Name: Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Öğrenin, PEG hidrojellerde hücreleri kapsülleyerek matriks metalloproteinaz ve metabolik aktiviteyi floresan sensörle nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem yüksek verimli ilçe taraması için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Ohio kanser araştırma (OCR), OH, bu eser finansmanı için ABD hem de Kral Suud Üniversitesi (KSÜ), Riyad, KSA ilk yazar sponsorluk için kabul etmek istiyorum. Molekül ağırlığı floresan peptid sensör destekli, matris Lazer Desorpsiyon-İyonizasyon, kampüs kimyasal enstrüman merkezi kütle spektrometresi ve proteomik desteğiyle uçuş saat (MALDI-TOF) kütle spektrometresi kullanılarak ölçüldü Ohio Eyalet Üniversitesi'nde tesis.

1. hidrojel bileşenleri hazırlık
<ol><li>Floresan proteaz parçalanabilir peptidler açıklandığı gibi başka bir yerde kullanmak floresein floresan molekül olarak ve dabcyl içki olarak8, sentez. DMSO içinde peptid için 10 mM bir konsantrasyon ve tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek için küçük (~ 30 µL) aliquots-80 ° C dondurucuya deposunda geçiyoruz. Not: Bu peptidler de ticari olarak satın alınabilir. Bu iletişim kuralı bir C-terminal sistein hidrojel polimer ağ içine kovalent birleşme etkinleştirmek için peptid sırayla gerektirir.</li>
	<li>8 kolu 40 kDa poli (etilen glikol) Amin (PEG) hazırlamak-norbornene (NB) olarak açıklanan17. Son grup functionalization, %90 1H NMR kullanarak daha fazla doğrulayın. PEG-NB steril fosfat tampon serum (PBS) % 25 w/v ve-80 ° C (~ 300 µL) aliquots dondurucuya deposunda geçiyoruz. Not: PEG ile functionalized norbornene da ticari olarak satın alınabilir.</li>
	<li>Fotoğraf-Başlatıcı Lityum fenil 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) başka bir yerde18açıklandığı gibi sentez. 68 mM bir konsantrasyon için steril su kucağına dağıtılması ve (~ 300 µL) aliquots-80 ° C dondurucuda saklayın. Not: Alternatif olarak, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) fotoğraf-başlatıcı olarak kullanılabilir. Tur ve Irgacure ticari olarak satın alınabilir.</li>
	<li>MMP-parçalanabilir peptid crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) ve 100 mM ve 200 mM bir konsantrasyon için steril su hücre adezyon peptid (CRGDS) sırasıyla dağıtılması ve onları (~ 300 µL ve ~ 30 µL)-80 ° C dondurucuda saklayın aliquots, anılan sıraya göre.</li>
</ol>2. tahlil medyası hazırlama
<ol><li>Isı inaktive hazırlamak, kömür fetal Sığır serum (FBS) MMP tahlil için elimden alındı: Not: FBS proteaz MMP tahlil ile yüksek arka plan sinyali üretebilir; Bu nedenle, bu ısı devre dışı bırakın ve kömür önerilir FBS tahlil medya için şerit.<ol>
<li>FBS 100 mL 55 ° C'de 30 dk için Isıtma tarafından devre dışı Not: FBS 100 mL aliquoting ve -20 ° c ileride kullanmak üzere saklamak için burada kullanılmıştır. Daha küçük birimler gerektiğinde kullanılabilir.</li>
		<li>% 0,25 w/v, aktif kömür ve % 0,025 w/v dextran, FBS (yaklaşık 5 mL) küçük bir miktar için ekleyin ve karıştırın kadar bir bulamaç oluşturulur. O zaman, FBS geri kalanını ekleyin ve 55 ° C'de 30 dakika karıştırın</li>
		<li>4 ° C'de 20 dk için 1,962 x g , santrifüj Ardından süpernatant için başka bir gemi aktarın.</li>
		<li>2.1.2 adımı yineleyin ama 37 ° C'de 2.1.3 adım gelir. 0,45 µm filtre ve daha sonra bir 0.2 µm filtresi kullanarak süpernatant sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tahlil ortam hazırlamak % 1 kömür ile desteklenen medya kullanarak FBS, 2 mM L-glutamin, 10 U/mL penisilin, 10 µg/mL streptomisin çıkardı. Not: daha az floresans girişim olduğundan medya fenol red olmadan önerilir. İnsülin, büyüme faktörleri, gibi tahlil medya diğer eklemeler vb. absorbans sürece ekledi ve floresan spektrum dorukları sensör (494 nm/521 nm) ile örtüşmesi değil.</li>
	<li>Seyreltik bakteriyel collagenase enzim yazın ben 10 ve 1000 µg/mL tahlil medya, olumlu bir denetim olarak.</li>
</ol>3. hidrojel hazırlık ve hücre kapsülleme
