Spore adsorpsiyon enzimler ve antijenleri için Nonrecombinant görüntü sistemi olarak

Antijen veya enzimler gösteren canlı bakteriyel sporlar mukozal aşılar veya biyokatalizörler olarak kullanılabilir fonksiyonel olarak aktif nano tanecikleri vardır. Prensip olarak, herhangi bir protein verimli sporlara adsorbe edilebilir. Bu teknik basittir ve herhangi bir genetik manipülasyon gerektirmez.

Bu nedenle, rekombinant organizmaların çevreye salınması söz konusu değildir. İnsanlar ve hayvanlar için mukozal vaccinology ek olarak, enzimler gösteren sporlar yeniden kullanılabilir biyokatalizerler olarak geliştirilebilir. İki kez etiketleme ile başlayın 10 dokuzuncu B.subtilis wild-tipi saflaştırılmış sporlar model RFP iki-beş veya 10 mikrogram konsantrasyonları ile 200 mikrolitre bağlayıcı tampon 50-milimolar sodyum sitrat ile bir saat için bir saat için takviye 25 santigrat santigrat bir sallanan shaker.

Kuluçka sonunda, santrifüj ile bağlayıcı karışımları pelet ve sonraki adsorpsiyon verimlilik analizi için yeni konik tüpler içine supernatants transfer. Daha sonra, spor peletlerini yıkama başına 200 mikrolitre bağlayıcı tampon la iki kez yıkayın ve ikinci yıkamadan sonra 100 mikrolitre taze bağlayıcı tampon da peletleri yeniden sulandırın. Yüzey proteini ekstraksiyonu için, yüzey sporları proteinlerini zayıflatmak için 50 mikrolitre 2X sodyum dodecyl sülfat-dithiothreitol mikrolitresine 50 mikrolitre ekin.

65 santigrat derece 45 dakika sonra, santrifüj ile karışımları toplamak ve etiketli yüzey proteinleri tanımlamak için mRFP N-terminus onun etiketi mevcut tanıyan bir monoklonal anti-His antikor kullanarak, bir batı leke üzerinde supernatant ayıklanmış proteinlerin her hacmi10 mikrolitre çalıştırın. Floresan mikroskop ile adsorbe molekülleri lokalize etmek ve ölçmek için, 95 mikrolitre PBS'ye adsordi spor resuspension beş mikrolitre ekleyin ve her elde edilen süspansiyon beş mikrolitre tek tek mikroskop slaytlar üzerine ekleyin. Her slaytın üzerine bir poli-L-l-lizin işlem görmüş kapak fişi yerleştirin ve bir slaytı floresan mikroskop aşamasına yerleştirin.

Daha sonra, her alan için faz kontrastı ve floresan mikroskopi görüntülerini kaydedin. Görüntü analizi için ImageJ'deki floresan mikroskopi görüntülerini açın ve tüm görüntülerin sekiz bit formatta olduğunu doğrulamak için Resim ve Yazı'yı seçin. Analiz menüsünden Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan, Tümleşik yoğunluk ve Ortalama gri değerinin seçildiğini onaylayın.

İlgi alanının etrafına bir çizgi çizmek için bir çizim veya seçim aracı kullanın ve Analyze menüsünden Ölçü'yü seçin. Seçili spor için bir değer yığını içeren bir açılır pencere kutusu görüntülenir. En az 50 spor seçildikten sonra, herhangi bir spor olmadan çeşitli bölgeleri seçin ve arka plan floresan için bir okuma elde etmek için ölçümü tekrarlayın.

