Name: Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin farelerde alveoler makrofaj fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa bakteri izni analiz yöntemlerini. Bu teknik immünoloji ve mikrobiyoloji araştırmalarında bağışıklık yanıtlarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser grant R01HL116826 için X. Zhao tarafından desteklenmektedir.

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Doğu Virginia Tıp Fakültesi kuralları izler.
1. floresan boncuk fagositoz
<ol><li>Fare ötenazi (C57BL/6J, 6 hafta yaşlı, kadın) hayvanların IACUC iletişim kuralları etik ötenazi için göre CO2 boğulma tarafından.</li>
	<li>Kağıt havlu ile kaplı bir diseksiyon tahta üzerinde fareyi atmasından yatıyordu. Onun pençeleri ile onun bacaklarda spread-eagle pin ve böylece geri nefes borusunu düz konumlandırılmış başını çekmeye ön dişler ve düzeyi altında bir dize kanca.</li>
	<li>Fare boğaz, göğüs ve karın dezenfekte ve kürk araçlar yapışmasını önlemek için % 70 etanol ile ıslak.</li>
	<li>Düzenli forseps kullanarak, Cilt, vücut merkez yukarı çekin ve Merkez Cerrahi makas ile boğaz üstüne kesmek.</li>
	<li>Standart Cerrahi makas künt sonuna kullanarak, dikkatle kas ve bağ dokusu üzerinde boğaz uzaklaşmaya ve trakea ortaya çıkarmak için Bahar makas (microscissors) kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Kıkırdak halka Forseps ile sürükleyici, dikkatle microscissors, nefes borusu ventrikül yüzünde kullanarak küçük bir insizyon attım (~1.5 mm), yapmak ve bir 18 G kanül nefes borusu yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça lavaj fosfat tamponlu tuz (PBS), bir seferde 1 mL 3 mL. Her zaman hafifçe şırınga ve akciğer geri reinfuse içine sıvı geri art arda 3 x. BALF topladıktan sonra ötenazi sağlamak için servikal çıkığı gerçekleştirin. Pelet toplamak ve toplanan PBS bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) olan (~2.8 mL), bir tüp, 10 dk 1000 x g, santrifüj transfer. Taze PBS 1 mL tüp ve santrifüj 1000 x g enkaz yıkama ve pelleted alveoler makrofajlar toplamak için 10 dakika için de ekleyin.</li>
	<li>Pelet 2 ml % 10 nonheat inaktive fetal sığır serum (FBS) ve kültür birincil alveoler makrofajlar aynı medya ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 2 gündür oksijen bir atmosferde 37 ° C'de bir cam alt çanak üzerinde resuspend.</li>
	<li>Eski medya Aspire edin, PBS 1 mL ile yıkayın ve 2 mL taze medya ekleyin. FITC boncuk (Karboksile lateks boncuk, çapı 2 µm, 50 boncuk/hücre) ekleyin ve oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Kapsamlı ekstraselüler boncuk kaldırmak için PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) ile yıkayın. 100 hücreleri Rastgele Resim ve hücre içi boncuk ile hücreleri saymak (488 nm). Not: Phagocytic dizinler hafızanın boncuk makrofajlar toplam numarasına göre bölünmüş vardır; Fagositik hücreleri makrofajlar16toplam numarasına göre bölünmüş en az bir boncuk yemek makrofajlar sayısı yüzdesidir.<ol>
<li>Alternatif olarak, 1 h kuluçka boncuk ile sonra PBS 3 mL hücrelerle yıkama ve onları fagositoz miktar için Akış Sitometresi için süreç. Benzer şekilde, AMs günahı hücreleri veya kontrol hücreleri olarak boncuk olmadan işlem. Yüzde pozitifliği hesaplamak ve floresan yoğunluğu, Akış Sitometresi yazılım, yazılımın bu seçenekleri seçerek kullanarak demek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FcγR ve CR aracılı fagositoz
<ol><li>Opsonizasyonla için 2 x 108 koyun kırmızı kan hücreleri (SRBCs) ile 50 µL tavşan anti-Hazırlanan-IgM ya da tavşan anti-Hazırlanan-IgG için oda sıcaklığında1130 dk 50 µL kuluçkaya.</li>
	<li>SRBCs ile 50 µL 37 ° C'de 30 dk için C5-eksik (C5D) insan serum IgM opsonized tamamlayıcı parçaları C3b ve C3bi IgM kaplı SRBCs düzeltmek için kuluçkaya.</li>
	<li>Tohum fare makrofaj hücreleri (MH-S hücreleri) (10.000 hücre/de) bir 96-şey plaka ve ~ %70 izdiham almak için bir gecede kuluçkaya. 1 x 107/mL 100 µL SRBCs MH-S hücreleri her şey için opsonized ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Yıkama bağlı olmayan SRBCs çok hızlı (~ 1 dk) amonyum klorür-potasyum (ACK) lizis arabelleği 100 µL ile.</li>
	<li>% 0.1 SDS içeren hücreleri parçalayıcı ve 2,7-diaminofluorene (DAF) %3 hidrojen peroksit ve 6 M üre içeren 50 µL ekleyin. 620, fluorene mavi hemoglobin katalize oluşumu Absorbans ölçmek nm.</li>
	<li>Standart bir eğri 620 nm Absorbans değerleriyle SRBCs bilinen bir dizi kullanarak SRBCs sayısını belirleyin. Benzer şekilde, işlem MH-S hücreleri negatif denetimlerini kullanmak için nonopsonized SRBCs ile inkübe.</li>
</ol>3. PRR aracılı fagositoz
<ol><li>1.1-1.9 yalıtım ve fare birincil alveoler makrofajlar kültür için adımları izleyin.</li>
