Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için
15 Mayıs 2019
Sunulan yöntem, Manduca Sexta larvası uygulama aracılığıyla doğal otobur hasarlı bitki dokusu oluşturur patates ayrılmış yaprakları. Bitki dokusu böcek herbivory erken tepkiler dahil altı transkripsiyon faktör homolog ifadesi için farklı teknik kullanılarak.
Bu protokol, böcek otunu ile karşılık olarak bitki gen ekspresyonunu ölçmek için aerodinamik bir yaklaşım kullanır. Petri kaplarında izole edilmiş müstakil yapraklar kullanılarak, böceklerin tekrarlanabilir gen ekspresyonu verilerine katkıda bulunan nispeten kısa istila döneminde uygulanması ve izlenmesi daha kolaydır. Bu protokol birçok bitki/böcek etkileşimine uyarlanabilir.
tüm tesis sistemlerinden temel gözlemler dikkate alınırsa. Böcek beslemenin öngörülemeyen doğası zor olabilir. Bu nedenle, düzgün sahnelenen larvalar ve sağlıklı bitkilerin güvenilir bir kaynağı başarı en iyi şansı sağlar.
Sağlıklı bitkilerin ve böceklerin nasıl görünmesi ve nasıl görünmesi gerektiğini görselleştirmek, özellikle çalışma alanında yeni araştırmacılar için en iyi sonuçları elde etmek için etkilidir. Prosedürü benimle birlikte gösteren frances Perez, meyve ve sebze laboratuvarının genetik gelişiminde moleküler biyolog olacak. Nodal yayılan doku kültürü patates bitkileri hazırlamak için, ilk en az üç ila dört düğümile eksplant malzemeden yetiştirilen Kennebec plantesiyonlar elde.
Ana sapyakın dalları kesme ve yaprak başına dal dokusu yaklaşık iki milimetre bırakarak yaprakları kaldırmak için steril bir bıçak kullanın. Gövdelerden nodal kesitleri çıkarmak ve dal yukarı işaret eden nodal transfer ortamı içeren steril doku kültür kabında nodal kesimleri düzenlemek için her düğümün yaklaşık iki milimetre yukarısını ve altında kesin. Daha sonra nodal kesimleri 24 santigrat derecede 2-3 haftalık bir büyüme ve 16 saatlik ışık, sekiz saatlik karanlık fotoğraf çekimi için bir bitki doku kültür odasına aktarın.
Böcekleri beslenmeye hazırlamak için, M.sexta'nın istenilen larva evresini elde edin ve larvanın büyüklüğüne göre uygun bir çevreleme kabının her kuyusuna bir larva aktarın. Beyaz kağıtla kaplı altı uygun büyüklüktePetri yemeği bir dizi tutma yeteneğine sahip beş sağlam tepsiler kullanarak her hasat zaman noktası için yerleştirme şablonları olun. Her tepsideki kağıt üzerinde uygun büyüklükteki Petri kabını kullanarak altı daireden oluşan bir setiz ve a, b ve c ve diğer istila edilmiş A, B ve C.'yi kontrol eden bir daire kümesini etiketleyin ve her yerleşim şablonuna uygun hasat süresiyle etiketleyin.
Daha sonra, uygun pertürbation, bitki çoğaltma mektubu ve hasat zaman noktası tanımlamak için yerleştirme şablonundaki her daire için bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp etiket. Tüm tüpler etiketlendiğinde, şablon başına bir Petri kabına steril filtre kağıdı disk yerleştirin ve her kapta fazla sıvı havuzuna izin vermeden diskleri steril suyla nemlendirin. Sonra her yerleşim şablonunda her daire içine bir çanak yerleştirin ve her yerleşim şablonu yanında aynı yaş ve göreceli boyutta üç patates bitkileri yerleştirin.
Istilayı başlatmak için, her bitkiden en üstteki iki boy eşleşen yaprakları çıkarmak için steril makas kullanın ve her bitki için en kısa sürede bir yaprağı kontrol Petri kabına ve bir yaprağı da istila edilmiş Petri kabına yerleştirin. Tüm yapraklar yerleştirildiğinde, en az bir larvayı en kısa sürede her istila yakarışın içine aktarmak ve istenilen istila süresi için zamanlayıcıyı ayarlamak için yumuşak dokunma forsepsleri kullanın. Tüm larvaların yediğinden emin olmak için beslenmeyi gözlemleyin, gerektiğinde beslenmeyen larvaları değiştirin.
