Name: İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, Astyanax mexicanus embriyolarında gen ifadesini minimal arka plan boyamasıyla görselleştirmek için bu optimize edilmiş in situ hibridizasyon protokolünü. Gelişimsel biyoloji ve nörobilim araştırmaları için yeniden üretilebilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu makale yararlı yorumlar için brüt laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. 2017 ve 2018 Christine Cao, Michael müdür, Aki Li ve David Nwankwo dahil olmak üzere, yaz staj sırasında bu iletişim kuralı kullanıldığında dört lise öğrencileri kabul etmek istiyorum. HL 2017 yaz aylarında UC Biyoloji Kök bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (JBG için DEB-1457630) ve ulusal kurumları diş ve Fasiyal araştırma (NIH; gelen hibe tarafından desteklenmiştir JBG için DE025033).

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Cincinnati Üniversitesi (iletişim kuralı #10-01-21-01) tarafından onaylanmış olması.
1. fiksasyon
<ol><li>İstediğiniz bir üreme tanktan Astyanax mexicanus embriyo sayısını belirleyip ~ 50 embriyo teker teker çözmek. Embriyo büyük ve eski ise, 25 hatta fiksasyon sağlamak için teker teker düzeltmek gerekli olabilir.</li>
	<li>Embriyo yaş bağlı olarak, anestezi IACUC onaylı yöntemi kullanmaktadır. İşleyen bir sinir sistemi ile büyük embriyolar için embriyo anestezik aşırı doz ile kurban. Buna göre ağrı ve rahatsızlık organizma için en aza indirmek için ~ %1 tricaine (pH 7.4 arabelleğe alınmış) bir çözümde embriyo yerleştirin.</li>
	<li>Embriyo dokunmak yanıt vermeyen bir kez, sistem su tricaine içeren değiştirin ve ~ 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 7,4) ekleyin.</li>
	<li>PBS çözümü kaldırmak ve 1 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Embriyo gecede 4 ° C'de düzeltmek Dikkat: PFA (yani, yanıcı ve bir deri ve akciğer tahriş edici) tehlikeli, dikkatli.</li>
</ol>2. su kaybı
<ol><li>Embriyo kurutmak için sabitleştirici çözüm kaldırın ve PBS 1 mL ile durulayın. Embriyo içeren şişeleri (30 ° ve 45 °) arasında bir açı üzerinde platform Çalkalayıcı durulama sırasında yerleştirin. Embriyo iki kez, 5 min başına yıkama yıkamak devam edin.</li>
	<li>Embriyo bir koryon hala varsa, tüm 50 embriyo bir 100 x 25 mm Petri kabına yerleştirin ve dikkatle onları--dan mikroskop altında saatçi'nın forseps (örneğin, #5 forseps) iki kümesi kullanarak chorions izole. Not: aşağıda ve protokol kalanında açıklanan adımları sırasında dikkatli bir şekilde temiz kullanarak önceki adımda tüm sıvı çıkarın, cam Pasteur Pipetler sonraki çözüm eklemeden önce</li>
	<li>Aşağıda açıklanan metanol (MeOH) giderek yoğun yıkar bir dizi embriyo kurutmak. Dilutions çözümün her 4 mL cam şişe gidiş 500 µL olan bir 1 mL toplam birim temel alır. Bütün dehidratasyon adımları, oda sıcaklığında (RT) platform Çalkalayıcı üzerinde gerçekleştirin.<ol>
<li>PBS çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. (MeOH 250 µL) + PBS 750 µL % 25 MeOH çözüm ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.</li>
		<li>% 25 MeOH çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. (MeOH 500 µL) + PBS 500 µL % 50 MeOH çözüm ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.</li>
		<li>% 50 MeOH çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. (MeOH 750 µL) + PBS 250 µL % 75 MeOH çözüm ekleyin. Yavaşça bir platform üzerinde 5 dakika sallayıcı.</li>
