Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Nötrofil ekstrasellüler tuzaklarını veya NET'leri ölçmek için yüksek iş yapma lı bir çıktı geliştirdik. NET'ler nötrofiller tarafından maruz kalan immünojenik DNA yapılarıdır. NET'ler mikroorganizmaları tuzağa düşürüp öldürebilirler ve bu nedenle önemli bir anti-enfeksiyöz mekanizmadırlar, ama aynı zamanda otoimmün hastalıklarda patojenik bir rol oynarlar.

Bu teknikle, NET oluşumu ve bozulmasını incelemek için son derece hassas ve yüksek verimli bir yöntemle sonuçlanan üç boyutlu immünükoper konfokal mikroskopi ile NET'ler ölçülür. Bu teknik, otoimmün hastalığı olan hastaların NET oluşumunu ölçmemizi sağlar. ANCA ilişkili vaskülit veya sistemik lupus eritematozlu hastaların ex vivo NET oluşumu bu töz ile izlenebilir.

Buna ek olarak, NET oluşumunu hedefleyen potansiyel terapötikler bu test in vitro ile test edilebilir. Nötrofil izolasyonu daha önce bu tekniği hiç gerçekleştirmemiş insanlar için bir mücadele olabilir. Bu işlem başlamak için, iki 10 mililitre EDTA kodlu tüpler sağlıklı bir donör den periferik kan 20 mililitre elde.

Steril 50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre kan ve pbs'yi toplam hacmi 32,5 mililitreye aktarın. 10 mililitrelik pipet ve pipet denetleyicisi kullanarak 14 mililitre yoğunluk degradesi alın. Pipeti 50 mililitrelik tüpün dibine yerleştirin.

Daha sonra pipet denetleyicisini pipetten alın ve ağırlık degradesinin kılcal etkiyle maksimuma ulaşana kadar yerçekimi tarafından dışarı akmasını bekleyin. Kalan yoğunluk gradyanının dışarı sızmasını önlemek için pipetin üstüne bir başparmak yerleştirin ve pipeti tüpten çıkarın. Tüpü 912 kez g oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hızlanma veya fren olmadan santrifüj edin.

Dikkatle periferik kan mononükleer hücreleri içeren beyaz halka ilk kaldırmak, PBS seyreltilmiş plazma izledi. Son olarak, yoğunluk gradyan katmanını mümkün olduğunca çıkarın. Daha sonra, bir şişe soğuk steril distile su ve buzdolabından 10x konsantre PBS bir şişe almak.

Hızlı çalışma, pelet üzerine doğrudan su 36 mililitre ekleyin ve dikkatlice bir kez karıştırın. Başlangıçtan itibaren sayılan 20 saniye sonra, izotonik bir çözüm yapmak için dört mililitre 10x PBS ekleyin. Ve tekrar, bir kez dikkatle karıştırın.

Tüpü 739 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Pellet katı olmadığı için son derece dikkatli olun ve daha önce açıklandığı gibi soğuk steril distile su ve konsantre PBS ekleme işlemini hızlı bir şekilde tekrarlayın, supernatant atın. Santrifüj 328 kez g ve dört santigrat derece beş dakika.

Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve peleti beş mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Nötrofilleri say ve onları buzda tut. İlk olarak, 15 mililitrelik bir tüp pbs iki mililitre yaklaşık 10 ila 20 milyon nötrofil içeren bir nötrofil süspansiyon olun.

Farklı bir 15 mililitrelik tüp, iki mililitre PBS iki mikromolar kırmızı floresan hücre bağlayıcı dört mikrolitre ile karıştırın. Kırmızı floresan hücre bağlayıcı çözeltisini nötrofil süspansiyonuna hafifçe ekleyin ve dikkatlice karıştırın. Karışımı ışıktan korumak için tüpü alüminyum folyoya sarın ve nötrofilleri kırmızı floresan hücre bağlayıcısıyla etiketlemek için 37 santigrat derecede tam 25 dakika kuluçkaya yatırın.

Oda sıcaklığında %10 ısı içeren RPMI 1640 ortamını 15 mililitrelik son bir hacme ekleyerek etiketlemeyi etkinleştirin ve bir kez dikkatlice karıştırın. Bundan sonra bir pelet oluşmuşsa, karışımı dikkatlice yeniden askıya alın. Beş dakika oda sıcaklığında 328 kez g tüp santrifüj.

Supernatant çıkarmadan önce, bir pelet oluşan olduğundan emin olun. Bundan sonra, oda sıcaklığında %2 FCS içeren beş mililitre kırmızı içermeyen RPMI 1640 ortamında peleti yeniden askıya alın. O zaman nötrofilleri say.