Istila süresinin sonunda tüm yaprakların tüm larvaları çıkarın ve hasat için zamanlayıcı başlatın. Her hasat zaman noktasının sonunda, her yaprağı ilgili tüpe aktarın ve rna izolasyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede depolanmadan önce yaprak örneğini dondurmak için tüpü hemen sıvı nitrojene bırakın. Sağlıklı ve doğru şekilde sahnelenmiş larvalar yaprak yüzeyine yerleştirildikten hemen sonra beslenmeye başlamalı ve beslenme istila süresi boyunca oldukça tutarlı bir şekilde devam etmelidir.
Bu yaprağın altındaki larva herhangi bir bitki materyali tüketmedi ve başarısız bir istilaya bir örnektir. Bu yapraklar iki haftalık nodal yayılan doku kültür bitkilerinden ayrılmış ve her larva evresi için farklı oranlarda ve beslenme stillerinde tüketildi. Bu sonuçlara dayanarak, dördüncü instar larvaları daha da daha yakın alan yetiştirilen patates bitkileri yaklaşık daha olgun toprak yetiştirilen patates bitkileri için yaprakların zarar değerlendirmek için seçildi.
Bu gen ekspresyonu çalışmalarında, M.sexta otunu sağlam bir şekilde yanıt veren iki yeni C2H2 çinko parmak transkripsiyon faktörü, istila tahlillerinde müstakil yaprakların kullanımını destekleyen tanımlanmıştır. Yaş ve boyut eşleşen yaprakları kullanmayı unutmayın ve düzgün her deneme için larvaları düzgün sahnelemek için tekdüzelik daha çoğaltılabilir veri sonuçları olarak. Yaprak dokuları stres etekli reaktif oksijen türleri ve jasmonik asit hormonu türevleri için teşite edilebilir.
Tüm transkripsiyon, proteom veya mikrobiyom çalışmaları da yaprak dokuları üzerinde yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, böcek otlamasına yanıt olarak bitki gen ekspresyonunu ölçmek için sadeleştirilmiş bir yaklaşım kullanmaktadır. Ayrılmış patates yapraklarına Manduca sexta larvaları uygulayarak, araştırmacılar otlamanın gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini kolayca izleyebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki biyolojisi
- Böcek-bitki etkileşimleri
- Gen ekspresyon analizi
Arka Plan
- Böceklerin bitki yemesi, bitki sağlığını ve gelişimini önemli ölçüde etkiler.
- Bitkilerin otobur saldırılara verdiği yanıtların anlaşılması, tarımsal uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Bu etkileşimleri inceleyen geleneksel yöntemler karmaşık ve değişken olabilir.
- Ayrılmış yaprak deneyleri, deneyler için kontrollü bir ortam sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Herbivoriye yanıt olarak bitki gen ifadesini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Çeşitli bitki/böcek etkileşimlerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Gen ifadesi verilerinin tekrarlanabilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Manduca sexta larvalarının ayrılmış patates yapraklarına uygulanması.
- Kontrollü gözlem için yaprakların Petri kaplarında izole edilmesi.
- Deney sırasında böcek beslenme davranışlarının izlenmesi.
- Transkripsiyon faktörü homologlarının ekspresyonunun analiz edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Larvaların başarılı bir şekilde uygulanması, ölçülebilir gen ekspresyon değişikliklerine yol açar.
- Altı transkripsiyon faktörü homologunun ekspresyonu analiz edilmiştir.
- Veriler, yöntemin tekrarlanabilirliğini ve uyarlanabilirliğini desteklemektedir.
- Bulgular, bitkilerin herbivoriye verdiği yanıtların anlaşılmasına katkı sağlamaktadır.
Sonuçlar
- Protokol, bitkilerin böcek otlatmasına verdiği tepkilerin incelenmesi için güvenilir bir çerçeve sunar.