		<li>% 75 MeOH çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 100 MeOH çözüm (MeOH 1 mL) ekleyin. 5 dk. bu adım 3 kez tekrar için bir platform Çalkalayıcı üzerinde yavaşça salla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bu noktada, susuz embriyolar, gerektiğinde, kendi cam şişeleri-20 ° c (uzun vadeli) depolar. Alternatif olarak, doğrudan iletişim kuralı için 1 gün devam edin.</li>
</ol>3. gün 1: sıvı
<ol><li>-20 ° C dondurucudan susuz embriyo elde etmek (ya da doğrudan adım 2.5 devam edin).</li>
	<li>Pasteur pipet kullanarak embriyo sıralayın. Bir temel alınarak morphotype (yani, mağara ve/veya yüzey) sıralayabilirsiniz ve gen sayısı her deneyde değerlendirildi. Genellikle en fazla 12 embriyo bir kez sıralı şişe başına vardır. Kuruluş korumak için renkli laboratuvar bant şişeleri ve her gen Pipetler belirtmek için kullanırsınız. Embriyo aynı şişeyi tüm iletişim kuralı boyunca kalır. Not: Yer % 100 Pasteur pipet ucu arasına sterilize etmek için alkol kullanır.</li>
	<li>Titreyen bir su banyosu 70 ° c daha sonraki bir adımda kullanılmak üzere ayarla. Dikkatle, şişeleri sıralanmış embriyo MeOH dışarı çizin ve yeni %100 500 µL ile yerine MeOH. Yıkama kısaca (~ 1 dk) platform Çalkalayıcı üzerinde.</li>
	<li>1 x PBS ara 20 (PBT, aşağıya bakınız) ile artan bir konsantrasyon platform Çalkalayıcı üzerinde embriyo rehydrate. Dilutions 500 µL her şişe gidiş ile 1 mL son seyreltme birim üzerinde temel alır.<ol>
<li>Bir % 25 PBT çözüm (PBT, MeOH 750 µL 250 µL) ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.</li>
		<li>% 25 PBT çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 50 PBT çözüm (PBT, MeOH 500 µL 500 µL) ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.</li>
		<li>% 50 PBT çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 75 PBT çözüm (PBT, MeOH 250 µL 750 µL) ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.</li>
		<li>% 75 PBT çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 100 PBT çözüm (PBT 1 mL) ekleyin. 5 dk. bu adım 3 kez tekrar için bir platform Çalkalayıcı üzerinde yavaşça salla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gün 1: Sindirim ve fiksasyon
<ol><li>Bir İndinavir K (PK) çözüm PBT 2 mL için PK (20 mg/mL) 1 µL ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Sonraki adımları beklentisiyle hibridizasyon arabellekleri (Hyb - ve Hyb, ek dosya 2 ve ek dosya 3bkz: +;) ve İngiltere'de yılın donmuş aliquots-20 ° C depolama ortamından elde etmek.<ol>
<li>PFA RT. çözülme izin</li>
		<li>Aliquots Hyb ve Hyb + dönen bir 70 ° C su banyosunda yerleştirin. Tüm reaktifler ve şişeleri küçük bir "conta" ile bir kafes alt içinde yüzen su banyosu aparatı içine yerleştirin. Bu basit toplama ve tüpler ve şişeleri dönen 70 ° C su banyosu dan kaldırılmasını sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaşça PK eriyik-e doğru tüm dokularda sağlanması embriyo vial(s) tamamen çözümü ile kaplı ekleyin. PK çalışma çözüm platform Çalkalayıcı üzerinde ~ 12 min için embriyo sindirmek. Not: Sindirim uzunluğu en uygun sonuçlar sağlamak için araştırmacı tarafından değiştirilebilir.</li>
	<li>Yavaşça PK çözüm çizmek ve kısa bir süre kalan herhangi bir PK. sulandırmak için PBT ile şişe sel</li>
	<li>PBT çözüm çizmek ve yeni PBT 500 µL ile değiştirin. Platform Çalkalayıcı 5 min için durulama çözüm sağlar.</li>
