Name: Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Keşfedin, fare uzun kemiklerinin diseksiyonu ve kemik iliği izolasyonu ile osteoklast öncü hücreleri üretme yöntemini. Anti-c-fms antikorunun osteoklastogenez üzerindeki terapötik etkisini değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen JSP'ler KAKENHI tarafından desteklenen bilim promosyon (No. 16 K 11776 H. K., No 17 bin 17306 K. S., No. 16 K 20637 K. K., No. 16 K 20636 M. S., No 18 K 09862 ı. M için için için için için.) Japonya toplumdan verin.

Tüm hayvan yordamlar ve hayvan bakımı Tohoku Üniversitesi kurallara ve düzenlemelere göre yapıldı.
1. fare Hindlimb diseksiyon ve işleme
<ol><li>Diseksiyon önce bir tabak α-MEM konteyner boyutuna bağlı olarak yaklaşık 50 mL ile doldurun ve Buza koyun. Tüm kemikler diseksiyon tamamlanana kadar bu bir koleksiyon kapsayıcı olarak görev yapacak. Bu ve sonraki deneyler, α-MEM içeren % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 IU/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin kullanın.</li>
	<li>C57Bl/6J fare %5 isoflurane aşırı dozda inhalasyon tarafından ötenazi.</li>
	<li>Avuç içi ve ayak ve % 70 etanol ile iyice sprey ile deldi iğne kullanarak bir sırtüstü pozisyonda fare düzeltmek.</li>
	<li>Steril Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kalça düzeyinde bir cilt kesi yapmak ve kasları açığa feet aşağı genişletir.</li>
	<li>Kuadriseps kas ekleme tendon ve hamstring kas kemik ekleme tendon kesti. Kalça ve diz eklem açığa kasları peel Away. Bu tendonlar bulma yumuşak doku Etiketler terk etmeden her iki kas onların eklerinden boşaltma kolay olmayacaktır. Kemiğin içine kesme.</li>
	<li>Makas uyluk kemiği başı ve ortak alanı arasında konumlandırın ve femur azat ama kemik olduğu gibi tutmak kesti. Bu dekolmanı kemik kemik iliği görünmesi riski olmadan sağlar.</li>
	<li>Benzer şekilde tibia bağlama kasları Kes gitsin. Onun ekten ücretsiz tibia kemik kirlenmesini önlemek için olduğu gibi tutmak ayak bileği eklemi kes.</li>
	<li>Femur ve tibia makas bıçakları ve kimwipe kullanarak herhangi bir kalan yumuşak dokudan raspa ve α-MEM buza yerleştirilir ile bir tabak içinde yerleştirin.</li>
</ol>2. fare Hindlimb kemik iliği yalıtım
<ol><li>30 G iğne şırınga α-MEM ile doldurun.</li>
	<li>Diz eklemi uzak femur ve tibia kesmek.</li>
	<li>Makas kullanarak her iki taraftan uzun kemik ucu kesilmiş.</li>
	<li>Cımbız kullanarak şaft kemiğinden tutun, kemik iliği uzaya iğne yerleştirin ve yavaş yavaş bir 6 cm kültür tabak içine kemik iliği içeriğini floş. Kemik kemik iliği içeriğin tümü ayıklama gösteren beyaz görünür. Tüm kemikler için yineleyin.</li>
	<li>Zorlanma kemik iliği ayıklamak bir 50 mL konik santrifüj tüpü ve 5 min için 300 x g , santrifüj içine bir 40 mikron naylon hücre süzgeç kullanarak.</li>
	<li>Süpernatant atmak, α-MEM 5 mL ile yıkayın ve 300 x g 5 dakika süreyle de tekrar yıkama 2 kez olmak üzere toplam santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>
Pelet α-MEM 10 mL resuspend ve bir hemasitometre aşağıdaki gibi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirin:
	<ol>
<li>1:1 seyreltme hücre süspansiyon hücre süspansiyon 10 μL %0,4 trypan bir 1,5 mL tüp içinde mavi 10 μL ekleyerek yapmak ve bir kez pipet.</li>
		<li>Hemasitometre odası ile bir slayt kapak kapak ve boya süspansiyon hemasitometre için transfer. Değil bantlayın veya odası underfill ve süspansiyon odası kılcal eylem tarafından doldurmak izin vermek önemlidir.</li>
		<li>Hemasitometre mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin. 10 x amacı istimal, Merkez meydan odaklanmak. 3 çizgilerle bağlı tüm hücreleri saymak. Hücreleri iki kez sayılmaz emin olmak için her bir kare ve sağ üst köşelerine saymak. Ölü hücreleri koyu mavi görünür, bunlar sayımdan hariç tutulur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağı akım uygulamaya bağlı olarak, hücre bir uygun kültür gemi tohum. Bu özel deneme için Bölüm 3 izleyin.</li>
