Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon
May 10th, 2019
Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında protein düzeylerini algılamak ve ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz Buna ek olarak, immünostasyon için genç farelerden undecalcified Sert dokularda hazırlama ve donuk kesit için bir yöntem açıklanmaktadır.
Burada, kesitli malzemelerdeki proteinler üzerinde immünoresans tespiti için basit protokolümüzü sıyoruz. Bu yöntem antijen alma gerektirmez. Fare kafaları kullanacağız, dekalsif edilmemiş sert dokular da dahil.
Bu tekniğin en büyük avantajı sert dokuların antijen alımı ve kireçlenme sini atlamaktır. Bunlar iyi bir immünboyama sonuçları nın kalitesine yol açar. Bu yöntem aynı zamanda hem zaman hem de emek tasarrufu sağlar.
Bu yöntem, uygun modifikasyonları olan diğer dokular için de geçerlidir. Dekalsified dokulardan güzel bölümler yapmak için, daha fazla çevreleyen dokuları kırpma küçülme hedef doku incelemek ve gerekirse kriyokoruma önce iki gün boyunca dört derece santigrat% 10 EDTA ile örnekleri tedavi. Görsel gösteri, bu yöntemin prosedürünün ayrıntılı ve net bir açıklamasını sağlar.
Başlamak için, her hamile fare için her kuyuda PBS'de %4 PFA'dan oluşan 10 santimetrelik ve PBS içeren birkaç adet 3,5 santimetrelik tabak hazırlayın ve hepsini buza koyun. Hamile farelerden embriyoları incelemek için, forceps ile ötenazi bir farenin göbek merkezinin altındaki deri kapmak, sadece deri ile kesilmiş, ve sonra yavaşça altta yatan karın kas duvarından ayırmak için deri çekin. Deri kesi aynı satırı takip, karın boşluğu içine kesilmiş.
Bir dizi embriyo içeren rahmi çıkarın. Sonra, yavaşça yumurta kesesi ve amnion gibi ekstraembriyonik dokuları kaldıracaktır rahim duvarı, keserek embriyoları çıkarın. Her embriyodan başı kesin ve izole edin ve forcep'ler ile her kafa %4 PFA içeren 12 kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyusuna aktarın.
Dört saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yat. PBS'deki kafaları dört santigrat derecede 12 saat boyunca hafifçe sallayarak durula. Kafaları kriyokorumak için, pbs%30 sakaroz iki mililitre içeren yeni bir 12-well plaka içine forceps kullanarak aktarın.
Başları çanak altına batana kadar dört derece santigrat nazik ajitasyon ile kuluçka. Kriyokorunmuş kafaları yerleştirmek için, bunları Optimal Kesme Sıcaklık Bileşiği içeren bir kalıba aktarın ve birkaç dakika boyunca dengeleyin. Forceps kullanarak, numunelerin yerini ve yönünü, numunelerin kesilmiş tarafının gömme kalıbının altına dönük olacak şekilde ayarlayın.
Daha sonra, donmak için kuru buz üzerine kalıp yerleştirin ve kriyosectioning için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derece bir plastik torbada saklayın. Doğum sonrası doku için, bir ötenazi deri ve yağ dokuları çıkardıktan sonra, üç hafta üç aylık fare, kesilmiş ve baş izole ve mandibula kaldırmak. Sonra, düzeltmek ve embriyo kafaları ile yapılan baş kriyoprotect.
EKIM embriyo başkanları gibi benzer bir şekilde% 8 jelatin gömmek ve kriyosectioning kadar eksi 80 santigrat derece bir plastik torbada Cryomolds tutun. Uygun kriyostat sıcaklığını ayarlayın. Kriyostat sıcaklığına denk gelmek için numuneleri yaklaşık 30 dakika kriyostat odasına yerleştirin.