	<li>PBT çizmek ve çözdürülen %4 500 µL ile yerine İngiltere'de yılın. Platform Çalkalayıcı RT., üzerinde 20 dk için kuluçkaya embriyo izin</li>
	<li>%4 off çizmek PFA ve kısa bir süre kalan herhangi bir PFA sulandırmak için PBT ile şişe su basması. PBT çizmek ve taze PBT 500 µL ile değiştirin. Embriyo platform Çalkalayıcı üzerinde 5 min için durulama izin. Bu 4 kez daha tekrarlayın.</li>
</ol>5. gün 1: Prehybridization
<ol><li>Şişeyi içine Önceden ısıtılmış Hyb çözüm yer 500 µL. Dikkatle şişe, sallayarak için 5 dk 70 ° C su banyosu (içinde contalar) olmadan yerleştirin.</li>
	<li>Hyb çözüm çizmek ve flakon 500 µL Önceden ısıtılmış Hyb + çözüm ile su basması. Şişe (40 d/d) sallayarak ile 70 ° C su banyosu geri yerleştirin. Ya 4 h için kuluçkaya, veya bir gece. Not: 4 h kuluçka için toplam 4 gün sürecek bir yerinde iletişim verecektir. Burada, bu adımı Toplam 5 gün süren bir protokol ortaya çıkarır bir gecede kuluçka olarak sunulur.</li>
</ol>6. gün 2: hibridizasyon
<ol><li>Bir aliquot Hyb + 5 min için titreyen sıcak su banyosu-20 ° C dondurucudan yerleştirin.</li>
	<li>Hyb + şişe çizmek ve Önceden ısıtılmış Hyb + 500 µL ile değiştirin. Bu, dikkatle RNA inceleyebilirsek 2 µL her şişe ekleyin. Yavaşça sonda eşit dağılımı sağlamak için şişe girdap.</li>
	<li>70 ° C sıcak su banyosu Hyb + (ile eklenen sonda) çözümde gecede 40 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya. Not: Bir Hyb + (soruşturma ile) çözüm yeniden kullanabilirsiniz. Bunun için Hyb + sonda ile ilk 5 dk. Değiştir Hyb + 1 günden bir sıcak su banyosu içinde Hyb + ile sonda ile protokol ve gecede sıcak su banyosunda kuluçka izin-20 ° C-dondurucu ve yer çalışma almak.</li>
</ol>7. gün 3: Çözüm hazırlık
<ol><li>HYB + "gen ilgi" RNA sonda ile etiketli microcentrifuge tüpleri hazırlayın. 3 gün boyunca kullanılacak olan dilutions serisi hazırlayın.<ol>
<li>6 ayrı borular kullanarak, dilutions Hyb ve serum sodyum sitrat (SSC, 0-%100) aşağıdaki bir dizi hazırlamak bir 1 mL hacmi ve yer onları sallayarak 70 ° c su banyosu: tüp 1 = %100 Hyb-(Hyb-1 mL): tüp 2 = %25 2 x SSC (2 250 µL x SSC, Hyb-750 µL); 3 = %50 2 x SSC tüp (2 x SSC, Hyb-500 µL 500 µL); 4 = %75 2 x SSC tüp (2 x SSC, Hyb-250 µL 750 µL); 5 = %100 2 x SSC (2 x SSC 1 mL); tüp 6 = %100 0.2 x SSC (0.2 x SSC 2 mL) tüp. Not: 0,2 için 2 x değiştikçe SSC, konsantrasyon uyanık olmak x.</li>
		<li>4 kullanarak ayrı tüpler 1 mL hacminde PBT ve SSC dilutions aşağıdaki bir dizi hazırlamak ve yerleştirin RT: tüp 1 = %25 PBT (PBT, 0.2 750 µL 250 µL x SSC); 2 = %50 PBT tüp (PBT, 0.2 x SSC 500 µL 500 µL); 3 = %75 PBT tüp (PBT, 0.2 x SSC 250 µL 750 µL); 4 = %100 PBT (PBT 1 mL) tüp.</li>
		<li>Maleik asit tampon ara 20 (MABT) çalışma solüsyon içeren 2 mL ile bir tüp hazırlayın.</li>
		<li>Çözüm engelleme iki 15 mL konik tüp hazırlayın. Her tüpün engelleme reaktif 0.2 g MABT 10 mL için eklemek (bkz. ek dosya 4). Çözüm (en çok 3 saat) içinde tamamen çözülmüş kadar her iki tüpler nutating Mikser (veya platform çalkalayıcı) yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. gün 3: Sonda kaldırma
<ol><li>Bir cam Pasteur pipet ile çözüm Hyb + (soruşturma ile) kapalı çizmek ve microcentrifuge tüp etiketli bir steril yerleştirin. (Sonda etiketleme başarılı olursa) bu tüp-20 ° C-dondurucu ileride kullanmak üzere saklayın.</li>