</ol>3. nesil BMM
<ol><li>Tohum 1 x 107 hücreler/10 mL 10 cm çanak kültür ve M-CSF 100 ng/mL ekleyin. Son M-CSF 100 ng/mL kültür ortamının bölgedir. Kültür 37 ° c, % 5 CO2 3 gün kuluçkaya.</li>
	<li>3 gün sonra kültür orta kaldırmak, fosfat tamponlu tuz (PBS) iki kez yapışık olmayan hücreleri kaldırmak, oda sıcaklığında %0.02 tripsin-EDTA 5 mL eklemek için 10 mL şiddetle hücrelerle PBS içinde yıkayın ve 37 ° c, % 5 CO2 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri ayrıntılı pipetting tarafından bağlantısını kesin. Kültür (hücreleri yuvarlak ve medya kayan görünmesi gereken) bir mikroskop altında gözlemleyerek hücreleri ayırdıktan olduğunu emin olun. Hücreleri bağlı kalır, iyice onları ayırmak için pipetting işlemini yineleyin. Hücreleri müstakil, 5 mL tepki devre dışı bırakabilirsiniz için α-MEM de ekleyin.</li>
	<li>50 mL konik tüp ve 5 dk. atma süpernatant 300 x g , santrifüj içine hücreleri toplamak ve α-MEM 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve Pelet α-MEM 10 mL resuspend.</li>
	<li>Daha önce 2.7.1. adımda açıklandığı gibi bir hücre sayısı gerçekleştirin.</li>
	<li>Tohum 1 x 106 hücreler/10 mL 10 cm çanak kültür ve M-CSF 100 ng/mL ekleyin. Son M-CSF 100 ng/mL kültür ortamının bölgedir. Kültür 37 ° c, % 5 CO2 3 gün kuluçkaya.</li>
</ol>4. nesil Osteoklastlar BMM üzerinden Osteoklast öncüleri olarak
<ol><li>3 gün sonra BMM adımları 3.2-3.7 takip Osteoklast öncüleri temsil bağlı hücre hasat.</li>
	<li>Tohum BMM, 5 x 104 hücreleri/200 μL α-MEM 96 iyi plaka. RANKL 50 ng/mL veya TNF-α son bir konsantrasyon 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. M-CSF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ekleyin.</li>
	<li>Anti-c-fms antikor Ekle (0, 1, 10, 100, son konsantrasyonları 1000 ng/mL) her şey için.</li>
	<li>37 ° c, % 5 CO2 4 gün kuluçkaya. Medya 4 gün boyunca her gün değiştirin.</li>
</ol>5. tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) leke
<ol><li>Kuluçka 4 gün sonra yavaşça her şey kültür orta Aspire edin. Her oda sıcaklığında 1 x PBS 200 μL ile de bir kez yıkayın.</li>
	<li>Her şey fiksasyon için % 10 formalin 200 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Formalin Aspire edin ve her şey 3 kez deiyonize su ile yıkayın.</li>
	<li>0,2 her PBS Triton X-100 permeabilization için iyi ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya % 200 μL ekleyin. Triton X-100 Aspire edin ve her şey 3 kez deiyonize su ile yıkayın.</li>
	<li>TUZAK leke çözüm 200 μL her şey için ekleyin. Mikroskop altında leke görselleştirin. Üzerinden düzgün geliştirmek leke için 10-30 dakika sürer.</li>
	<li>Leke ve her deiyonize su ile 3 kez iyi ve kuru hava yıkama Aspire edin. Daha fazla gözlem kullanmak için oda sıcaklığında tutmak.</li>
</ol>6. nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
<ol><li>Tohum BMM Osteoklast öncüleri, 5 x 103 hücreleri/200 μL, α-MEM 96 iyi plaka olarak. M-CSF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ekleyin.</li>
	<li>Anti-c-fms antikor Ekle (0, 1, 10, 100, son konsantrasyonları 1000 ng/mL) ve 37 ° c, % 5 CO2 orta değiştirmek olmadan 3 gün kuluçkaya.</li>
	<li>3 gün sonra 1 x PBS hücrelerle yıkayın. α-MEM 100 μL her şey için ekleyin.</li>
	<li>10 μL seti çözüm sayma Hücre Ekle ve 37 ° c, % 5 CO2 2 h için kuluçkaya ve 450 her kuyuda Absorbans belirlemek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, biz anti-c-fms antikor RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α-indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen Osteoklast habercisi yayılması üzerindeki etkisini araştırdık. Biz anti-c-fms antikor osteoclastogenesis RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen yaygın Osteoklast öncüleri arasında inhibisyonu için etkili miktarı farklı olduğunu fark ettik.
