Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Burada gösterilen Mango etiketli jel görüntüleme metodolojisi sağlamdır ve duyarlılık ve özgüllük açısından sadece uzatılabilmeleri beklenmektedir. Bu daha da ilgi RNA bir Mango etiketi ekleyerek basit bir expedient tarafından biyolojik olarak önemli RNA ve RNA komplekslerinin rutin arıtma basitleştirmek olacaktır. RNA'lar bu yazı tarihleme yöntemi için daha fazla hastalığa bulaşmak için rna izlemek ve görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yoldur.

Jeller kırılgan ve kırılmayatkın olduğu için jelin bir yerden başka bir yere aktarılmasında ekstra özen gerekir. 30 mililitreden kalma denaturing jel hazırlamak için, öncelikle uygun Bromofenol mavisi ile poliakrilamid yüzdesini seçin ve yüksek bant ayrılığını sigortalamak için bir RNA ile karşılaştırıldığında ksilen cyanol boyaları. Daha sonra, tablo bir göre A, B ve C çözeltileri karıştırın ve APS ve timud ekleyin.

Hemen uygun bir jel döküm aparatı içine jel çözeltisi dökün. İstediğini koni ekleyin ve yaklaşık 30 dakika polimeraz jel bırakın. Jel tankı 1 XTBE çözeltisi kullanarak yapın ve koniyi dikkatlice çıkarın.

Jeli dikkatlice kaldırın ve jel aparatıüzerine monte edin ve bağlayıcı klipsleri kullanarak güvenli. Bir şırınga kullanarak, numune yüklemeden hemen önce kuyuları aspire edin. RNA'nın ilgi çekici örneklerine 2X denatüre jel yükleme çözeltisi ekleyerek 1X RNA numuneleri hazırlayın.

Örnekleri 95 derecede beş dakika ısıtmak için bir termocycler kullanın. Daha sonra, jel yükleme ipuçlarını kullanarak her kuyunun dibine soğutulmuş numuneleri yükleyin. Ve iyi oda sıcaklığında jel güç etkili jel aparatının cam plaka çatlamak için düşük olmasını sağlamak.

Jele rahatça sığacak kadar geniş bir cam kapta el yazmasına göre 1X jel boyama solüsyonu hazırlayın. Jel orbital bir rotator üzerine yerleştirilir tamamen çözelti ile kaplı böylece konteyner için yeterli 1X jel boyama çözeltisi ekleyin. Jel çalışma bittikten sonra, aparattan jeli çıkarın, onun'wells kesip, ve yönünü belirlemeye yardımcı olmak için jel bir köşe.

Daha sonra jeli dikkatlice 1X jel boyama solüsyonuna aktarın. Görüntülemeyi gerçekleştirmek için, boyama çözeltisini dikkatlice decantın ve jeli suyla hızlıca durulayın. Son olarak, dikkatle görüntüleyici yerleştirilecek tepsiye jel aktarın.

Sıkışmış kabarcıklar ve aşırı sıvı kaldırmak için jel üzerinde bir cam pipet rulo. Ve bir jel görüntü alarak devam edin. Mango aptamers bir, iki, üç, dört önemli ölçüde yaklaşık bir azı üre konsantrasyonu kadar denatürasyon karşı idi.

Maksimum jel floresansı için 20-40 dakikalık boyama süresi yeterliydi. Daha uzun süre jel dışarı diffüz başladı gibi bu çalışmada kullanılan küçük RNA'lar için uygun değildi. Florometre analizi, Mango aptamers bir, iki ve üç Üre varlığında daha hızlı aptamer dört daha hızlı kat olabilir gösterdi.

Üre yokluğunda, katlama beklendiği gibi çok daha hızlı oldu. Post boyama yönteminin hassasiyeti, yerli ve denaturing jellerde mango varyantlarının her biri için iyi katlanmış RNA'lara karşılık gelen tek bantlar tarafından gösterilmiştir. Yerli jellerin sayısallaştırılması Mango bir, iki ve dört Mango üç daha doğrusal bir şekilde davranan büyüklüğü yaklaşık bir sıra üzerinde doğrusal bir günlük oldu.

Denaturing jellerin sayısallaştırılması, denaturing jelde Üre varlığının TO1 biotin boyama solüsyonuna yerleştirildikten sonra aptamerleri katlamak için daha homojen bir yol olabileceğini düşündüren daha doğrusal dı. Mango etiketli RNA'lar, SG boyamaya göre TO1 biotin boyama kullanılarak total RNA varlığında saptanabilir. Jel boyama kabı jel uyacak kadar büyük olduğundan emin olmak için unutmayın aksi takdirde jel kendisi üzerine katlanabilir.

RNA örnekleri bir yerden diğerine aktarılacaktır. Denaturing jeller benzer, bu yöntem yerli jel için yapılabilir. Doğal koşulları korumak için daha düşük bir watt soğuk bir odada jel çalıştırın.