	<li>Dikkatle sıcak SSC/Hyb-(aşağıda belirtilen) dilutions 500 µL ekleyin. Her 10 min her 70 ° C sallayarak su banyosu için aşağıdaki çözümleri kuluçkaya.<ol>
<li>%100 ile sırayla kuluçkaya Hyb-(Hyb-1 mL), %25 2 x SSC (2 250 µL x SSC, Hyb-750 µL), %50 2 x SSC (2 500 µL x SSC, Hyb-500 µL), %75 2 x SSC (750 µL 2 x SSC, Hyb-250 µL), %100 2 x SSC (2 1 mL x SSC) , %100 0.2 x SSC (0.2 2 mL x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Son adım, her 10 min için aşağıdaki çözümleri kuluçkaya. Tüm aşağıdaki incubations platform Çalkalayıcı RT yerini al: % 25 PBT (PBT, 0.2 750 µL 250 µL x SSC), %50 PBT (PBT, 0.2 500 µL 500 µL x SSC), %75 PBT (PBT, 0.2 250 µL 750 µL x SSC) , % 100 PBT (PBT 1 mL).</li>
	<li>%100 10 dk kuluçka sonra kaldırmak PBT ve MABT 500 µL her şişe içine ekleyin. İki kez 5 min için bu adımı yineleyin.</li>
</ol>9. gün 3: engelleme
<ol><li>MABT her flakon ve sel premix engelleme çözüm birinden (7.1.4 adımda hazırlanan) tüpler ile kaldırın. RT ~ 4 h için nutating Mikser şişe yerleştirin</li>
	<li>2 ekleyin DIG-AP Fab µL parçaları 10 mL (7.1.4 adımda hazırlanan) çözüm ve kısaca girdap engelleme ikinci şişe.</li>
	<li>Her şişe neredeyse tamamen çözüm (~ 5 mL) engelleme ile doldurun ve nutating Mikser gecede 4 ° C'de buzdolabında yerleştirin</li>
</ol>10. gün 4: MABT durular
<ol><li>MABT % 10 normal keçi serum (NGS) hisse senedi bir şişe hazırlamak (100 µL NGS MABT 900 µL için ekleyin).</li>
	<li>Her şişe engelleme çözümde kapalı çizip 500 µL NGS/MABT karışımı her şişe ekleyebilirsiniz. RT platform Çalkalayıcı tarih itibariyle 25 min için kuluçkaya embriyo izin.</li>
	<li>NGS/MABT karışımı ile %100 500 µL yerine MABT. RT platform Çalkalayıcı tarih itibariyle 30 dk için kuluçkaya. Bu durulama 11 kez daha gün her 30 dk boyunca gerçekleştirin.</li>
	<li>%100 MABT ve bir nutating Mikser geceleme bir buzdolabı veya Walk Odası 4 ° C'de yer ile şişe doldurun</li>
</ol>11. 5. gün: Sonda görselleştirme
<ol><li>Alkalen fosfataz (AP) arabelleği 50 mL aliquot hazırlamak (bkz ek dosya 5). Aşağıda ışık pozlama sınırlamak için alüminyum folyo sarılı bir 50 mL konik tüp, birleştirmek: 1 M Tris (pH 9,5), 50 mm MgCl2, % 1 5 mL 5 mL 5 mL ara 20, 1 M NaCl, ddH2O 30 mL 5 mL.</li>
	<li>MABT kaldırın ve 1 mL AP arabelleği (folyo sarılı tüp) ile değiştirin. Bırak için 5 dakika yıkayın. İki kez MABT tümüyle kaldırılmasını sağlamak için bunu.</li>
	<li>AP arabellek kaldırmak ve AP önbellekle 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) ve 4.5 ile 1 mL yerine μL nitro-mavi tetrazolium (NBT). Her saat kadar reaksiyon tamamlandıktan sonra taze hazırlanmış AP arabellek/NBT/BCIP ile değiştirin. Yakından, her elde boyama istenen seviyeye kadar gerçekleşmesi renklendirme tepki izin vermek için 15dk, kontrol izleriz. Çökelti forma başlıyorsa, çözüm er değiştirin.</li>
	<li>Sinyal (ile arka plan boyama en az miktarlarda) en uygun düzeyde elde kadar renklendirme tepki, 5 dk. devam durular PBT için taze % 100 AP arabelleği (olmadan NBT/BCIP) embriyo durulama tarafından durdurmak. PBT AP arabelleği dilutions aşağıdaki gibi artan numuneler durulama devam: % 25 PBT (PBT, AP arabelleği 750 μL 250 μL), durulama için 5 min; % 50 PBT (PBT, AP arabelleği 500 μL 500 μL), durulama için 5 min; % 75 PBT (PBT, AP arabelleği 250 μL 750 μL), durulama için 5 dak.</li>
	<li>Embriyo üzerinde en az arka plan boyama istenilen kadar nutating Mikser PBT ulaştı % 100 ~ 5 mL durulayın. Dışarı birkaç kez ile taze PBT geçiş. Bu birkaç gün sürebilir.</li>