%2 FCS içeren fenol kırmızı içermeyen RPMI 1640 ortamda mililitre başına 420, 000 hücre yoğunluğunda bir hücre süspansiyon olun. Siyah 96 kuyulu, düz alt plakanın her kuyuya 90 mikrolitrede 37, 500 nötrofil ekleyin. Daha sonra, her kuyuda% 10 konsantrasyonulaşmak için triplicate seçilen uyarıcı 10 mikrolitre ekleyin.

Triplicate'de her zaman negatif bir kontrol ekleyin. İstenilen süre boyunca 37 santigrat derecede karanlıkta kuluçkaya yatarak 30 dakika ile iki, dört veya altı saat arasında değişen bir süre. Daha sonra, her kuyuda bir mikromolar son konsantrasyonulaşmak için beş mikromolar geçirimsiz DNA boyası 25 mikrolitre eklemek için gerekli geçirimsiz DNA boyahacmi hazırlamak.

Kuluçka süresinin bitiminden 15 dakika önce, her kuyuya 25 mikrolitre beş mikromolar geçirimsiz DNA boyası ekleyin. Karanlıkta 37 santigrat derecede son 15 dakika kuluçkaya devam edin. Bundan sonra, çok dikkatli bir şekilde supernatant çıkarın ve gerekirse saklayın.

% 4 paraformaldehit 100 mikrolitre ekleyin. Plakayı karanlıkta tutun ve hemen bir sonraki bölüme gidin. Ayarları yapılandırdıktan sonra Z Serisi'ni seçin.

Adım sayısı olarak 10'u seçin. Adım boyutu olarak üç mikrometre seçin. Plakayı immünfofloresans konfokal mikroskobuna yükleyin.

Çalıştır sekmesine tıklayın. Plaka adını ve açıklamasını doldurun ve depolama konumunu seçin. Elde edilmesi gereken kuyuları seçin.

Texas Red ve FITC için pozlama süresini seçin. Daha sonra, Plaka Edinme'ye tıklayın ve plaka başına yaklaşık bir saat sürecek olan satın alma başlatmaya başlayın. Bundan sonra Çözümleme Makrosu'yu seçin.

Ardından w1'i seçin ve eşik değerini seçin. Ardından, istenen piksel değerini seçin. Ve son olarak, ikinci bir Resim J penceresinde w2'yi seçin ve istenen piksel değerine sahip eşik değerini seçin.

Elektronik tablo dosyası için bir hedef seçin, çözümlemesini çalıştırın ve daha sonra günlük dosyasını kaydedin. Burada sunulan nötrofil ekstrasellüler tuzaklar ex vivo indüksiyon farklı uyaranlar üzerine değerlendirilmesi için nötrofil ekstrasellüler tuzak oluşumuyarı otomatik nicel için son derece hassas geniş uygulanabilir bir töz. NET oluşumu, her kuyudaki odak düzleminde üç mikrometre lik bir mesafeile 10 Z-yığınları üzerinde lekeli ekstrasellüler DNA'yı ölçerek üç boyutlu bir şekilde ölçülür.

Kümülatif alanı ölçerek, asur'un duyarlılığı artar. Resimdeki lekeli nötrofillerin toplam alanı, her kuyudaki odak düzleminde sadece 0,99 Pearson korelasyon katsayısı ile her kuyudaki toplam nötrofil sayısıile anlamlı olarak ilişkili olarak ölçülür. Nötrofillerde NET oluşumunun sayısallaştırılmasının temsili sonucu, görüntülenmiş nötrofil başına 10 Z-destenin üzerinde kümülatif lekeli ekstrasellüler DNA alanı olarak ifade edilir.

Anlık görüntüler daha sonra net nicelik testi alınır. AAV uyarılmış nötrofillerde uyarılmamış nötrofillerin ve NET'lerin temsili görüntüleri burada floresan etiketli nötrofiller kırmızı ve lekeli ekstrasellüler DNA ile gösterilmiştir. Nötrofiller dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır ve PKH etiketleme protokolüne uygun olarak yapılmalıdır.

Bu töz morfoloji, kinetik ve NETs bileşimi çalışma için kullanılabilir. Bu teknik, sağlık ve hastalık te Hİd'leri çalışma imkanı sağlayan başka bir yöntemdir. Trypan mavi, PKH ve PFA eldivenile ele alınmalı ve doğrudan nefes alınmamalıdır.