	<li>2 gün sonra medyayı çıkarın, PBS 1 mL hücrelerle yıkayın ve taze medya Alexa Fluor 488 Birleşik zymosan-A bioparticles (100 parçacıklar/çanak) içeren 500 µL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Fagositoz buz gibi PBS 500 µL ekleyerek durdurmak.</li>
	<li>PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) yoğun hücrelerle yıkayın. %4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika ile hücreleri tamir.</li>
	<li>PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) yoğun hücrelerle yıkama ve hücreleri PBS 500 µL içinde tutmak.</li>
	<li>Hücreleri farklı girişim kontrast ve 488 floresan bir kanalda altında görüntü nm. Zymosan-A bioparticles içeren AMs saymak ve fagositoz yüzdesini belirlemek.</li>
</ol>4. içinde Vivo fagositoz alveoler makrofajlar tarafından
Not: P. aeruginosa GFP besin agar tabağa aşılamak ve 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Ertesi gün, koloni besin suyu 2 ml aşılamak ve 37 ° C'de bakteri gecede büyümek.
<ol><li>Ertesi gün, 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine mayi bir yönetim ile fareler anestezi. Uygun anesthetization yanıt-e doğru ayak parmağı çimdik eksikliği ile onaylayın.</li>
	<li>Fareyi düz bir tahta üzerinde bir lastik bant ile üst kesici dişler arasında yatıyordu ve menfez yüzey ve yukarı bakacak şekilde Kürsüsü ile semirecumbent (45 °) pozisyonda yerleştirin. Eğri forseps kullanarak, kısmen dil geri çek. Bir microsprayer kullanarak, intratracheally 50 µL (5 x 106 koloni oluşturan birimler [CFU])17 / P. aeruginosa GFP imzalat farelerin ciğerlerine yönetmek.</li>
	<li>Enfeksiyon 1 saat sonra adımları 1.1-1.7.</li>
	<li>PBS ve cytocentrifuge hücrelerde resuspend bir cam slayt üzerine onları (1000 x g, oda sıcaklığında 1 dk).</li>
	<li>Differentially alveoler makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler, cytospin slaytlarını üreticinin yönergelerine göre leke.</li>
	<li>Rastgele 100 AMs seçin, hücre içi bakteri içeren AMs saymak ve fagositoz yüzdesini belirlemek.</li>
</ol>5. Vivo içinde bakteri izni kullanarak P. aeruginosa
<ol><li>P. aeruginosa P. aeruginosa yalıtım agar tabağa aşılamak ve 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Koloni lysogeny suyu (LB) 2 ml aşılamak ve 37 ° C'de bakteri gecede büyümek. CFU, aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar. CFU/mL = (kolonileri seyreltme faktörü x sayısı) / kültür plaka hacmi. İstenen CFU/mL almak için PBS ile Kültür sulandırmak.</li>
	<li>Deneme 1'de, intratracheally enjekte ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa sublethal bir doz imzalat vahşi-türü (WT) ve TRIM72KO fareler, adım 4.2 belirtildiği gibi. Vücut ağırlığı her gün 6 gündür ölçmek.</li>
	<li>Deneme 2'de, P. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) ikinci bir doz deneme 1'hayatta ve vücut ağırlığı 4 gündür ölçmek fareler içine enjekte.</li>
	<li>Deneme 3, fareler, farklı bir dizi kullanarak WT ve TRIM72KO fareler bir öldürücü doz P. aeruginosa ile (3 x 107 CFU/mL) enjekte ve mortalite enjeksiyon 2 gün içinde kaydedin. Önemli vücut kilo kaybı gibi ciddi stres belirtileri gösteren hayvanlar, kambur sırt, anoreksiya veya Dispne uzman veterinerler tarafından değerlendirilecektir. Tedavi edilemez hayvanlar hemen kaldırılır.</li>
	<li>Ya ölüm ya da ötenazi, enjeksiyon sonra 2 gün sonra bütün akciğer dokusu miktar itibariyle en yüksek enfeksiyon akciğer bakteriyel yükünün için toplamak.</li>
	<li>Akciğer bakteriyel yük sınamak için akciğer dokusu normal salin 200 µL eklemek ve onları, bakteri bozmadan akciğer dokusu tamamen bozan bir elektronik homogenizer üzerinde daha önce test ayarı kullanarak homojenize. Akciğer homogenate 1 mL ve plaka 100 µL akciğer Pseudomonas yalıtım agar plakaları 10 kat seri dilutions adlı lysate için toplam ses düzeyini ayarlayın.</li>
	<li>Plakayı 24 h 37 ° C'de kuluçkaya ve bütün akciğer başına CFU belirlemek için bakteri kolonileri say.</li>
</ol>6. istatistiksel analiz
<ol><li>Kullanın bir öğrenci t-testi iki grup arasındaki fark istatistiksel anlamlılık belirlemek için. İstatistiksel olarak anlamlı bir fark ne zaman düşünün p < 0,05. Tüm verileri (SEM) ortalama ± standart hatasını aracı olarak sunulmaktadır.</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gaz değişimi işlevi yerine getirirken, akciğer ısrarla yabancı parçacıklar, patojenler ve alerjenleri yüzleşir. AMs onların ana işlevi, yani fagositoz gereğince savunma ilk satırı sağlar. AMs da diğer bağışıklık hücreleri patojenleri yok ve inflamasyon çözünürlük ile koordine. Burada, biz yöntemleri özellikle fare akciğer izole AMs tarafından fagositoz değerlendirmek için nitelendirdi. Bu el yazması sunulan Protokolü makrofaj işlevi ve diğer organlarında bakteri izni çalışmaya da kullanılabilecek fagositoz içinde vivo ve...