	<li>Durulama bir platform Çalkalayıcı steril PBS 500 μL eksiksiz, yıkama embriyo olduğunda. Bu durulama iki kez 5 min için gerçekleştirin. PBS yıkar sonra numune %4 500 μL içinde sonrası tamir PFA RT bir platform Çalkalayıcı üzerinde 1 h için. Alternatif olarak, bir gecede 1 mL % 4 saptamak PFA 4 ° C'de buzdolabında</li>
	<li>Sabitleştirici taze ile yerine steril PBS. Bu durulama için en az iki kez 5 dk. yer embriyo ~ 4 mL % 100 steril PBS gerçekleştirmek ve uzun vadeli 4 ° C'de depolayın</li>
</ol>12. görüntüleme
<ol><li>Görüntüleme bir tabak içinde bir petri %3 özel ve TAE arabellek kullanarak oluşturur. Not: Miktarları kaç tabak ihtiyaç vardır göre değişir. Tabak birkaç kez yeniden kullanılabilir. Bu jel bir depresyon için plaka üzerinde embriyo içeren oluşturmak için soğutma ise sığ bir dikdörtgen kalıp kabında yerleştirilir önerilir.</li>
	<li>Embriyo PBS plaka üzerine yerleştirin. Not: Hafifçe embriyo yerine onları pipetting onlar plastik Pipetler içeriye doğru sopa bulundu çünkü plaka üzerine dökmek en iyisidir.</li>
	<li>Işık mikroskobu her embriyo görselleştirmek için kullanın. Künt bir sonda embriyoların istenen konuma manevra için kullanın.</li>
	<li>Embriyo istenen konuma geldiğinde fotoðraf. Not tamamlanmış boyama leke potansiyel bozulma önlemek için birkaç hafta içinde embriyo görüntülerini almak önemlidir.</li>
</ol>

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
<li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cranial+patterning+in+the+direct%E2%80%90developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li>
<li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li>
<li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).</li>
<li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1-chemokine%2C+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2C+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li>
<li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28Adcyap1%29+and+its+receptor+subtypes+%28Adcyap1r1%2C+Adcyap1r2%2C+and+Adcyap1r3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li>
<li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li>
<li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).</li>
<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bozulması için RNA açığı nedeniyle iletişim kuralındaki en önemli adımlardan biri RNA prob steril sentezi ile ilgili. Bir sonda dikkatli bir şekilde oluşturulur ve iyi sonuçlar sağlar, ancak, bu sonraki boyama reaksiyonlar yeniden kullanılabilir. İkinci önemli bir adım boyunca protokolünün kullanılan tüm reaktifler dikkatli yapımıdır. Bu iletişim kuralı birkaç gün ve birçok küçük adımlar gerektirdiğinden, bu önemlidir tüm reaktifler doğru vardır üretilen ve steril bir şekilde depolanır. Ayrıca, araştırmacı iletişim kural...

İn situ hibridizasyon gen ifade desenleri1görselleştirmek için sabit dokular boyama için yaygın bir yöntemdir. Bu teknik için diğer geleneksel2 ve geleneksel olmayan3 model sistemleri, yıllardır biyolojik çalışmalar çeşitli yapıldı. Ancak, birkaç adım ve Kimyasalları başarıyla bu yordamı gerçekleştirmek gereklidir. Hiç bu teknik yapmadıysanız müfettişler için işlemini Başlatan birçok adımları nedeniyle korkutabilir. Ayrıca, bu yordamı uzun doğası ile ilgili sorun giderme için zorlu teknik hatalar için oldukça rahat.