<ol><li>Hidrojel öncü çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Reaktifler aşağıdaki sırada 1.5 mL Tüp, vortexing sonra her bileşenin eklenmesi için Ekle: 20 mM 8 kol 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-parçalanabilir peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM Tur ve 0,25 mM fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid. Not: Tablo 1 gösterir hidrojel öncü çözüm içeriğini, hisse senedi konsantrasyonları, çalışma konsantrasyonları, hacim hesaplama formülleri ve gerekli birimler gerekli yapmak yeterli hidrojel öncü çözüm 120 µL yapmak bir 10 hydrogels ile denemeler yapın. Pipetting nedeniyle hidrojel çözüm kaybı hesaba katan, toplam hacim % 20 artırmak. Ticari peptidler kez bir asidik hidroklorik asit çözümde sağlanır; Bu nedenle, NaOH 7 son pH elde etmek için eklenir. nihai çözüm pH Kullanıcı tarafından onaylanması.</li>
		<li>Hidrojel öncü çözüm birden fazla 1,5 mL tüpler içine bölmek Sınanan koşul başına bir tüp. Not: hydrogels hücreleri ilavesi hazırlanır birkaç denetim koşulları önerilmektedir. Hiçbir tedavi koşul varsa bir negatif kontrol için fluorogenic sensörü, non-spesifik bozulması için hesabınıza hidrojel bir şartım araç kontrol veya yalnız deneysel medya ile inkübe. Olumlu bir denetim ve kalibrasyon deneyler arasında hydrogels fluorogenic sensör ayırmak için bilinen bir proteaz ile inkübe. Örneğin, iki bakteriyel collagenase konsantrasyonları burada kullanılmıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydrogels hücrelerde kapsüller.<ol>
<li>Kullanılan hücre tipi için uygun bir tek hücre süspansiyon hazırlamak. Örneğin, A375 Melanom hücreleri bir 10 cm çanak PBS 10 mL ile yıkayın. Hücrelerin % 0.05 tripsin kullanarak trypsinize ve 37 ° C ve % 5 CO2 3 dk. Toplam cep numarasını belirlemek için bir hemasitometre ile hücreleri hesaplama için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücre çözümü vasıl 314 x g 3 dk santrifüj kapasitesi, Kültür medya Aspire edin, sonra PBS hücrelerde yaklaşık üç kez en yüksek gerekli tohumlama yoğunluğu deneme için yeniden askıya alma. Örneğin, bir hücre süspansiyon 21 x 106 hücre yoğunluğu ile 7 x 106 hücre/mL son kapsüllenmiş yoğunluğu elde etmek için burada kullanılmıştır.</li>
		<li>Yeniden bir doğru hücre konsantrasyonu sağlamak için hücreleri saymak.</li>
		<li>Askıya alınan hücreler ve PBS hidrojel öncü çözüm gerekli tohumlama yoğunluğu (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ve 7 x 106 hücre/mL Bu örnekte) göre her tüpün ekleyin. PBS koşullar hiçbir hücreler yerine askıya alınan hücreleri ekleyin. Not: Tüm koşulları hidrojel bileşenleri arasındaki oran sağlamak için aynı son hidrojel öncü çözüm cilt olmalı ve PBS sabittir. Değil bu hücreleri içlerindeki var, yukarı ve aşağı şiddetle öncü çözüm mix için kabarcıklar oluşturmadan pipet girdap tüpleri var.</li>
		<li>Steril bir siyah alt 96-şey plaka dağıtımı sırasında belgili tanımlık uç her şey ortasında ortalanır sağlanması, yuvarlak içine 10 µL hidrojel öncü çözüm dağıtmak.</li>
		<li>Hidrojel öncü çözüm ultra violet (UV) ışık 4 mW/cm2 3 dk plakasına açarak polimerize. Not: UV lambası (UVL-56 el UV lambası, UVP, yayla, CA) uzun bir UV dalga boyu, UV-A ışık üretir (365 nm), hangi hücresel canlılığı etkilemez.</li>
		<li>Pozitif kontrol koşul olmadan kapsüllenmiş hücreleri dışında bütün wells için 150 µL tahlil medya ekleyin. Pozitif denetimlere 150 µL collagenase enzim çözüm ekleyin.</li>
		<li>PBS 150 µL dış Kuyu yapımı kuluçka sırasında buharlaşma azaltmak için plaka ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MMP ve metabolik aktivite ölçüm
<ol><li>Ölçmek floresans hemen sonrası kapsülleme temel floresans ölçüm kurmak ve hidrojel polimerizasyon tekdüzelik sağlamak için. Bir Floresan Mikroplaka kullanarak plaka okumak okuyucu bir alana sahip bir opak 96-şey plaka protokolü kullanan 494 nm/521 nm (uyarma/emisyon) ayarında inceden inceye gözden geçirmek. Bu-ecek var olmak 0 h okudu.</li>
	<li>18 h için oksijen bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 plaka kuluçkaya.</li>
	<li>1:10 (v/v) her şey için metabolik aktivite reaktif (resazurin) ekleyin.</li>
