İnşaat ve in Vitro mezenkimal kök/Stromal hücrelerdeki Osteojenik farklılaşma güçlendirmeye yönelik bir elektriksel stimülasyon odası kullanımı

Burada, ortak altı duvar kültürü plakaları kullanarak bir elektrik stimülasyon odası oluşturmak için nasıl göstermek, ve nasıl mezenkimal kök hücrelerde osteojenik farklılaşma teşvik etmek için kullanmak. Bu oda kolay ve inşa etmek pahalı değil, ve birden fazla deneyde yeniden kullanılabilir. Odamızda elektriksel stimülasyon ile ön tedavi edildikten sonra, mezenkimal kök hücreler kemik dokusu mühendisliği tedavilerinde sonuçları iyileştirmek için kullanılabilir.

Bu oda aynı zamanda göç, proliferasyon, membran potansiyelindeki değişiklikler, apoptoz ve dikkatli eki gibi diğer hücre tiplerini ve elektro-duyarlı hücre davranışlarını araştırmak için de kullanılabilir. Altı kuyu plakalı bir kapakta, işaretleyin ve sonra iki adet milimetre çapında delik açın, 25 milimetre arayla, altı kuyunun her birinin dış kenarına yakın. Sonra, 12 beş santimetre uzunluğunda bölümler halinde platin bir tel kesti.

Her beş santimetrelik bölümü el ile L" şeklinde bükün, bir ucunu üç santimetre, diğer iki santimetre uzunluğunda bırakarak. Daha sonra gümüş kaplı teli 35 santimetre uzunluğunda iki şekilde kesin. Platin telin uzun bükülmüş ucunu delinmiş deliğe takın ve kapağın dışından 1-2 milimetre çıkıntılı olarak yerleştirin.

Forceps kullanarak bükün. Daha sonra, kapak deliklerindeki platin telleri süper iletken tutkalla sabitleyin ve yaklaşık altı saat kurumaya bırakın. Katotları hazırlamak için, kapaktan gümüş kaplı tellere çıkıntılı altı platin telin uçlarını lehim.

Anodları hazırlamak için, diğer gümüş kaplı teller için kalan altı platin teller lehim. Daha sonra, işlevselliği onaylamak için altı anot-katot platin-elektrot çiftleri arasında devre LED'ler ekleyin. Kültür plakalarıdaki hücrelerin LED ışığına maruz kalmamasını önlemek için her LED'in altına bir parça siyah yalıtım bandı yerleştirin.

Daha sonra, tel terminal bloğu konektörünü altı kuyulu plaka kapağının sol üst köşesine yapıştırın ve her iki gümüş kaplı kabloyu giriş terminallerine bağlayın. Daha sonra, ikinci bir altı kuyuplaka kapağının sol üst köşesinden 20 milimetre karelik bir keserek, ilk kapaktaki terminal blok konektörünü yerleştirmek için. Elektrotlarla donatılmış ilk kapağı, ikinci kapağı nı kapatın ve yapıştırıcı bantla birlikte bantlayın.

İki standart yalıtımlı bakır telin bir ucunu tel konektörün çıkış terminallerine, diğer ucunu da muz erkek konektörlerine bağlayın. Ön paneldeki A-OFF düğmesine basarak güç kaynağını açın. Birinci düğmeye basarak kanal bir'i etkinleştirin.

Daha sonra, voltajı ayarlamak için 4. Yük çıkışını 2,5 volt olarak ayarlayın. Ardından Enter tuşuna basın.

Hücrelerin E sapı ile tedavi edildikleri gün, elektrotları %70 etanol çözeltisinde 30 dakika sterilize edin. Daha sonra, ek bir 30 dakika boyunca bir güvenlik kabininde UV ışığı altında kurulayın. Laminar akış kaputunda, elektrotlarla donatılmış kapakla donatılmış kültürlü MSC'leri içeren altı kuyulu plakayı kaplayın ve elektrotların tamamen ortama batırDığından emin olun.