Cryomold'dan numuneyle birlikte bloğu çıkarın ve numunenin kesilmiş tarafını chuck'tan en uzakta ve operatöre bakacak şekilde tutup, numunenin kesilmiş tarafını tutmak için bir OCT damlası ile numunenin üzerine monte edin ve dondurun. Bloyostat nesne tutucuüzerine blok monte chuck yükleyin. Bıçak tutucuyu, bıçak açısının örneğe göre 3-5 derece olacak şekilde ayarlayın.
Kaplamalı mikroskop slaytlar üzerine 10 mikrometre bölümleri toplayın. Bölümleri tamamen kuruyana kadar oda sıcaklığında bırakın ve eksi 80 derecede saklayın. Boyama ile başlamak için, eksi 80 santigrat derece slaytlar çıkarmak ve bölümleri hava-kurutmak için bir saat oda sıcaklığında tutun.
Oct'yi yıkamak ve bölümleri permeabilize etmek için slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez %0,1 PBST'de durulayın. Her slayta 200 mikrolitre bloklama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın. Ardından, slaydı durulamadan engelleme çözümlerini kaldırın.
Her slayt için engelleme çözeltisi seyreltilmiş birincil antikor 100 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pbs ile üç kez durulayın. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
PBS'de her biri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez durulayın, hala ışıktan korunun. Slaytları monte etmek için, her slayta DAPI ile iki damla solmaya karşı orta ekleyin, kapak kapağını bir kapak la kaplayın ve görüntüye hazır olana kadar dört derece santigrat derecede saklayın. Kontrol embriyolarının frontal kemikleri pSmad1/5/9, downstream BMP sinyal faktörleri ve hücre proliferasyonu belirteci Ki67 pozitifti.
Nöral krest spesifik, konstitutively aktive BMPR1A mutant embriyolar, ancak, ki67 düzeyleri azalmış iken pSmad1/5/9 düzeyleri artırıldı. Ayrıca mutant embriyoların ön kemiklerinde kontrol embriyolarına göre daha fazla apoptotik hücre gözlenmiştir. Jelatin gömülü kafaların koronal kriyokesitleri, burun kemiği ve burun dokularında bulunan bir tdTomato kasetinden gfp sinyali ve RFP sinyalini açıkça göstererek jelatinin floresan sinyalleri etkilemediğini gösterir.
Bu kesitler SOX9 veya Osterix ve E11/Podoplanin için immünosüllere büründüğünde, üç haftalık sert dokuların çoğundan kaliteli kesitler elde edildi. Öte yandan, üç aylık örneklerle, femur, burun dokuları ve kafatasının trabeküler bölmesi de dahil olmak üzere sert dokuların sadece bazılarında nazal-premaxilla sütür ve başın çevresindeki kemikler de dahil olmak üzere kaliteli bölümler elde edilebildi. SOX9-pozitif hücreler özellikle büyüme plakası kondrositlerinde ve femur ve nazal septumdan eklemde saptandı.
Üç haftalık kesici dişlerde mezenkimal hücrelerde SOX9 saptırıldı. Osterix ve E11 çift boyama sonuçları Osteoblastlarda Osterix saptandığını, E11'in ise femur ve baş kemik osteositlerinde saptandığını göstermektedir. Üç haftalık kesici dişlerde Osterix odontoblastlarda pozitif, folikül mezenkimal hücrelerinde E11 pozitifti.
Lütfen %4 PFA ile numuneleri aşırı düzeltmeyin. Jelatinde çözülmemiş sert dokuların kesiti için en iyi sıcaklık eksi 25 santigrat derece ve daha düşüktür. Bu prosedürü takiben, floresan düzeyleri protokolümüzde açıklandığı gibi ölçülebilir.
Bu ölçümler, farklı gruplar arasındaki protein ingöreceli düzeyinin farkını göstermek için bilgilendirici veriler sağlayacaktır. Bu teknik, geliştirildikten sonra farklı proteinlerin ortak ifade kalıplarını elde etmek için çift veya üçlü boyamanın önünü açmıştır. %4 PFA tehlikelidir.
