring;, 50 &mikro; m) polimerik ters faz parçacıkları</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Kalıntı Motifi (K-&epsilon;-GG) Kiti</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Kartuşlu</td><td>Sular</td><td>WAT036790</td> Kartuşu PLRP-S Sodyum deoksikolat Sigma-Aldrich 30970 <td>ile doldurmadan önce tC18 malzemesini kartuştan çıkarın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, TPCK Tedavi</td><td>Edilmiş ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

peptit zenginleştirme ve kütle spektrometresi ile protein ubiquitinasyon sitelerinin saptanması

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Proteinlerin küçük protein ubiquitin tarafından posttranslational modifikasyonu birçok hücresel olaylarda yer almaktadır. Her yerde bulunan proteinlerin triptik sindiriminden sonra, lisin epsilon amino grubuna konjuge bir diglycine kalıntısı olan peptidler ('K-ε-diglycine' veya sadece 'diGly') orijinal modifikasyon bölgesini izlemek için kullanılabilir. Kitle spektrometresi ile hassas algılama ile birlikte diGly peptidlerin etkin immünpurifikasyonu, bugüne kadar tanımlanan ubikitinasyon bölgelerinin sayısında büyük bir artışa yol açmıştır. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Ayrıca, antikor boncukları korumak için filtre tabanlı bir fiş kullanarak numunenin daha verimli temizlenmesi, diGly peptidler için daha fazla özgüllük sağlar. Bu gelişmeler, hücrede proteozom inhibisyonu üzerine insan servikal kanser hücrelerinden 23.000'den fazla diGly peptidin rutin tespiti ile sonuçlanır (HeLa) hücre lisatları. Bu stratejinin etkinliğini, birkaç farklı hücre tipinin ve beyin dokusu gibi in vivo örneklerinin ubiquitinome profillerinin derinlemesine analizi için gösteriyoruz. Bu çalışma derin hücresel ubiquitinome ortaya çıkarmak için protein ubiquitination analizi için araç kutusuna orijinal bir ek sunuyor.

Ubikitinated proteinler, proteinler tripsin ile sindirildiğinde hedef lizin kalıntısında 114.04 Da diglycine kalıntısı bırakırlar. Bu motifin neden olduğu kütle farkı, bir kütle spektrometresi deneyinde her yerde bulunan yeri kesin olarak tanımak için kullanılmıştır. Burada tanımladığımız strateji, nanoflow LC-MS/MS(Şekil 1A)ile diGly peptidlerin zenginleşmesi ve sonraki tanımlaması için son teknoloji ürünü bir yöntemdir. Bu çalışmada, hem kü...