	<li>Bir ek 6 h için oksijen bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 plaka kuluçkaya. Not: Bu kuluçka zaman hücre türüne bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>24 saat sonrası kapsülleme, floresans ölçmek. Bir Floresan Mikroplaka kullanarak plaka okumak okuyucu bir alana sahip bir opak 96-şey plaka protokolü kullanan ayarı 494 nm/521 nm (uyarma/emisyon) MMP etkinliği için ve 560 nm/590 nm (uyarma/emisyon) metabolik aktivite için tarayın.</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Physiological+Events+in+2D+vs.+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halfway+between+2D+and+Animal+Models%3A+Are+3D+Cultures+the+Ideal+Tool+to+Study+Cancer-Microenvironment+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li>
<li>Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytically+Degradable+Hydrogels+with+a+Fluorogenic+Substrate+for+Studies+of+Cellular+Proteolytic+Activity+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration.</a> Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Chalasani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Protease+Activity%3A+Assays+to+Screen+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches.</a> Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protease+Activity+in+Living+Cells%3A+From+Two+Dimensions+to+Four+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions.</a> Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).</li>
<li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinases+in+Non-Neoplastic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).</li>
<li>Visse, R., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%3A+structure%2C+function%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry.</a> Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).</li>
<li>Vihinen, P., Kähäri, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+cancer%3A+Prognostic+markers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets.</a> International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).</li>
<li>Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydrocurcumin+inhibits+HT1080+cell+migration+and+invasion+via.+downregulation+of+MMPs+and+uPA1%5BTitle%5D)+AND+%22APHS+Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1.</a> APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).</li>
<li>Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin%2C+demethoxycurcumin+and+bisdemethoxycurcumin+differentially+inhibit+cancer+cell+invasion+through+the+down-regulation+of+MMPs+and+uPA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).</li>
<li>Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+High-Throughput+Cell+Encapsulation+Platform+to+Study+Changes+in+Cell-Matrix+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).</li>
<li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+tethered+TGF-%CE%B21+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li>
<li>Sridhar, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cellularly+degradable+PEG+hydrogel+to+promote+articular+cartilage+extracellular+matrix+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%27+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+Validation+in+High+Throughput+Screening+-+from+Concept+to+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application.</a> Drug Discovery and Development. , (2015).</li>
<li>Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIversen%2C+PW+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).</li>
<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

3D in vitro hücre kültürü içinde vivo ortamda birçok önemli yönleri beyannamedir. Ancak, 3D kültür de değerlendirilmesi hücre fonksiyonu yapar ve zorlu sinyal, gibi birçok biyolojik deneyleri hücresel alma ve çok sayıda hücre gerektirir. Bu nedenle, geliştirme daha fazla örnek olmadan hücresel fonksiyonunun ölçüm sağlar basit 3D kültür sisteminin işleme büyük ölçüde yardımcı programı 3D kültür sistemleri artış olacaktır. Burada açıklanan 3D sistem çeşitli farklı uygulamalar için adapte edilebilir. Fluorogenic sensör sıra...

Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri genellikle daha yakından vivo içinde hücresel yanıt-e doğru geleneksel iki boyutlu (2D) kültür sistemleri daha özetlemek, birkaç mükemmel yayınlar1,2,3 ' e bakın . Ancak, hücre işlevi ölçmek için 3D kültür sistemleri kullanan hücresel alma zorluğu nedeniyle zorlu ve daha fazla işleme örnek. Bu zorluk çok hücresel işlevler ölçümü 3D kültür sistemlerinde sınırlar. Bu zorluk üstesinden gelmek için yeni teknikler 3D ortamlar içinde hücre işlevinin kolay ölçüm etkinleştirmek ihtiyaç vardır. Bu gereksinimi karşılamak için bir yol sadece 3D hücre kültürü destekleyen ama ayrıca hücre işlevi ölçmek için sensörler dahil malzeme gelişmedir. Örneğin, birkaç hidrojel sistemleri görselleştirme 3D ortamlarda4,5,6,7içinde proteaz aktivitesinin etkinleştirmek için fluorogenic proteaz yarilabilir moieties dahil. Bu sistemler aslında mikroskobik görüntüleme için kullanılmıştır iken, bu sistemler de facile sicakligi ölçümü için bir hücre işlevi bir 3D etkinleştirme bir çift plaka okuyucu kullanarak bir küresel matriks metalloproteinaz (MMP) faaliyet tahlil kullanmak için adapte edilebilir çevre8.
MMPs, çinko proteaz, süper normal doku homeostazı ve birçok hastalığın önemli rol oynarlar. MMPs bozulmasına yol açar ve hücre dışı matriks (ECM) yeni model, hücre yüzey reseptörlerinin ve sitokinler ayırmak ve diğer MMPs9,10harekete geçirmek. MMPs yara iyileşmesi gibi fizyolojik süreçleri ve artrit, ateroskleroz, Alzheimer ve kanser ( 9,10,11değerlendirmeleri görmek) gibi hastalıkların önemli rol oynarlar. Kanser, MMP ifade düzeyi yüksek güçlü kanser metastaz ve kötü prognoz12ile ilişkili. Ayrıca, MMPs kanser hücre işgali ve geçiş, doğal olarak 3D olayları13,14hücresel süreçler teşvik ederek tümör ilerleme katkıda bulunur. Bu nedenle, temel biyolojik çalışmalar ve ilaç deneyleri eleme de dahil olmak üzere birçok bağlamlarda 3D kültür etkinliğinde MMP ölçmek için yeteneği çok fazla ilgi yoktur.
PEG hydrogels yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü onların yüksek su içeriği nedeniyle, protein adsorpsiyon ve akort doğa karşı dayanıklılık için. PEG hydrogels moieties için doğrudan hücre işlevi, bir sayı ile gibi ECM mimetic peptidler RGD, RLD ve IKVAV hücre adezyon kolaylaştırmak veya dönüştürme büyüme faktörü-β (TGF-β) gibi büyüme faktörlerinin hayvan zinciri yolu tarif etmek gibi ile functionalized 15,16. Daha yakın zamanlarda, PEG hydrogels hücre işlevinin ölçüyü iyi5,8etkinleştirmek sensör peptidler ile functionalized. Özellikle, PEG hidrojel sisteminin kullanımı bir fluorogenic bir çift plaka okuyucu ile 3D kültürlerde hücresel MMP aktivitesinin MMP-parçalanabilir etkin peptid ölçüm ile functionalized ve hiçbir daha fazla işlem gerekli. Bu sistemler aynı zamanda hücresel işlev, metabolik aktivite de dahil olmak üzere diğer ölçümleri ile uyumludur. Burada, bir protokol MMP etkinliği bir 3D PEG hidrojel fluorogenic MMP-parçalanabilir peptid ile functionalized ve bunların kullanımı için gerekli ilk optimizasyonu deneyler gösteren sonuçları sunulan kültürlü hücre ölçümü için anlatılan tahlil. İnsan Melanom hücreleri (A375) fluorogenic hydrogels bir dizi tahlil çalışma sınırları içindeki uygun tohumlama yoğunluğunu belirlemek için yoğunlukları tohum üzerinde kapsüllü. Kapsüllemenin 24 saat sonra MMP ve metabolik aktivite bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanan ölçüldü. Daha sonra MMP etkinliği tahlil doğrusal Aralık içinde tohum yoğunluğunu belirlemek için metabolik aktivite için normalleştirilmiş. Son olarak, değişim yüzdeleri (% CV) katsayısı içi-plaka triplicates arasında elde edilen sonuçları tekrarlanabilirlik yansıtmak için hesaplanan. Bu yöntem basit ve hızlı 3D hücre kültürü ve proteaz aktivitesinin en az örnek işleme ile kolay ölçüm sağlar.