Birkaç arka plan ölçümü aldıktan sonra, Sonuçlar penceresindeki tüm verileri bir elektronik tabloya kopyalayın ve düzeltilmiş hücre başına toplam floresan elde etmek için seçili sporların alanındaki tümleşik yoğunluğun ortalamasını ve arka plan floresan değerlerinin ortalamasını hesaplayın. Dolaylı adsorpsiyon verimliliği değerlendirmesi için, 0,5 nanogram/mikrolitre başına son hacimde saflaştırılmış mRFP'nin altı iki kat seri seyreltmesini, bağlama tamponunda seyreltme başına 250 mikrolitrelik son bir hacim ve 100 mikrolitrelik adsorpsiyon reaksiyonunun 100 mikrolitrelik bağlayıcı araleyici seyreltme reaksiyonu içeren ayrılmış süpernatant numunenin 100 mikrolitrelik iki kat seri seyreltmelerinin uygun bir deney sayısını gerçekleştirin. Daha sonra, 0,45 mikrometrelik bir kesitle 9'a 10 santimetre lik bir boyuta doğru bir nitroselüloz membranı kesip, nokta leke cihazının contasının kenarına kadar uzanmadan seyreltme alanını beş örnekle altı noktalı bir alanı kaplayın.

Önceden ıslak membranı nokta leke aparatına yerleştirin. Membranın doğru boyutunu kontrol edin ve membran ve conta arasında sıkışmış hava kabarcıkları kaldırın. Üretici tarafından açıklandığı gibi nokta leke aparatı monte edin ve havanın bu kuyulardan hareket etmesini önlemek için cihazın kullanılmayan kısmını kapatın.

Cihaz hazır olduğunda, standardı en dış şeritlerdeki iki dış şeritte ve numuneleri orta şeritlerde kuyu başına her uygun seyreltme için 100 mikrolitre yükleyin. Tüm numuneler yüklendiğinde, vakumu durdurmadan ve numunelerin yerçekimine göre membrandan filtre lemesine izin vermeden önce vakum pompasını iki dakika açın. 10 dakika sonra, pbs 100 mikrolitre ile her iyi yıkayın.

Vakum pompasını beş dakika daha çalıştırın. Yıkama tamponu cihazdan tamamen boşaltıldığında, vakum açıkken, vidaları gevşetin ve nokta leke aparatını dikkatlice açın. Daha sonra membranı standart batı leke protokollerine göre işleyin.

Filtrenin densitometrik analizi için ImageJ'i açın ve analiz, ölçü komutunu kullanarak tümleşik yoğunluğu ölçmek için her noktanın anahatlarını belirtin. Görüntünün arka plan düzeltmesini yapmak için boş bir alana bir daire çizin ve tümleşik yoğunluğunu gösterildiği gibi ölçün. Bir kalibrasyon hattı elde etmek için standart noktaların entegre yoğunluğunu yüklenen protein miktarıyla ilişkilendirin ve her numune noktanın mRFP konsantrasyonunu tahmin etmek için kalibrasyon eğrisini kullanın.

Bağlı olmayan kesirlerde kalan mRFP konsantrasyonu daha sonra hesaplanabilir. Sadece adsorbed sporları bir özü ile yüklü şeritlerde beklenen boyutta proteinlerin varlığı başarılı bir adsorpsiyon reaksiyonu göstergesidir. Adsorpsiyon etkinliğinin doğrudan değerlendirilmesi, adsorpsiyon reaksiyonunun fraksiyonu sonrasında pelet fraksiyonunun floresan mikroskobu ve sitoflorimetrisi ile kullanılan heterolog proteine bağlıdır.

Sporlarda bulunan floresan sinyallerin sayısallaştırılması daha sonra gösterildiği gibi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilebilir. Adsorpsiyon etkinliğinin dolaylı analizi, bağlanmamış proteini içeren süpernatant fraksiyonun nokta lekeleme analizi ile yapılabilir ve bağlı olmayan proteinin sonraki densitometrik analizi sporlara adsore protein miktarının dolaylı olarak hesaplanmasına olanak sağlar. Prensip olarak herhangi bir protein mukozal aşı veya biyokatalizör olarak kullanılmak üzere adsorbe edilse de, uygulamada adsorpsiyon verimliliği protein bölgelerine ve kimyasal özelliklerine bağlıdır.