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Proteinlerin küçük protein ubiquitin tarafından post çevirisel modifikasyonu hücredeki birçok olaya dahil edilir. Bu çalışma protein her yerde analiz için araç kutusuna orijinal bir ek sunar. Biz derin ubiquitinome ortaya çıkarmak için zenginleştirme teknikleri ve kütle spektrometresi kullanın.Biz her yerde proteinler kaynaklanan diGly peptidlerin analizinde çeşitli iyileştirmeler yaptık. Bunlar arasında zenginleştirme den önce ham peptid fraksiyonu ve Orbitrap'ta daha gelişmiş peptid parçalanma ayarlarının uygulanması sayılabilir. Tamamen bu ubiquitinome daha büyük bir kapsama sonuçları.Protokolün çeşitli yönlerini kelimelerle açıklamak zordur. Bu analizleri farklı bir laboratuvarda farklı bir operatör tarafından tekrarlayabilmek için bazı önemli adımların görselleştirilmesi esastır. Prosedür Karel Bezstarosti, benim laboratuvarda kıdemli bir teknisyen tarafından gösterilecek.Deney için kültürlü hücreleri veya fare beyin dokusu hazırlayarak başlayın. Hücrelerle çalışıyorsanız, hücre peletini 150 santimetre karelik bir kültür plakasından iki mililitre buz soğuk, %0,5 sodyum deoksikolat ile 50 milimolar Tris HCL şeklinde inceltin. Lysate'yi 95 derecede beş dakika kaynatın.Sonra 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede sonicate. In vivo fare beyin dokusu kullanıyorsanız, 100 milimolar Tris HCL, 12 milimolar sodyum deoksiol atve 12 milimolar sodyum N-lauroylsarcosinatiçeren buz gibi bir tampon içinde lyse. Lysate'yi 10 dakika 4 santigrat derecede sonicate edin.Sonra 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Daha sonra, başarılı diGly peptid immünopresidivar için en az birkaç miligram olması gereken bir kalorimetrik absorbans BCA protein analiz kiti kullanarak toplam protein miktarını ölçün. SILAC deneyleri için, toplam protein miktarına göre hafif ve ağır etiketli proteinleri bire bir oranında karıştırın.50 santigrat derecede 30 dakika beş milimolar DTT ile tüm proteinleri azaltın. Ve daha sonra karanlıkta 15 dakika boyunca 10 milimolar iodoacetamide ile alkilleyin. Daha sonra lys-c ile protein sindirimini dört saat boyunca gerçekleştirin.Ve tripsin bir gecede 30 santigrat derecede veya oda sıcaklığında sindirim. Ertesi gün, iki mililitre Eppendorf tüpleri içine örnek bölün ve 10 dakika boyunca 10, 000 kez G 10 dakika son konsantrasyona sindirilmiş örnek TFA ekleyin ve tüm deterjan kaldırmak. Sonraki fraksiyonu için supernatant içeren peptid toplamak.Triptik peptidleri fraksiyonetmek için yüksek pH ters faz C18 kromatografisi kullanın. Yaklaşık 10 miligram protein sindirimi için 0,5 gram sabit faz malzemesi ile doldurulmuş boş altı mililitrelik bir sütun kartuşu hazırlayın. Hazırlanan kolon üzerine peptidler yükleyin ve yaklaşık 10 hacimleri ile yıkayın 0.1% TFA, su 10 hacimleri takip.Peptidleri sırasıyla yedi, 13,5 ve %50 asetonitril ile 10 milimolar amonyum formatı 10 sütun hacmi kullanarak üç fraksiyona ayırın. Sonra, litholyse tüm kesirler. Proteina konjuge ubiquitin kalıntısı motif antikorlarının bir kısmı agarose boncuk bulamacı altı eşit fraksiyona ayrılır.Üç peptit fraksiyonunu el yazması yönlere göre eritin ve enkazı aşağı doğru döndürün. Diğer üç fraksiyonu buzüzerinde tutarken boncuk bulamacına üç fraksiyonun supernatants ekleyin. Ve onları bir rotator ünitesinde dört santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın.O zaman boncukları aşağı çevir. Supernatant'ı yeni bir boncuk partisine aktarın. Ve kalan üç boncuk bulamaç fraksiyonları ile kuluçka tekrarlayın.Sonraki küresel proteom analizi için süpernatantları saklayın. Ve boncukları GFF filtre fişi ile donatılmış 200 mikrolitrelik pipet ucuna aktarın. Bir santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mililitre tüpler içine ipuçları koyun ve buz gibi soğuk IAP tampon 200 mikrolitre ile boncuk üç kez yıkayın, buz gibi saf su ile üç yıkama takip.Sütunları 200 kez G'de iki dakika boyunca yıkarak sütunun kurumasını beklemeyin. Son yıkamadan sonra, %0,15 TFA'nın 50 mikrolitresi ile iki çevrim ile peptidleri eute. Bir C18 sahne ucu ile peptidler desalt ve vakum santrifüj ile kuru.Nanoflow LC sistemine bağlı hassas bir kütle spektrometresi üzerinde LC-MS/MS deneyleri yapın. Sütun el yazması talimatlara göre ayarlanır ve 50 santigrat derecede tutulur. Veribağımlı edinme modunda kütle spektrometresini çalıştırın.MS1 kütle spektrumlarını otomatik kazanç kontrollü hedef ayarı 4E5 ve maksimum enjeksiyon süresi 50 milisaniye ile yüksek çözünürlükte toplayın. Toplam üç saniyelik çevrim süresiyle en yüksek hız yöntemini kullanarak kütle spektrometresi analizini en yoğun ilk modda gerçekleştirin. Daha sonra en az yoğun ilk modda ikinci bir DDA MS analizi gerçekleştirin, bu da düşük bolluk peptidlerinin en iyi şekilde algılanmasını sağlayacaktır.