<table><tbody><tr><td>1X Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Aktif kömür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3345</td><td></td></tr><tr><td>Siyah yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plaka</td><td>Brand-Tech</td><td>89093-600</td><td></td></tr><tr><td>Hücre yapışma peptidi (CRGDS)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td>özel yapım</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz enzimi tip I&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikoz Ortamı</td><td>İnvitrojen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)&nbsp;</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroplaka okuyucu ve nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Cytation 3</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MMP-bozunur peptit çapraz bağlayıcı (KCGPQG & darr; IWGQCK)</td><td>GenScript ABD Inc.</td><td>ısmarlama</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318500</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin (Alamar Mavisi)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>UV ışığı ve nbsp;</td><td>UVP</td><td>95-0006-02</td><td></td></tr></tbody></table>

küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3d hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Üç boyutlu (3D) hücre kültür sistemleri genellikle daha yakından vivo içinde hücresel yanıt ve işlevleri geleneksel iki boyutlu (2D) kültür sistemleri özetlemek. Ancak, hücre işlevi 3D kültür ölçümü kez daha zordur. Birçok biyolojik deneyleri 3D kültürlerde zor olabilir hücresel malzeme alınmasını gerektirir. Bu sorun adrese bir ölçüm-in malzeme içinde hücre işlevi etkinleştirmek yeni malzemeleri geliştirmek için yoludur. Burada, ölçüm hücresel matriks metalloproteinaz (MMP) faaliyet bir 96-iyi biçimde 3D hydrogels için bir yöntem sunulur. Bu sistemde, bir poly(ethylene glycol) (PEG) hidrojel fluorogenic MMP yarilabilir sensörü ile functionalized. Hücresel MMP hareketlilik floresan yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve bir standart Mikroplaka Okuyucu ile ölçülebilir. Bu testin bir 96-şey biçimine minyatür deneysel kurmak için koşul tahlil önceki 24-iyi sürümü ile karşılaştırıldığında başına 80 oranında % 50 ve reaktif kullanımını gerekli zaman azaltılmış. Bu tahlil da hücresel fonksiyon diğer ölçümleri ile uyumludur. Örneğin, bir metabolik aktivite assay burada, aynı anda MMP etkinlik ölçüleri içinde aynı hidrojel ile yürütülen gösterilmiştir. Tahlil yoğunlukları testin çalışma aralığı için uygun kapsülleme yoğunluğu belirlemek için tohum hücre aralığı boyunca saklanmış insan Melanom hücreleri ile gösterilmiştir. Hücre kapsüllemenin 24 saat sonra MMP ve metabolik aktivite dökümanları yoğunluğu tohum hücreye orantılı idi. Tahlil burada bir fluorogenic parçalanabilir substrat ile gösterdi, tahlil ve metodoloji çok çeşitli hidrojel sistemleri ve Diğer Floresan sensörler için adapte olabilir. Bu tür bir tahlil bir pratik, verimli ve kolay erişilebilir 3D kodlamayla platform için geniş bir uygulama yelpazesi sağlar.