AMs büyük ikamet fagositler alveoller içinde dinlenme sahne ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanıma yoluyla büyük oyuncular ve inhale patojenler ve yabancı parçacıklar1,2içselleştirilmesi vardır. Bu yüzden AM fagositoz bir eksikliği genellikle solunum içinde sonuçları AMs P. aeruginosa ve Klebsiella zatürre3,4gibi birçok akciğer patojenlerin hızlı geçiş izni için gerekli olan bildirilmiştir yüksek mortalite ve morbidite oranları neden enfeksiyonlar, akut pnömoni gibi.
AMs Ayrıca akciğer doğuştan gelen inflamatuar yanıt sitokinler ve TNF-α ve IL-1β, hangi crosstalk kemokinler üretmek ve inflamatuar nötrofil, monosit, askere alveoler çevrenin diğer hücrelerle gibi kemokinler üreterek başlatmak ve edinilmiş bağışıklık hücreleri akciğer5. Örneğin, IL-1β AMs tarafından üretilen nötrofil Kemokin CXCL8 yayın epitel hücreleri6hazırlamak için yardımcı olur. Ayrıca, hücre içi enzimler sürekli kaçağı neden PMNs gelen başarısızlık çevreleyen doku, doku hasarı sonucu ve uzun süreli iltihap fagositoz apoptotik polimorfonükleer lökositlerin (PMNs), AMs katkıda 7 , 8 , 9.
AMs tarafından fagositoz yanında kalıplarının patojen ilişkili moleküler patojen yüzeyi AMs desen tanıma reseptörleri (PRRs) veya opsonized patojenler bağlama AMs bağışıklık efektör reseptörleri ile doğrudan bir Tanıma aracılık ettiği 10. için ikinci, AMs immünglobulin (IgG) ile opsonized hedefleri onların Fcγ reseptörleri (FcγR) algılayabilir veya patojenler (CR)11tamamlayıcı parçaları, C3b ve C3bi, onların tamamlayıcı reseptörleri ile kaplanmış. Kompleman reseptörü arasında immünglobulin süper (CRIg) CR doku makrofajlar12' seçmeli olarak ifade edilir ve son bulma AM fagositoz bağlamında P. aeruginosa pnömoni, CRIg rolü vurgulanacak 13.
Birçok özgün çalışma yöntemleri makrofaj işlevi14,15moleküler mekanizmaları açıklamak için makrofaj fagositoz değerlendirmek için kullanın. Ancak, içinde vivo fagositoz gibi yöntemler fagositoz kesin bir miktar gerektirir. Burada, tüp bebek ve içinde vivo fagositoz floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak için detaylı bir metodoloji özetlemek-cam boncuk ve P. aeruginosa yeşil flüoresan protein (GFP), anılan sıraya göre. Ayrıca, biz PRR, CR ve FcγR-aracılı fagositoz arasında differentiating yöntemi açıklar. Son olarak, bakteriyel temizleme Mouse P. aeruginosa pnömoni ile ilgili olarak niteleyen bir yöntemi bildirin.