Bu makalede genel amacı bu hibridizasyon teknik geniş bir kitleye için erişilebilir hale getirecek bir basit ve kolay yöntem sunmaktır. Giriş hataları azaltmak için yüksek kaliteli gen ifade boyama verimleri ve non-spesifik arka sinyal en aza indirir basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yordamı diğer yaklaşımlar Danio rerio4gibi geleneksel modeli sistemlerde gelişmiş benzer. Burada, dikkatli dikkatli uygulama Protokolü'nün tanıtmak için indirilebilir bir kontrol listesi (ek dosya 1) kullanarak her adım uygulanması kolaylaştırmak hedefliyoruz. Bunu yapmak için gerekçe bu yordamda birçok adımlar ile organizasyon kolaylaştırmaktır. Bu makalede araştırmacılar embriyo geliştirilmesinde bütün-mount In situ hibridizasyon gerçekleştirmede baktılar için uygundur, ancak henüz işlem yapmamış. Astyanax araştırmacılar için seçilen yaklaşımı bu test edilmiş ve kanıtlanmış cavefish ve yüzey balık morphs, böylece karşılaştırmalı ifade analizleri kolaylaştırmak avantajdır. Astyanax ve diğer sistemlerde çalışmalarda araştırmacılar tarafından sunulan yöntem kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serolojik Pipet</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Filtrasyon Ünitesi</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serolojik Pipet</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Filtrasyon Ünitesi</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipet</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Filtrasyon Ünitesi</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçaları</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Engelleme Çözeltisi</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>DIG RNA Etiketleme Kiti (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Cam dram şişeleri</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 Dr</td></tr><tr><td>Cam Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Termal-BilimselPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür-kristal</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Maleik Asit</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>Moleküler dereceli Su (RNaz içermez)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>NaOH peletleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NBT Yüzey tozu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Somunlama Mikseri</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinaz K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Plastik Pipetler</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Çalkalamalı Su Banyosu 12 L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>Standart Analog Çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>tRNA Maya</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td></td><td>15401011 25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Bilimsel-Bilimsel Endüstriler, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Klorür (LiCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

İn situ hibridizasyon astyanax embriyo için wholemount

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Son yıllarda, kör Meksika cavefish (Astyanax mexicanus) için bir taslak genom, binlerce gen için sıra kimlik açığa çıktı. Ortaya çıkan bu model sistem içine önceden araştırma çeşitli mağara ilişkili fenotipleri ile ilişkili çok sayıda nicel özellik loci (QTL) belirledik kapsamlı genom geniş araştırmalar üzerinde büyük harf. Ancak, faiz genler kalıtsal olarak fenotipik değiştirmek için bağlanma olanağı önemli bir meydan okuma kalır. Troglomorphic evrim gelişiminde rolü daha derin bir anlayış kolaylaştıran bir bütün-mount In situ hibridizasyon tekniktir. Bu teknik doğrudan gen ekspresyonu mağaralarda ve yüzey yaşayan biçimler arasında karşılaştırmak, kurulan QTL altında yatan genlerin aday, genlerin yeni nesil sıralama çalışmalar dan ilgi tanımlamak veya diğer geliştirmek için uygulanabilir keşif dayalı yaklaşımlar. Bu raporda, yaygın olarak sunulan çalışma sistemi çok ötesinde kullanmak için adapte edilebilir bir esnek denetim listesi tarafından desteklenen basit bir protokol tanıtacağız. Bu iletişim kuralı Astyanax toplum için ve ötesinde geniş bir kaynak olarak hizmet verebilir umulmaktadır.

Bu raporda, biz yüksek kaliteli gen ifade analizi için embriyonik Astyanax örneklerin etiketleme gerçekleştirmek için basit ve kolay bir yaklaşım sağlar. Bu teknik dört ya da beş gün içinde yürütülen olabilir ve yordamı asıl her adımda bir renk kodlu akış (şekil 1) temsil edilir. Bir kez tam, lekeli embriyo ilgi belirli gen ifade dokularda koyu mor renk etiket liman. Biz başarıyla bu protokole Pachón cavefish (şekil 2A<s...

Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

In situ protokolümüz önemlidir çünkü gen ekspresyonu desenlerini en az arka plan boyama ile görselleştirmenin basit bir yolunu sağlar. Bu teknik, karmaşık ve uzun bir protokolün gerçekleştirilmesini nispeten kolaylaştırır. Benchtop, bu protokolün doğru şekilde gerçekleştirilip yeniden oluşturulmasını kolaylaştıran öneriler ve denetim listeleri ayarlayın.Burada gösterilen teknikler Astyanax mexicanus'a özgü olsa da, protokole küçük ayarlamalar yapılan, nispeten büyük boyutlu bireylerin diğer sistemlerine adapte edilebilir. İlk olarak, her gen için şişe ve pipetler belirlemek için renkli laboratuvar bandı kullanın. Pasteur pipeti kullanarak embriyoları sıralayın.Şişe başına genellikle en fazla 12 embriyo vardır. Sonra, 70 santigrat derece bir sallayarak su banyosu ayarlayın. Dikkatle sıralanmış embriyoların şişeleri metanol dışarı çekmek ve taze% 100 metanol 500 mikrolitre ile değiştirin.Bir platform shaker üzerinde yaklaşık bir dakika için embriyolar kısa bir süre yıkayın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi bir platform shaker üzerinde Tween 20 ile 1x PBS artan konsantrasyonda embriyolar rehydrate. Başlamak için, 70 santigrat derece önceden ısıtılmış olan dönen su banyosu içine bir örgü alt küçük bir conta yerleştirin.Conta içine hibridizasyon tampon eksi ve hibridizasyon tampon artı aliquots yerleştirin. Tüm dokuların tamamen çözeltiyle kaplı olmasını sağlayan embriyo şişelerine hazırlanmış bir PK çözeltisi ekleyin. Şişeleri bir platform çalkalayıcıya aktarın ve proteinaz K çalışma çözeltisinde yaklaşık 12 dakika sindirin.Bundan sonra, pk çözeltisini yavaşça çekin ve kalan PK'yı seyreltmek için şişeyi PBT ile birlikte kısa bir süreliğine sulayın. PBT çözeltisini 500 mikrolitre taze PBT ile değiştirin ve çözeltinin platform çalkalayıcısında beş dakika durulanmasına izin verin. Daha sonra PBT çözeltisini 500 mikrolitre çözülmüş %4 PFA ile değiştirin. Embriyolar 20 dakika oda sıcaklığında platform shaker üzerinde kuluçka yaslayın.Ön hibridizasyona başlamak için, embriyo içeren şişelere 500 mikrolitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon eksi çözeltisi ekleyin. Beş dakika boyunca sallayarak olmadan 70 santigrat derece su banyosunda conta içine şişeleri dikkatlice yerleştirin. Sonraki hibridizasyon tampon eksi çözüm kapalı çekmek ve önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon artı çözüm 500 mikrolitre ile şişeleri sel.Su banyosunda conta içine şişeleri geri yerleştirin ve dört saat ya da bir gecede sallayarak kuluçka. Hibridizasyon abaşlamak için, şişeler dışında hibridizasyon tampon artı çizmek ve taze önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon artı 500 mikrolitre ile değiştirin. Her şişeye iki mikrolitre RNA sondası ekleyin ve sondanın eşit dağılımını sağlamak için yavaşça girdap layın.40 RPM sallayarak bir gecede 70 santigrat derece su banyosunda kuluçka. Başlamak için, mikrosantrifüj tüpleri hibridizasyon tampon artı ilgi RNA prob geni ile metin protokolünde belirtildiği gibi etiketli hazırlamak. İki adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve 0,2 gram bloke reaktifi ve 10 mililitre MABT ekleyin.Reaktif çözeltide tamamen eriyene kadar her iki tüpü de bir besleyici mikser üzerine yerleştirin. Bir cam Pasteur pipet kullanarak hibridizasyon tampon artı ve prob çözeltisi çizmek ve steril etiketli mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin. Bu tüpü ileride kullanılmak üzere eksi 20 derecede dondurucuda saklayın.Dikkatle sıcak tuzlu sodyum sitrat ve hibridizasyon tampon eksi seyreltme 500 mikrolitre ekleyin. Her biri sallayarak su banyosunda 10'er dakika sıralı çözeltiler halinde kuluçkaya yatırın ve metin protokolünde belirtildiği gibi bir platform çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında. Son kuluçkadan sonra, her şişedeki %100 PBT'yi 500 mikrolitre MABT ile değiştirin.Bu işlemi her biri beş dakika boyunca iki kez tekrarlayın. İlk olarak, her şişeden MABT çıkarın ve 15 mililitrelik konik tüpler birinden önceden karışık engelleme çözeltisi ile sel. Oda sıcaklığında dört saat boyunca besleyici karıştırıcı üzerine her iki şişe yerleştirin.Hazırlanan bloklama çözeltisi ve kısaca girdap ikinci tüp antikor parçaları iki mikrolitre ekleyin. Sonra engelleme çözeltisi ile neredeyse tamamen her şişe doldurun ve dört derece santigrat bir buzdolabında bir gecede bir nutating karıştırıcı üzerine yerleştirin. Başlamak için, MABT%10 NGS'lik bir stok şişesi hazırlayın.Her şişedeki engelleme çözeltisini bu NGS çözeltisinin 500 mikrolitresi ile değiştirin. Platform shaker oda sıcaklığında 25 dakika kuluçka. Bundan sonra NGS karışımını %100 MABT'nin 500 mikrolitresiyle değiştirin.30 dakika boyunca oda sıcaklığında platform shaker incubate. Bu durulayın 11 gün boyunca, her 30 dakikada bir daha. Sonra% 100 MABT ile her şişe doldurun ve dört derece santigrat bir buzdolabında bir gecede bir besleyici karıştırıcı üzerine yerleştirin.