Geçerli tahlil daha önce gelişmiş ve karakterize 3D hidrojel kültür sisteminden bir fluorogenic MMP yarilabilir sensör8ile functionalized uyarlanmıştır. Burada kullanılan fluorogenic MMP sensör GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C bir peptit dizisi oluşur (↓ gösterir bölünme sitesi) Bu daha önce en iyi duruma getirilmiş bölünme için MMP-14 ve MMP-1119tarafından. Peptid floresan molekül (fluoresein) ve bölünme sitesi (Şekil ...

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

3D kültür, standart biyolojik tahliller kullanarak hücresel fonksiyonu ölçmeyi daha da zorlaştırır. Bu protokol, floresan sensör ve standart bir mikroplaka okuyucu kullanarak, daha fazla numune işleme olmadan hücresel ve somatik aktivitenin ölçülmesini sağlar. Bu protokol, yüksek iş kadar uyuşturucu taraması da dahil olmak üzere bir dizi yeni uygulama sağlar.Ayrıca, floresan sensör diğer proteazlar veya hücre fonksiyonlarını ölçmek için farklı bir sensör ile değiştirilebilir. Deneyi önceden dikkatlice planlamak, hidrojel hazırlığı için tüm hesaplamaları tamamlamak ve hücrelerin askıya alındığı zamanı en aza indirmek için tüm ekipmanları ve reaktifleri kurmak önemlidir. Başlamak için, % 1 kömür soyulmuş Fetal Sığır Serum, iki mM L-glutamin, penisilin mL başına 10 adet ve streptomisin mL başına 10 mikrogram ile tahkikat medya hazırlamak.Daha fazla floresan paraziti olan fenol kırmızısı ortam kullanmayın. Pozitif kontroller yapmak için, mL başına 10 ve 1000 mikrogram konsantrasyonlarda istibak ortamına bakteriyel kollajenaz enzim tipi bir ekleyin. Daha sonra, 1,5 mL'lik bir tüpe reaktifler ekleyerek hidrojel öncül çözeltisini hazırlayın.Her bileşenin eklenmesinden sonra girdap emin olun. Daha sonra farklı koşullar için çözeltiyi birden fazla 1,5 mL tüpe bölün. Hidrojellerde hücreleri kapsüllemek için, ilk PBS 10 mL ile A375 melanom hücrelerinin 10 cm çanak yıkayarak tek bir hücre süspansiyon hazırlamak.Daha sonra, hücreleri trypsinize için, çanak% 0.05 tripsin ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit, üç dakika boyunca çanak kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücreleri hemositometre ile sayın.Daha sonra hücre çözeltisini 314 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Kültür ortamını aspire edin ve PBS tamponundaki hücreleri son kapsüllenmiş yoğunluğun yaklaşık üç katı kadar yeniden askıya alın. Doğru bir hücre konsantrasyonu sağlamak için hücreleri tekrar sayın.Daha sonra, gerekli tohumlama yoğunluğuna göre hidrojel öncül çözeltisinin her tüpüne PBS'deki askıda hücreleri ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Kontrollü koşullar için yalnızca PBS ve girdap ekleyin. Sonra, pipet 10 mikrolitre hidrojel öncül çözeltisi steril, siyah, yuvarlak dipli 96 kuyu plakaher kuyunun ortasına.Hidrojellerin kuyuların yerleşimini görsel olarak inceleyin. Merkezsiz hidrojeller polimerizasyondan önce pipet ucu kullanılarak yeniden konumlandırılabilir. Hidrojel öncül çözeltisini polimerize etmek için plakayı santimetre kare başına 4 miliwatt'lık uv ışığına üç dakika boyunca maruz bırakın.Daha sonra, kapsüllü hücreler içeren tüm kuyulara 150 mikrolitre ispon media ve pozitif kontrol kuyularına kollajenaz enzim çözeltisinin 150 mikrolitresini ekleyin. Kuluçka sırasında buharlaşmayı azaltmak için plakanın dış kuyularına 150 mikrolitre PBS tampon ekleyin. Plakanın floresan yoğunluğunu sıfır saatte ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın, hemen kapsülleme sonrası.494 nanometre uyarma ve 521 nanometre emisyon dalga boylarında opak 96 kuyu plaka protokolünü seçin. Sonra, plakayı 37 derecede %5 karbondioksitle 