RANKL aracılık eder osteoclastogenesis M-CSF tüp bebek huzurunda ve sırası boş...

Osteoklastlar uzmanlaşmış hücrelerdir ve hematopoetik kök hücre birden çok Osteoklast öncüleri füzyonu sayesinde ayırt. Onlar romatoid artrit ve periodontal hastalık1gibi inflamatuar osteolitik hastalıklarla ilişkili patolojik kemik rezorpsiyonu katkıda ve sağlıklı kemik tadilat nedeniyle gereklidir.
Osteoclastogenesis ve Osteoklast işlevi iki anahtar faktör tarafından aracılı; makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör kappa B ligand (RANKL). M-CSF ve RANKL Osteoklast farklılaşma2için önemlidir. Kemik iliği makrofajlar tüp bebek üzerinden Osteoklast oluşumu ikna etmek için gösterilen başka bir tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α)3,4,5faktördür. TNF-α Osteoliz romatoid artrit6, periodontal hastalık7ve Postmenopozal Osteoporoz8gibi yıkıcı kemik hastalıklarında için kritik olmak aracılı Osteoklast oluşumu gösterilmiştir.
C-fms M-CSF membran reseptör ve eylem aracılık eder. C-fms (anti-c-fms antikor) karşı bir antikor yönetimini tamamen osteoclastogenesis artrit modelinde tutuklandı yanı sıra TNF-α içinde kemik erozyonlar süre indüklenen gösterilmiştir gibi c-fms rolü de literatürde belgelenen iltihaplı eklem üzerinden uzak osteoclastogenesis hala sağlam9yaşındaydım. Anti-c-fms antikor İdaresi Osteoklast oluşumu ve kemik rezorpsiyonu fare calvariae10 de olduğu gibi LPS kaynaklı periodontitis modeli11. lipopolysaccharide (LPS) tarafından indüklenen inhibe Ayrıca, anti-c-fms antikor mekanik stres kaynaklı kök rezorpsiyonu ortodontik diş hareketi12, aynı zamanda Ortodonti diş hareketi sırasında ve ortodontik diş hareketi13ile ilişkili kemik rezorpsiyonu inhibe.
M-CSF konak immün yanıt için gerekli olan diğer işlevler için rapor edildi. M-CSF bakteriyel pnömoni ile op/op farelerde yokluğu bakteri yükü ve karaciğere hepatik nekroz14ile bakteri yayılmasını artış yol açar. Bu nedenle, M-CSF enfeksiyon korunmasında immünolojik yanıt için önemlidir.
Bu çalışmada anti-c-fms antikor etkisi M-CSF ve RANKL veya TNF-α Osteoklast oluşumu tüp bebek indüklenen ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması indüklenen gösterir. Bu iletişim kuralı yalıtım fare kemik iliği hücrelerinin uzun kemiklerde ve Osteoklast öncüleri kabul edilmektedir kemik iliği makrofajlar (BMM) oluşturmak ve BMM farklılaşma multinuclear Osteoklastlar içine iki tarafından ikna etmek için adımları gösterir yöntemleri; RANKL veya TNF-α. Protokol Ayrıca anti-c-fms antikor kullanarak her iki yöntem de osteoclastogenesis tutuklanması karşılaştırır.