<table><tbody><tr><td>18-G İğne</td><td>Nipro Medikal&nbsp;</td><td>CI + 1832-2C</td><td>Moleküler Biyoloji sınıf</td></tr><tr><td>2,7-diaminofloren (DAF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>% 70 Etanol</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>ACK lizis tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10492</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-biyopartikül</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>C5 eksik serum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>Biyokimyasal reaktif</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Sitosantrifüj</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Sayı 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Hücre Kültürü Ortamı</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>Akış Sitometre</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Yazılımı</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Laboratuvar hayvanı diseksiyonu için uygun</td></tr><tr><td>FITC-karboksilatlı lateks boncuklar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Uygun için&nbsp; hücre enfeksiyonu tahlilleri</td></tr><tr><td>Cam alt tabak</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>Yüksek Basınçlı Şırınga</td><td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Laboratuvar hayvanlarının kullanımına uygun</td></tr><tr><td>Homojenizatör</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin Hidroklorür</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>Farmasötik sınıf</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Lekeleri</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>LB Et</td><td>Suyu Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>MicroSprayer Aerosolizer</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>Laboratuvar hayvanı kullanımı için uygundur</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reaktif sınıfı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Hücre Biyolojisi sınıfı</td></tr><tr><td>tavşan anti-SRBC-IgG & nbsp;</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>55806</td><td>İmmüno-tahliller için uygun</td></tr><tr><td>tavşan anti-SRBC-IgM&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratuvarları</td><td>CL9000-M</td><td>İmmüno-testler için uygun</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Laboratuvar hayvanı diseksiyonu için uygun</td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Laringoskopu</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Laboratuvar hayvanı kullanımına uygun</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>Yaylı Makas (Med)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15012-12</td><td>Laboratuvar hayvanı diseksiyonu için uygun</td></tr><tr><td>Bahar Makası (Küçük)</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>91500-09</td><td>Laboratuvar hayvanı diseksiyonu için uygun</td></tr><tr><td>koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC'ler)&nbsp;</td><td>MP Biyomedikal</td><td>55876</td><td>Yıkanmış, korunmuş SRBC'ler</td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Moleküler Biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Ksilazin ve nbsp;</td><td>Akorn Hayvan Sağlığı</td><td>59399-110-20</td><td>Farmasötik sınıf</td></tr></tbody></table>

alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer alveoler alan koru. Fagositoz AMs tarafından istila karşı patojenler, ölü hücreleri veya yabancı parçacıklar kaldırılmasını savunmak için kritik bir rol oynamaktadır ve inflamatuar yanıt ve doku remodeling çözünürlüğünde, işler bu tarafından çeşitli yüzey reseptörlerinin aracılı AMs. Burada, desen tanıma reseptör-, Kompleman reseptör- ve Fc gama reseptör aracılı arasında ayırt etmek için tüp bebek ve içinde vivo deneyleri ve deneysel stratejiler kullanarak AMs fagositik fonksiyonu analizi için yöntemler raporu fagositoz. Son olarak, biz bir yöntem oluşturmak ve P. aeruginosa pnömoni manken bakteriyel yetkisi içinde vivo değerlendirmek farelerde karakterize tartışıyorlar. Bu deneyleri AM işlevleri değerlendirmek için en yaygın yöntemleri temsil ve makrofaj işlevi ve diğer organlarda bakteriyel Temizleme çalışması için de kullanılabilir.

Fagositoz fare tarafından analiz için deney yapılan ilk birincil AMs. Tüm analizleri AMs WT ve TRIM72KO fareler izole karşılaştırıldığında. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi Floresans mikroskobu o fagositoz FITC-cam boncuk birincil AMs oluşur kuluçka 1 h sonra fare tarafından saptandı. Resim 1 B Akış Sitometresi tarafından fagositoz analizini gösterir. Mikroskopi tarafından fagositoz mik...