İlk olarak, her şişedeki MABT'yi bir mililitre AP tamponuyla değiştirin ve beş dakika boyunca yıkamasına izin verin. MABT'yi tamamen kaldırmak için bu yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra AP tamponu, 3,5 mikrolitre BCIP ve 4,5 mikrolitre MBT içeren bir mililitre taze AP tamponu ile değiştirin.Reaksiyon tamamlanana kadar her saat başı BCIP ve MBT içeren yeni bir AP tampon karışımı yla değiştirin, reaksiyonu yakından izlediğinden ve istenilen boyama düzeyielde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol ettiğinizden emin olun. Protokolde belirtildiği gibi AP tamponunda 1X PBT konsantrasyonu artan bir konsantrasyonda embriyoları durulayarak renklenme reaksiyonunu durdurun. İstenilen minimum arka plan boyama ulaşına kadar bir besleyici karıştırıcı üzerinde yaklaşık beş mililitre% 100 PBT embriyolar durular.Durulama tamamlandığında, embriyoları 500 mikrolitre steril PBS'de bir platform çalkalayıcı üzerinde yıkayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi örnekleri postfix. Embriyoları duruladıktan sonra, %100 steril PBS'nin dört mililitreye yerleştirin ve gerekirse uzun süreli olarak dört santigrat derecede saklayın. Bu çalışmada embriyonik Astyanax örnekleri yüksek kaliteli gen ekspresyonu analizi için etiketlenmiştir.Bu süreç hem Pachon mağara balığı hem de yüzey balığı embriyolarında başarıyla uygulanmıştır. Sox9 ekspresyonu için etiketlenmiş mağara balığı embriyoları, gelişmekte olan dalsal kemerlerde ve pektoral yüzgeçlerde açık etiketleme göstermektedir. Boyama nın sarısı kesesinde veya yan tarafta gelişen somitlerde neredeyse yok olduğunu unutmayın.Benzer şekilde, Tfap2a ekspresyonu embriyonun dorsal böğür bölgesi boyunca erken göç nöral krest hücreleri olarak gelişmekte olan baş ın bölümlerinde belirgindir. Mağara balığı embriyoları phf20a için sunulan üçüncü gen, kemik dokusuna yol açan somatik mezoderm ve posterior baş bölümlerinde görülür. CXCR için etiketlenmiş yüzey balık embriyoları baş ve kanadın izole bölgelerinde pozitif etiketleme göstermek, yanı sıra sarısı kesesini örten birkaç bireysel hücreler.Adcyap1a geni hipofiz hücreleri de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin bölgelerinde ifade edilir. Embriyonun dorsal yönü üzerinde eşleştirilmiş hücre çiftleri içinde yüksek özgüifade, hem de orta hat ifade daha büyük bir bölge unutmayın. Mağara balığı embriyoları için incelenen son gen olan Sox10, dorsal embriyonun sol ve sağ taraflarında nöral tepenin erken bir belirteci olarak belirgindir.Situ'u tamamladıktan sonra, genellikle Sonuçlarımızı ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyiz. Boyama bozulmasını önlemek için tamamlanmasından sonra iki hafta içinde bunu yapmak en iyisidir.

wholemount-in-situ-hybridization-for-astyanax-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Bu video tüm montaj immünhistokimya, bir antijen mekansal ve zamansal ifade desenini genç civciv embriyolarında görüntülendi edilebilecek bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem başlangıçta Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından piyasaya sürüldü.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

Düğüm ve notochordal plaka gelişmekte olan çeşitli teknikler kullanarak görüntülenir fare embriyo organizatörler sinyal geçici. Burada, biz iki çalışma onların yapısı ve morfogenetik bozmak nasıl ayrıntılı olarak tarif: 1) Tarama elektron mikroskobu (SEM); ve 2) bütün Dağı ayirt (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

Burada sunulan zebra balığı ve tüp oluşumu tahlil de hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinde tam montaj in situ RNA hibridizasyon analizi için bir protokol vasküler oluşumunda endoglin rolünü incelemektir.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Öğrenin, Astyanax mexicanus embriyolarında gen ifadesini minimal arka plan boyamasıyla görselleştirmek için bu optimize edilmiş in situ hibridizasyon protokolünü. Gelişimsel biyoloji ve nörobilim araştırmaları için yeniden üretilebilir sonuçlar sağlar.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

Daha fazla video keşfet