Hangi kemik iliği çıkarılan ve daha sonra Osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan büyük miktarlarda uyuşturucu testi gibi birden çok downstream uygulamalarında kullanılan saf Osteoklast kültürlerin üretiminde güvenilir işlemidir. RANKL ya da TNF-α osteoclastogenesis bu protokolündeki ikna etmek için osteoclastogenesis fizyolojik bir süreç (RANKL) olarak osteoclastogenesis hangi sırayla rehberlik için iki alternatif yordam sağlar bir patolojik süreç olarak (TNF-α) ayıran bir aşağı akım uygulamalarda kullanılmak üzere reaktifleri açısından üstün olduğu karar. Bu iletişim kuralı Ayrıca hangi tarafından biz güvenli bir şekilde daha sonraki çalışmalar kemik rezorpsiyonu ve osteolitik hastalıklar için kullanılan anti-c-fms antikor uygun bir konsantrasyon belirleyebilirsiniz bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Anti-c-Fms antikoru</td><td></td><td></td><td>AFS98, bir sıçan monoklonal, antimurin, c-Fms antikoru (IgG2a)</td></tr> <tr><td>TNF-&alfa;</td><td></td><td></td><td>Laboratuvarımızda hazırlanan rekombinant murin TNF-&alfa. TNF-&alfa; RT-PCR ile klonlanan ve bir GST-füzyon proteini oluşturmak için bir pGEX-6P-I'ye (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) klonlanan cDNA fragmanı. GST-TNF-&alfa; Escherichia coli BL21 hücre hücrelerinde (Stratagene, La Jolla, CA) eksprese edildi. Hücreler denatüre olmayan koşullar altında parçalandı ve GST-TNF-&alfa; bir glutatyon-Sefaroz sütunu üzerinde saflaştırıldı. GST, üretici tarafından PreScission Protease (Amersham Biosciences) tarafından ayrıldı yönleri ve bir glutatyon-Sefaroz sütunu tarafından çıkarıldı.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Rekombinant Murin sRANK Ligandı, Kaynak: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>Rekombinant insan M-CSF. 1/10 hacim CMG14&ndash; 5x10 6 nbsp'de 12 hücre hattı kültürü süpernatanı; 10 cm'lik bir süspansiyon kültür kabındaki hücreler.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>, L-Glutamin ve fenol kırmızısı ile</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Fetal Sığır Serumu Fransız Kökenli</td></tr><tr><td>Kültür kabı</td><td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm stil çanak</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta yüzey</td></tr><tr><td>Hücre sayma kiti-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Gündoğumu UZAKTAN KUMANDA; Tekan Japonya, Kawasaki, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td></td><td>40 & mu; m Naylon</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td></td><td>50 mL CentriStar kapağı</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Polioksietilen (10) Oktifenil eter</td></tr></tbody></table>

osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in vitro osteoklast habercisi anti-c-fms antikor etkisi

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Kemik remodeling karmaşık bir süreçtir ve ifade ve rezorpsiyonu dönemleri içerir. Kemik rezorpsiyonu tarafından kemik Osteoklastlar farklı uyaranlara yanıt olarak tarafından bozuldu bir süreçtir. Osteoklast öncüleri makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) yanıt olarak multinuclear Osteoklastlar içine ayırt etmek. Patolojik koşullarda sitokin profili farklıdır ve inflamatuar sitokinlerin karışımı içerir. Bu bölgelerde inflamatuvar mekanizmaları ile ilgili büyük miktarlarda bulunur gibi tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) en önemli sitokinler biridir. Hangi fare kemik iliği Osteoklastlar M-CSF ve RANKL veya daha sonra anti-c-fms antikor, reseptör doz artırarak inhibe TNF-α ile indüksiyon yoluyla oluşturmak için izole bir yöntem sağlamak amacıyla bu iletişim kuralının amacı olduğunu M-CSF. Bu deney anti-c-fms antikor inflamatuar kemik rezorpsiyonu hastalıklarında tedavi edici değerini vurgular.

