Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Bu protokol, ksenogreft-versus-host hastalığı, ya da ksenoGVHD neden nasıl ve nasıl kör ve tutarlı sonuçlar sağlamak için klinik puanlama standart. KksenoGVHD modeli, murine T hücreleri yerine insana karşı immünsupresif tedavileri test etmek için in vivo bir yöntem sağlar, kliniğe bu çalışmaların çevirisini geliştirmek. Prosedürü gösteren Amara Seng, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.

Enjeksiyondan bir gün önce, sekiz ila 12 haftalık, obez olmayan diyabetik scid gama veya NSG, sterilize pasta kafesi fareler yerleştirin ve bir sezyum-137 kaynağında fareler ışınlamak 150 centigrays toplam doz, hatta ışınlama sağlamak için yavaş bir rotasyon ile. Daha sonra, bir gecede steril bir biyogüvenlik kabini temiz kafesler içine fareler yerleştirin. Ertesi sabah, yedi periferik kan mononükleer hücreleri, ya da PBMCs, fare başına 1.1 kez 10 izole etmek için yeterli sağlıklı insan kanı toplamak ve pbs% 2 fetal sığır serumu, ya da FBS eşit hacimde heparinize kan seyreltmek.

Yoğunluk gradyan santrifüj ücrabirasyon için 50 mililitrelik konik tüplenfosit ayırma yoğunluğu gradyan orta 15 mililitre üzerine seyreltilmiş kan 25 mililitre kadar dikkatlice bindirme. Ayırma sonunda, apaçık pbmc hasat ve yeni bir 50 mililitre konik tüp içinde PBS 10 mililitre hücreleri yıkayın. Supernatant aspirate ve pelet gevşetmek için tüp flick.

Başka bir santrifüj için taze PBS 10 mililitre PBMCs resuspend, sayım için taze PBS beş mililitre resuspension izledi. Daha sonra, son bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve pbs konsantrasyonu mililitre başına sekiz PBMCs bir kez 10 pelet resuspend. İzole edilmiş insan PBMC'nin fare gözüne retro-orbital olarak ulaştırılması için, 100 mikrolitre hücreye sahip 28 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırınga yükleyin.

Parmak kıskacına yanıt eksikliğini onaylayın ve fareyi başparmak ve orta parmakla hafifçe dizginle. Gözün arkasına ulaşılına kadar konjonktiva zarı üzerinden, medial canthus içine iğne eğimli tarafı aşağı, lateral yerleştirin. İğneyi hafifçe geri çekve yavaşça tüm hücre hacmini enjekte edin.

Daha sonra, şırınga ve iğnenin düzgün bir şekilde atılması için iğneyi tamamen geri çekin. Göz kapağını kapatın ve gazlı bez süngeri ile enjeksiyon bölgesine hafif basınç uygulayın. Daha sonra, şişlik veya diğer görünür travma için enjeksiyon sitesini inceleyin ve farenin, hayvanı ev kafesine taşımadan önce kağıt havlularla kaplı steril bir kafeste bilincini yeniden kazanmasına izin verin.

GVHD skorunu ölçmek için kafesi laminar akış başlığına yerleştirin ve kafesteki yiyecek ve suyu çıkarın. Etkinliği puanlamak için, farelerin davranışını beş dakika boyunca gözlemleyin. Bir kilo kaybı puanı elde etmek için, bir cam kabıher her fare tartMak.

Fare hala kabın içindeyken, hayvanı duruş, kürk dokusu ve cilt bütünlüğü açısından inceleyin. İlgi dokuları hasat sonra, organdan doku yaklaşık üç-by-0.5 milimetrelik bir parça kesilmiş ve bir denge üzerinde örnek tartmak. Ağırlıklı dokuyu steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve eksi 80 santigrat derecede bir gecede depolanması için numuneyi sıvı nitrojenle dondurun.

Ertesi sabah, genomik DNA izolasyon kitinin talimatlarına göre, örnekleri lysis'ten önce eritin. Dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR ile insan T hücre sayısallaştırması için, kullanılan ve insan CD3 epsilon genomik DNA'sı için uygun astarların kullanıldığı dijital PCR makinesi için DNA bağlayıcı boyalar protokolüne göre dijital PCR reaksiyonları hazırlayın. Daha sonra, uygun reaksiyon koşullarında dijital PCR reaksiyonu gerçekleştirin.

İnsan PBMC alan her iki cinsin sekiz ila 12 haftalık NSG fareleri, sadece PBS ile tedavi edilen negatif kontrol farelerine kıyasla 10 enjeksiyon sonrası gün civarında GVHD'nin klinik belirtilerini göstermeye başlar. XenoGVHD fareler 23.5 gün ortanca sağkalım var. Dijital PCR kullanılarak, CD3 epsilon pozitif insan T hücreleri insan PBMCs alan farelerin akciğer ve karaciğer örnekleri tespit edilebilir.

Puanlamanın tutarlı bir şekilde yapılması ve fareleri puanlama yapan araştırmacının tedavilerine kör olması çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, periferik sitokin ekspresyon analizi için ötenazi li farelerden serum toplanabilir ve akış sitometrisi yoluyla analiz için dalaktan bağışıklık hücreleri toplanabilir.