Öncül iyonları yük durumlarına ve monoisotopik atamaya göre filtreleyin. Ve daha önce sorgulanmış öncülleri 60 saniye boyunca dinamik olarak hariç tut. 1.6 Thomson genişliğinde bir quadrupole kütle filtresi ile peptit öncüleri izole.Daha sonra maksimum enjeksiyon süresi 50 milisaniye ve HCD çarpışma enerjisi ile 7E3'ün otomatik kazanç kontrolünde iyon kapanında MS2 spektrumları toplayın ve %30 HCD çarpışma enerjisi, Andromeda arama motoruna dayalı serbestçe kullanılabilir MaxQuant yazılım paketi gibi uygun bir arama motoru kullanarak kütle spektrometresi ham dosyalarını analiz edin. MaxQuant'ı açın ve uygun ham veri dosyalarını seçin. İşlemci sayısını ayarlayın ve gruba özgü parametreler sekmesine tıklayın.Sindirim seçin ve üç cevapsız dekolte için izin. Ardından değişiklikleri seçin ve değişken değişikliklere diGly ekleyin. Küresel parametreler sekmesini seçin ve doğru protein sırası veritabanını ekleyin.Diğer ayarları varsayılan olarak bırakın ve veritabanı aramasını gerçekleştirmek için başlat'a basın. SILAC deneme dosyalarının nicel analizi için, çokluğu ikiye ayarlayın ve ağır amino asit etiketlerini seçin. Arama tamamlandığında metin dosyalarını Perseus'a aktarın.Bu protokol, nanoakış LC-MS/MS ile diGly peptidler tespit edilerek kültürlü hücrelerden ve in vivo materyalden proteinlerde her yerde bulunan bölgeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Mevcut protokolde çeşitli iyileştirmeler yapıldı ve bu da tespit edilen diGly peptidlerin sayısının artmasıyla sonuçlandı. İmmünyağıştan önce üç fraksiyona ham bir fraksiyon yapıldı.Kesirlerden biri ubiquitin kendi K48 modifiye triptik diGly peptid içerir, LC kromatogramgeniş bir tepe ile karakterizedir. Ayrıca, peptit parçalanma rejimi, 4.000'den fazla ek benzersiz diGly peptid ler üretilen veri analizi prosedüründe en yüksek ilk ve en düşük ilk parçalanma rejimleri ile LC-MS çalışır birleştirmek için ayarlandı. 23'ten fazla, 000 diGly peptidler rutin bir proteozom inhibitörü ile tedavi HeLa hücrelerinin tek bir örnek lem tespit edilebilir.Üç biyolojik çoğaltma ekranı üzerinde tanımlanan tüm diGly peptidler, 9,000'den fazlası her üçünde de mevcuttu, 17.000'den fazlası ise üç kopyadan en az ikisinde mevcuttu. Peptit tanımlamalarının sayısı giriş materyalinin miktarına göre oldukça fazladır. Tanımlanan diGly peptidlerin yaklaşık sayısı başlangıç malzemesine bağlı olarak beklenebilir, ancak bu sayılar sadece tahminlerdir ve aynı zamanda kullanılan kütle spektrometresinin türüne de bağlıdır.Bu protokolü gerçekleştirirken, kütle spektrometresi temelli proteomik yöntemler ve dakika numune miktarlarının işlenmesi ve analiz edilmesi ile ilgili daha önceki deneyimler kesinlikle avantajlı olacaktır. MaxQuant yazılımı başka bir veritabanı arama algoritması ile değiştirilebilir. Ayrıca farklı tipte kütle spektrometresi de kullanılabilir.Peptit tanımlamaları açısından sonuçlar biraz farklı olabilir, ancak bu herhangi bir kütle spektrometresi tabanlı proteomik tahsin için tipiktir. Ubiquitin aracılı protein bozulması nın ilerlemesinde önemlidir, ama aynı zamanda hücredeki diğer birçok süreçlerde bir rol oynar. Bir post çevirisel modifikasyon olarak ubiquitin derin bilgi daha iyi işlevini anlamak için çok önemlidir.

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Bu videoda, bir peptit karışımından fosfopeptitlerin antikor bazlı immünopresipitasyonunu gösteriyoruz. Zenginleştirilmiş fosfopeptitler vakumla konsantre edilir ve aşağı akış analizi için depolanır.

Fosfopeptit Zenginleştirme: Spesifik Fosforile Peptitleri Kompleks Peptit Karışımlarından Ayırmak için Antikor Bazlı Bir İmmünopresipitasyon Tekniği

Bu videoda, karmaşık bir peptit karışımından kalan di-glisin peptitleri içeren ubikitinile peptitlerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, proteindeki orijinal ubikitinasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

Bu iletişim kuralı ayıklamak ve prostat kanseri hücre hatlarından veya doku phosphoproteome ile kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizi için phosphopeptides zenginleştirmek için bir yordam açıklanır.

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.

SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler

Öğrenin, peptit zenginleştirme ve kütle spektrometresi kullanarak ubiquitinasyon sitelerini nasıl saptayacağınızı. Bu yöntem, ubiquitinome analizinde daha derin kapsama ve güçlü tekrarlanabilirlik sağlar.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Daha fazla video keşfet