Bu iletişim kuralı Osteoklast oluşumu RANKL veya TNF-α huzurunda anti-c-fms antikor etkisini değerlendirmek ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması üzerindeki etkisini belirlemek için amaçtır. Bu protokol için biz güvenilir bir süreç büyük miktarlarda saf Osteoklast kültürler tarafından oluşturulduğu sağladı. Biz de farklı kültür koşullar altında Osteoklast oluşumu inhibe için uygun toplama anti-c-fms antikor test etmek için bir yol sağladı.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Bu iletişim kuralı fare uzun kemik ve kemik iliği makrofajlar oluşturup Osteoklastlar makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) kullanarak üretmek için kemik iliği yalıtım, diseksiyon içerir veya tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve anti-c-fms antikor, M-CSF reseptör tarafından onların tutuklama.

Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Bu deney, romatoid artrit ve periodontit gibi inflamatuar kemik bozulması hastalıklarında Anti-c-fms antikor terapötik değerini vurgulamaktadır. Kemik iliği ayıklanır ve osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan süreci, birden fazla downstream uygulamalarında kullanılabilir saf osteoklastlar, büyük miktarlarda verir. Bu protokol, RANKL ligand veya TNF alfa kullanılarak osteoklaztogenezin iki alternatif yöntemini sağlar.Buna ek olarak, bu yöntem osteoklaztogenez üzerinde Anti-c-fms antikor etkisi içine fikir sağlar. Bu prosedürün görsel gösterimi, araştırmacıyı diseksiyon süreci ve büyük miktarlarda kemik iliği hücrelerinin elde edilmesi ile yakından tır. Alfa MEM yaklaşık 50 mililitre ile bir toplama konteyner olarak hizmet verecek bir plaka doldurmak başlamak için, konteyner büyüklüğüne bağlı olarak, ve buz üzerine yerleştirin.Supine pozisyonda düzeltmek için bir ötenazi farenin avuç içi ve ayaklarını delmek için iğneler kullanın ve % 70 etanol ile iyice sprey. Kalça düzeyinde bir deri kesi yapmak ve kasları açığa, ayaklar için aşağı uzatmak için steril cerrahi makas ve cımbız kullanın. Quadriceps kas takarak tendon bulmak ve kesmek.Kas soyma ve kalça düzeyinde kesti. Sonra kemiğe hamstring kas bağlı tendon bulun. Kemiği açığa çıkaran kasları soyun ve kemiği kesmemelerini sağlayarak hamstring'i ekinden kurtarın.Makası uyluk kemiğinin başı ile eklem boşluğu arasına yerleştirin. Femur serbest bırakarak içine kesilmiş, ama kemik bozulmadan tutmak, hangi kemik iliği açığa riski olmadan kemiklerin ayrılmasını sağlayacaktır. Kaval kemiğine bağlı kasları benzer bir şekilde kesin.Daha sonra kaval kemiğini ayak bileği eklemindeki ekinden arındırArak, kontaminasyonu önlemek için kemiği sağlam tutarak kesin. Femur ve tibia kalan yumuşak doku kazımak ve buz üzerine yerleştirilen alfa MEM ile hazırlanan plaka ya da yerleştirmek için makas bıçakları ve laboratuvar mendil kullanın. Kontaminasyonu en aza indirmek için diseksiyon dikkatle yapılmalıdır.Bu nedenle yumuşak doku çıkarılması ve kemik lokalizasyonu çok önemlidir. 30 kalibrelik bir iğne şırıngasına alfa MEM ile doldurun. Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini diz ekleminden uzaklaştırın ve makas kullanarak uzun kemiğin uçlarını her iki taraftan kesin.Kemiği şafttan tutmak için cımbız kullanın. İğneyi kemiğe ilik boşluğuna yerleştirin ve iliğin içeriğini yavaşça altı santimetrelik bir kültür yemeğine boşaltın ve tüm kemikler için tekrarlayın. Kemik beyaza dönecek, bu da tüm kemik iliği içeriğinin çıkarını gösteriyor.Kemik iliği ekstresini 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne sokmak için 40 mikrometrelik naylon hücreli süzgeç kullanın. Tüpü 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın.Yıkamak için, pelet alfa MEM beş mililitre ekleyin. Pipet hücreleri ayırmak için, santrifüj, ve iki kez toplam yıkama tekrarlayın. Bu izole hücreleri sayarak, el yazmasında açıklandığı gibi, 10 mililitrede 10 milyon hücre tohum, 10 santimetrelik bir