- Uygun kontrollerle çeşitli bitki/böcek etkileşimlerine uyarlanabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, daha geniş ekolojik etkileri araştırmak için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Ayrık yaprak deneyleri, bitki-böcek etkileşim çalışmalarındaki biyolojik değişkenliği azaltarak tarımsal biyoteknolojide hedef doğrulaması için daha tekrarlanabilir gen ekspresyon verilerinin elde edilmesini sağlar. Bu modernize edilmiş yaklaşım, erken sinyal iletim olaylarını kontrollü ve ölçeklenebilir bir sistemde izole ederek, herbivori yanıt yollarının mekanistik riskten arındırılmasını destekler. Yöntem, ürün koruma özelliği geliştirmesiyle ilgili transkripsiyon faktörlerinin ve sinyal düğümlerinin tanımlanmasında öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kemiren böcek herbivorisitesine verilen transkripsiyonel yanıtların sorgulanmasını sağlayarak, C2H2 çinko parmak transkripsiyon faktörleri gibi aday genlerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Operasyonel Değer: Yaprakların infestasyon öncesinde koparılmasıyla deneysel iş akışını basitleştirir, alan gereksinimlerini azaltır ve hedef tarama için kapasiteyi artırır.
- Stratejik Değer: Bitki savunma yollarındaki hipotezlerin test edilmesini kolaylaştırarak, ürün geliştirme süreçlerinde özelliklerin önceliklendirilmesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tanımlanmış herbivori perturbasyonlarına yanıt olarak gen ekspresyon değişikliklerini nicelleştirmek için standartlaştırılmış bir platform sağlar.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirliği sağlamak ve larval beslenme davranışının izlenmesini kolaylaştırmak için Petri kabı tabanlı yaprak muhafazası kullanır.
- Stratejik Değer: Bitki-böcek sistemleri genelinde adaptasyona olanak tanıyarak agrokimyasal ve özellik keşif programlarında geniş uygulanabilirliği destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Reaktif oksijen türleri ve jasmonik asit türevleri gibi stres belirteçlerinin aşağı akış analizine olanak tanıyarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Operasyonel Değer: Yaprak dokularının tüm transkriptom, proteom veya mikrobiyom profillemesine izin vererek, özellik değerlendirmesinde multi-omik entegrasyonunu geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken gen ekspresyon yanıtlarını herbivori direncindeki fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek translasyonel sürekliliği güçlendirir.
Süreç Akışı ve İş Akışı Entegrasyonu
Ayrık yaprak deneyi, ürün özelliği geliştirme sürecinde öncü aday belirleme aşamasına geçmeden önce, erken aşama hipotez testlerine ve yolak aydınlatılmasına olanak tanıyarak keşif biyolojisi evresine uygunluk sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Herbivori kaynaklı sinyal yolaklarının hipotez testlerini destekler ve erken savunma yanıtlarında transkripsiyon faktörlerinin rollerini netleştirir.
- Tarama: Standartlaştırılmış yaprak hazırlama ve kontrollü enfestasyon koşulları aracılığıyla analiz hazırlığı sağlayarak tekrarlanabilir kantitatif çıktılar sunar.
- Analitikler: Enfestasyon uygulanmış koşullar ile kontrol koşullarının karşılaştırılmasına olanak tanıyan gen ekspresyon verileri oluşturarak tedavi etkilerinin istatistiksel değerlendirmesini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Fenotipik dirençle bağlantılı hormon türevlerinin ve oksidatif stres belirteçlerinin analizine izin vererek preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla bitki-böcek etkileşimi genelinde yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görerek özellik keşif programlarındaki yeniden geliştirme maliyetlerini düşürür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tüm bitki değişkenliğinden kaynaklanan gürültüyü azaltıp yaprağa özgü sinyallere odaklanarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Basitleştirilmiş yaprak koparma ve Petri kabı tabanlı analiz formatı aracılığıyla standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken savunma yanıtları hakkında güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlayarak özellik geliştirmedeki devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Tutarlı herbivori yanıtlı ekspresyon modellerine dayanarak aday genlerin riske göre ayarlanmış önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Bitki doku kültürü, larva evreleme ve RNA izolasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Steril aletlere, kontrollü büyüme kabinlerine ve RNA koruma altyapısına (sıvı azot, -80°C depolama) bağımlıdır.
- Deneysel tekdüzeliği sağlamak için yaprak yaşı, boyutu ve larva instar seçiminin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı bitki türlerine veya değişken beslenme davranışlarına sahip böcek herbivorlarına genişletilirken adaptasyon hususlarının değerlendirilmesini gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında sağlıklı, tekdüze evrelendirilmiş larvalara olan ihtiyaç ve analiz süreci boyunca tutarlı beslenmeyi doğrulamak için dikkatli izleme yer alır.