Daha sonra, kapalı altı kuyulu plakayı hücrelerle birlikte kuvöze aktarın ve kablolarını güç kaynağına bağlayın. Daha sonra, güç kaynağını 2,5 volt yük çıkışına ayarlayın ve hücreleri E sapı ile bir saat tedavi edin. Stimülasyondan sonra güç kaynağını çıkarın ve E kök odasını kuvözden çıkarın.

Steril koşullarda, elektrotlarla donatılmış kapağı standart altı kuyulu plaka kapağıyla değiştirin. Daha sonra, kuvöz hücreleri geri ve gece boyunca bırakın. Elektrotları önce PBS ile, sonra %70 etanol çözeltisi ile temizleyin.

Daha sonra elektrot yüzeyindeki birikmiş korozyon ürünlerini ince zımpara kağıdı ile temizleyin. E kök tedavisini altı gün üst üste tekrarlayın. Dördüncü gün, elektriksel stimülasyon uygulamadan önce, ve steril koşullar altında, 1,5 mililitre orta spispirating ve önceden ısıtılmış, taze osteojenik farklılaşma ortamı 1,5 mililitre ile değiştirerek kültür ortamı değiştirin.

Yedi gün üst üste elektrikstimülasyon uyguladıktan sonra, ek bir yedi gün boyunca kültür hücreleri korumak, her üç ila dört gün orta alışverişi. Tedavi tamamlandığında, hücre morfolojisi değişikliklerini mikroskop altında analiz edin. MsC osteojenik farklılaşma üzerinde elektriksel stimülasyon etkisini değerlendirmek için, kalsiyum birikimi ölçmek, alkali fosfataz aktivitesi, ve osteojenik marker gen ekspresyonu, başka bir yerde açıklandığı gibi.

MsC osteojenik farklılaşma üzerinde elektriksel stimülasyon milimetre başına 100 milivolt etkisini değerlendirmek için, üç, yedi ve 14 gün boyunca elektriksel stimülasyon ile tedavi hücreleri ve tedavi edilmeyen hücreler, morfolojik değişiklikler ve kalsiyum birikimi değerlendirilerek kültürün 14. Yedi ve 14 gün boyunca elektriksel stimülasyon ile tedavi edilen hücrelerde hücre morfolojisi ve kalsiyum birikintilerinde önemli değişiklikler görüldü. Osteojenik marker gen ekspresyonu değişikliklerinin detaylı bir analizi kültürün üçüncü, yedi ve 14.

Kültürün yedinci gününde, RunX2 ekspresyonu yedi gün boyunca elektriksel uyarılma ile tedavi edilen hücrelerde anlamlı olarak daha yüksekti. Colla1 ekspresyonu yedi gün boyunca tedavi edilen hücrelerde anlamlı olarak daha yüksekti, kültürün 14. Osteopontin ekspresyonu, kültürün üçüncü, yedi ve 14.

Osterix ekspresyonu her zaman kontrol hücrelerinde yoktu ve elektriksel uyarılmaya maruz kalan hücrelerde sadece yedi ve 14 günlük kültürde görüldü. Elektrikstimülasyon odası nın inşası nispeten kolaydır. Ancak platin telleri kullanırken ve elektrotları temizlerken ve sterilize ederken özel özen izlenmelidir.

Odamızda elektriğe önceden işlenmiş hücreler, tek başına veya bir iskele malzemesinin üzerine oturtulur, elektriksel stimülasyonun olumlu etkisinin in vitro olarak nasıl devam ettiğini incelemek için hayvan modellerine yerleştirilmesi ne kadar iyi. Bu teknik, elektriksel stimülasyonun hücre fonksiyonlarını düzenleyen mekanizmayı incelemek için basit ama güçlü bir araç sağlar. Bu bilgi rejeneratif tıp hücrelerinde kullanılabilir.