kültür kabına tohum ve hücrelere M-CSF ekleyin.Kültürü 37 derecede kuluçkaya yatırın, üç gün boyunca %5 karbondioksit. Üç gün sonra ortamı çıkarın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez şiddetle yıkayın. Oda sıcaklığında beş mililitre ekleyin 0.02%tripsin-EDTA ve PBS, ve inkübat 37 santigrat derece, 5% 5 karbondioksit beş dakika için.Hücreleri ayırmak için iyice pipetleyin. Hücrelerin ayrılmış olduğundan ve medyada yuvarlak ve yüzer göründüğünden emin olmak için kültürü mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler ayrıldıklarında, alfa MEM beş mililitre ekleyerek reaksiyon inaktive.Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüp ve santrifüj içine toplayın 300 kez G beş dakika için. Supernatant attıktan sonra, alfa MEM beş mililitre ile yıkayın ve beş dakika boyunca 300 kez G tekrar santrifüj. 10 mililitre lik alfa MEM'de peleti yeniden askıya alın.10 santimetrelik bir kültür kabında 10 mililitrede 1 milyon hücre tohumlayın ve M-CSF ekleyin. Kültürü 37 derecede kuluçkaya yatırın, üç gün boyunca %5 karbondioksit. Üç gün sonra Osteoklast öncüleri olarak MM'leri temsil eden bağlı hücreleri hasat edin, daha önce KİM'lerin üretimi sırasında olduğu gibi.Tohum 50, 000 hücre başına 200 mikro alfa MEM litre başına 96 iyi plaka başına. Her iyi için, istenilen uyaranları ekleyin. Ve sonra mililitre başına 100 nanogram son konsantrasyon için M-CSF ekleyin.Her kuyuya Anti-c-fms antikor ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede, dört gün boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın ve dört gün boyunca her gün ortam değiştirin. Ve sonra el yazmasında açıklandığı gibi boyama ve tahliller ile devam edin.Anti-c-fms antikorlu M-CSF ve RANKL tedavi kültüründe osteoklast oluşumu değerlendirildi. Mililitre Anti-c-fms antikor başına 101,000 nanogram ile kontrole göre osteoklast sayısında önemli bir azalma gözlenmiştir. Oysa mililitre Anti-c-fms antikorbaşına 10 nanogramda bir azalma yoktu.Daha sonra Anti-c-fms antikorlu M-CSF ve TNF alfa tedavi kültüründe osteoklast oluşumu değerlendirildi. Mililitre Anti-c-fms antikor başına 10, 100, 1, 000 nanogram ile, osteoklast sayısında önemli bir azalma gözlendi kontrol göre, mililitre başına bir nanogram önemli bir azalma ile. Ve mililitre Anti-c-fms antikor başına 1, 10, 100 nanogram ile M-CSF kültürü, kontrol ile karşılaştırıldığında osteoklast öncüleri sayısında önemli bir azalma yoktu.Ancak, mililitre başına 1,000 nanogram, osteoklast öncüleri sayısında önemli bir azalma vardı, mililitre başına 1, 000 nanogram gibi yüksek bir konsantrasyon önemli ölçüde osteoklast öncüleri çoğalmasını inhibe etmek için gerekli olduğunu belirten. Kemiği bozulmadan tutarken bağları serbest bıraktıklarından emin olun, bu da kontaminasyon olasılığını en aza indirecektir.

effect-anti-c-fms-antibody-on-osteoclast-formation-proliferation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, farklı anti-c-fms antikor konsantrasyonlarının, osteoklast progenitörlerinden osteoklast oluşum süreci olan osteoklastogenez üzerindeki etkisini gösteriyoruz.

Anti C-fms Antikorunun Fare Kemik İliği Hücrelerinde Osteoklastogenez Üzerine Etkisi İn Vitro

Öncü hücrelerin osteoklastlara farklılaşması sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Burada, osteoklastların in vivo olarak farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği ve sitokinlerin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini incelemek için bir yöntem olarak öncü hücrelerin in vitro osteoklastlara farklılaşması için hücre kültürü protokolleri açıklanmaktadır.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Keşfedin, fare uzun kemiklerinin diseksiyonu ve kemik iliği izolasyonu ile osteoklast öncü hücreleri üretme yöntemini. Anti-c-fms antikorunun osteoklastogenez üzerindeki terapötik etkisini değerlendirin.

Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Daha fazla video keşfet