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra tüm koşullar ve kontroller için iyi başına hacim oranı bir ila 10 hacim metabolik aktivite reaktifler ekleyin.Plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit, altı saat boyunca kuluçkaya yatırın. Son olarak, 24 saat, kapsülleme sonrası plaka floresan yoğunluğunu ölçün. MMP aktivitesi için 494 nanometre uyarma ve 521 nanometre emisyon dalga boyları ile opak 96 kuyu plaka protokolünü seçin.Metabolik aktiviteyi ölçmek için 560 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon dalga boylarını seçin. Bu çalışmada florojenik sensörün uygun proteaza maruz kalmasından sonra, sorgulayıcı ve florofor ayrılır ve floresan artar. Bakteriyel kollajenaz enzim tipi bir ile kuluçkahidrojellerin floresan ölçümleri, en düşük tespit edilen sinyalnegatif kontroller tarafından üretilen olduğunu göstermektedir, hiçbir kollajenaz ile.Tespit edilen en yüksek sinyal, sinyal platoya başladığında, kollajenaz ın mL başına 1000 mikrogram veya üzeri ile üretilirken. Hesaplanan çalışma aralığı kollajenazmın mL başına yaklaşık 0,16 ila 474 mikrogram arasındaydı. A375 melanom hücre hattı için floresan okumaları, kapsülleme hemen sonra yoğunlukları bir dizi kapsüllenmiş, tohumlama yoğunlukları arasında düşük, ve beklendiği gibi hücreleri olmadan kontrol jelleri benzer.Kapsüllemeden 24 saat sonra, MMP aktivitesi tohumlama yoğunluğu ile doğru orantılıydı ve mL başına 1 milyon hücreden fazla veya daha fazla tohumlama yoğunluğu çalışma aralığının sınırları içinde yer almaktadır. A375 hücre hattının metabolik aktivite ölçümleri de hücre tohumlama yoğunluğu ile doğru orantılıydı. MMP aktivitesini metabolik aktiviteye normalleştirerek, mL başına 2 milyon hücreden fazla tohumlama yoğunluklarında hücre başına MMP aktivitesinde anlamlı bir fark yoktu.Uygun pipetleme teknikleri önemlidir. Bu viskoz çözümlerin doğru hacimleri elde etmek için önceden ıslatma ipuçları içerir. Ayrıca, kuyu içinde hidrojel öncül çözüm merkezleme, plaka okuyucu tarafından doğru ölçümler elde etmek için önemlidir.Burada ölçülen MMP etkinliğine katkıda bulunan belirli MDP'leri tanımlamak için western blot veya PCR gibi ifade denemeleri kullanılabilir. Canlı hücrelerin kullanımı uygun biyogüvenlik prosedürü, aseptik teknik ve biyolojik güvenlik kabinesi gerektirir. UV ışığı tehlikelidir, kullanıcıyı korumak için bir kalkan kullanın ve doğrudan ışığa bakmayın.

measuring-global-cellular-matrix-metalloproteinase-metabolic-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz invadopodia aracılı matriks yıkımı görselleştirmek için floresan jelatin kaplı mikroskop lamelleri üretmek için prototip yöntem açıklanmaktadır. Mevcut yazılımını kullanarak hesaplama teknikleri karışık bir popülasyon içindeki ve bütün mikroskobik alanı kapsayan çok hücreli grupları için tek hücreler ile matris proteolizin sonuç seviyeleri ölçülmesi için sunulmuştur.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Bu videoda, hücre dışı matris sertliğine bağlı Listeria monocytogenes'in endotel hücreleri yoluyla yayılımını değerlendirmek için kantitatif hızlandırılmış mikroskopi gösterilmektedir. Daha yumuşak bir hidrojel, daha sert muadillerine kıyasla endotel hücreleri yoluyla daha hızlı bakteri yayılımını kolaylaştırır ve matris sertliğinin bakteri yayılımı üzerindeki etkisini vurgular.

Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Öğrenin, PEG hidrojellerde hücreleri kapsülleyerek matriks metalloproteinaz ve metabolik aktiviteyi floresan sensörle nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem yüksek verimli ilçe taraması için uygundur.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Daha fazla video keşfet