Bu cilt alerjileri neden olabilir, ciddi göz hasarı, organ hasarları, veya kanser. Lütfen kişisel koruyucu ekipmanlar kullanın ve kullanımdan sonra cildi iyice yıkayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kesitlenmiş fare kraniyal yüz dokularında proteinlerin immünofloresan tespiti için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, antijen geri kazanımı ve dekalsifikasyon ihtiyacını ortadan kaldırarak immünoboyama sürecini basitleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- İmmünoloji
Arka Plan
- Kraniofasyal morfogenez ve patogenez, kritik çalışma alanlarıdır.
- Protein seviyelerinin anlaşılması, gelişim süreçleri hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Geleneksel yöntemler genellikle zaman alıcı olabilen kapsamlı bir hazırlık gerektirir.
- Bu protokol, süreci basitleştirmeyi ve kalitesi koruyucu şekilde uygulamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Kraniofasyal dokularda protein seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- İmmünoboyama tekniklerinin verimliliğini artırmak.
- Kraniofasyal gelişim ve ilgili bozukluklar üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kesitlenmiş fare kraniyal yüz dokularında immünofloresan tespiti.
- Dekalsifiye edilmemiş sert dokuların hazırlanması ve kriyoseksiyonu.
- Antijen geri kazanım adımlarından kaçınılması.
- Protein seviyelerini değerlendirmek için immünoboyama tekniklerinin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Protokol, dekalsifikasyon ihtiyacı olmadan proteinleri başarılı bir şekilde tespit eder.
- İmmünoboyama sonuçları yüksek kalitede ve tekrarlanabilirdir.
- Yöntem, geleneksel tekniklere kıyasla zaman ve emek tasarrufu sağlar.
- Kraniofasyal morfogenezi incelemek için yararlı bir araç sunar.
Sonuçlar
- Bu protokol, kraniyal yüz çalışmalarında protein tespiti için basitleştirilmiş bir yaklaşım sunar.
- İmmünoboyamanın verimliliğini artırarak, araştırmacılar için erişilebilir hale getirir.
- Yöntem, kraniyal yüz gelişimini daha iyi anlamaya katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables efficient protein detection in craniofacial tissues by eliminating antigen retrieval and decalcification steps, reducing time and labor in preclinical target validation workflows. It supports mechanistic de-risking by providing reliable spatial protein expression data in disease-relevant systems, facilitating go/no-go decisions in early discovery. The method enhances assay standardization and reproducibility for downstream screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific protein localization in craniofacial morphogenesis models.
- Operational Value: Reduces procedural complexity by avoiding antigen retrieval and decalcification, accelerating target validation timelines.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking via high-quality immunostaining of key markers like pSmad1/5/9 and Ki67 in BMP signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized cryosections suitable for quantitative immunofluorescence screening of protein expression changes.
- Reproducibility: Enables consistent section quality from undecalcified hard tissues, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Scalability: Compatible with gelatin embedding for long-term storage and batch processing of tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to craniofacial pathogenesis models, allowing assessment of protein expression alterations in mutant embryos.
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining antigen integrity without harsh treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of fluorescence levels to inform go/no-go decisions based on protein expression thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and pathway clarification in craniofacial biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting spatial protein expression patterns in embryonic and postnatal tissues.
- Screening: Enables assay standardization through consistent cryosectioning and immunostaining of hard and soft tissues.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts that allow comparison of protein levels across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving tissue morphology and antigenicity in undecalcified samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein detection across multiple tissue types with protocol adaptations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reliable detection of proliferation and apoptosis markers.
- Operational Value: Improves standardization and reduces variability by eliminating antigen retrieval steps.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by decreasing hands-on time and accelerating data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative protein expression data for decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cryoprotection, and immunofluorescence techniques.
- Dependent on cryostat and fluorescence microscopy infrastructure for sectioning and imaging.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and washing protocols across teams.
- Requires adaptation of embedding media (OCT vs. gelatin) based on tissue age and hardness.
- Limited by antibody specificity and quantification challenges noted in the source material.