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa Bir BSL-2 düzeyi patojendir. Bu organizmayı kullanırken tüm BSL-2 düzeyinde güvenlik uygulamalarını takip etmeyi unutmayın. Burada farelerde primer hücre izolasyonu, in vitro fagositoz, fagositik yol analizi, in vivo fagositoz ve bakteriyel klirens değerlendirmesi göstereceğiz.Başarılı intratrakeal doğum master uygulama gerektirir. Mikrosprayer düzgün yüklü olduğundan emin olun, iğne iki ses kıvrımları arasında, ve piston hızı düzgün kontrol edilir. Kağıt havlularla kaplı bir diseksiyon tahtasına yayılmış uzuvları ile supine pozisyonda fareyi güvence altına alarak başlayın ve ön dişlerin altında bir ip bağlayarak başın altına çekerek trakeadüz ve düz bir konuma getirin.Fareyi %70 etanol ile dezenfekte edin ve vücudun orta hattındaki deriyi yukarı çekmek için düzenli çerkedikler kullanın. Karından boğazın üst kısmına kadar cildi kesmek için cerrahi makas kullanın. Dikkatle boğaz kas ve bağ dokuları incelemek için standart cerrahi makas künt ucunu kullanın.Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını aç. Diyaframı kesin ve göğüs kafesinin alt kısmını kesilerek akciğerleri kısmen açığa çıkar. Trakea ortaya çıkarmak için bahar makası kullanın ve bir kıkırdak halkası

alveolar-macrophage-phagocytosis-and-bacteria-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri...

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Kaynak: Nagre, N. ve diğerleri. Alveolar makrofaj fagositoz ve farelerde bakteri temizlemesi. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, IgM ve komplement ile opsonize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleri kullanılarak komplement reseptörü aracılı fagositozun değerlendirilmesini ve ardından fare makrofajları tarafından alınmasını göstermektedir. Fagositoz kapsamı, diaminoflorenin hemoglobin-katalize edilmiş oksidasyonuyla oluşan mavi kromojenik ürünün ölçülmesiyle ölçülür.

Opsonize Kırmızı Kan Hücreleri Kullanarak In Vitro Komplement Aracılı Fagositoz Modellenmesi

Bir fare makrofaj kültürünü ele alalım.Testi, Wnt5A içeren bir tampon ile iyi ele alın, bu bir sinyal molekülü ve kontrol sadece tamponlu bir kontrol içerir.Bakteriyel bir patojenle enfekte edin ve kuluçka yapın.Test hücrelerinde, Wnt5A, bakterilerin fagozomlara girişini artırmak için sitoskelet yeniden organizasyonunu artıran bir sinyal zincirini aktive ederken, bu sinyalden yoksun kontrol hücreleri daha az bakteriyi içselleştirir.İçselleştirilmeyen bakterileri temizlemek için yıkayın,...

Wnt5A aracılı Bakteriyel Klirens Artışı Sare Makrofajlarında

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Konak-patojen etkileşimlerinin in vitro çalışması spesifik immün yanıtların karakterizasyonuna izin verirken, karmaşık yanıtların etkilerini gözlemlemek için in vivo modeller gereklidir. Candida albicans maruziyetini ve ardından Pseudomonas aeruginosa aracılı akciğer enfeksiyonunu kullanarak, ventilatörle ilişkili pnömoni patojenitesinde yer alan mikrobiyal etkileşimlerin bir fare modelini oluşturduk.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Bu el yazması, hava kirletici bir kriter olan ozon maruziyetinin alveoler makrofaj efferositozisinin in vivo'yu bozup bozmadığını belirleyen bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol yaygın olarak kullanılan reaktifler ve teknikler kullanır ve alveoler makrofaj eferositoz üzerindeki etkilerini belirlemek için pulmoner yaralanma birden fazla modeladapte edilebilir.

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Bu protokol, pulmoner interstisyel makrofajların (IM) izolasyonunu ve bir fare modelinde akciğer alveollerinin IL-33 stimülasyonundan sonra evlat edinilen transferlerini tanımlar ve bu da idiyopatik pulmoner fibrozun (İPF) in vivo çalışmasını kolaylaştırabilir.

IL-33 ile Uyarılmış Makrofajların, İdiyopatik Pulmoner Fibroz Üzerindeki Etkilerini In Vivo Olarak İncelemek için Bleomisin Kaynaklı Fare Modellerine Evlat Edinilmesi

Öğrenin farelerde alveoler makrofaj fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa bakteri izni analiz yöntemlerini. Bu teknik immünoloji ve mikrobiyoloji araştırmalarında bağışıklık yanıtlarını incelemek için kullanılır.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Daha fazla video keşfet