Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama
March 19th, 2019
Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.
Bu numune hazırlama tekniği, ultrayapı korumanın en iyi kalitesini, odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobunda görüntüleme yöntemi için en uygun kontrastla birleştirmek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol özellikle güvenilir bir ultrayapı nın korunması için yüksek basınç dondurma ile hazırlanması gereken ancak hacim görüntüleme için donma sırasında yeterli kontrast alamayan numuneler için kullanışlıdır. Minimal reçineler gömme için daha sonra odaklanmış iyon ışını tarama elektron mikroskobunda doğru hedeflemeye izin vermek için mümkün olduğunca çok reçin çıkarmak esastır.
Başlamak için, kesme paspas% 20 PVP PBS bir damla damla için pipet kullanın. Damlacık içinde parçalanmış nervus tibialis batırın. Örneğin iki milimetre uzunluğunda kesmek için neşter kullanın.
Numuneyi 0,2 milimetre derinliğinde a metal numune taşıyıcısına yerleştirmek için ince pratisyen ler kullanın. Taşıyıcıyı kartuşun orta plakasına aktarın. Heksadecane kaplı Tip B taşıyıcıyı üst kapağın üzerine yerleştirin.
Kartuşun üst yarısını indirerek montajı kapatın. Yüksek basınçlı dondurucunun yükleme istasyonundaki üç parçalı kartuşunu kapatın. İşlem düğmesine basın ve üreticinin kullanım talimatlarına göre ilerleyin.
Sıvı nitrojen banyosunda, numune taşıyıcılarını iki mililitre dondurulmuş tannik asit ve aseton içeren kriyo şişelere yerleştirin ve kapakları kapatın. Kriyo şişelerini eksi 90 santigrat derece olarak ayarlanmış donma ikame ünitesine yerleştirin. Programı başlatın ve örnekleri 100 saat orada tutun.
Dondurma ikame ünitesinde, örnekleri iki mililitre aseton ile üç kez 30 dakika yıkayın. Soğutma için donma ikame ünitesiiçine% 2%osmiyum tetroksit yerleştirin ve eksi 90 santigrat derece de yedi saatlik boyama devam örneklerine ekleyin. Dondurma ikame ünitesindeki program sıcaklığı eksi 20 dereceye ulaştığında, numuneleri 16 saat daha orada tutun.
Sıcaklık 4 santigrat dereceye yükseldiğinde, şişelerde sıvı atın ve saf aseton doldurun. Dondurucu ikame ünitesinden kriyo şişelerini çıkarın. Numune ciddi şekilde zarar görebildiği için donma dan önce ve osmofication sonrası numune işleme sayılsa çok önemlidir.
Bir duman kaputunda, kriyo şişelerinden metal taşıyıcıları çıkarmak için ince çömeçler kullanın ve aseton dolu 150 milimetre derinliğindeki cam çanak tanınıp taşıyıcılardan numuneleri aktarın. Örnekleri aseton dolu iki mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarmak için ince prömiyer kullanın. Mikrodalgayı 40 saniye boyunca 250 watt'a ayarlayın ve numuneleri yıkamak ve dört kez tekrarlamak için mikrodalgayı çalıştırın.
Pipet reaksiyon tüpü içine% 1 tiyocarbohidaz çözeltisi bir mililitre ve mikrodalga koydu. Vakum fonksiyonunu iki dakika açık ve iki dakika kapalı olarak açın, toplam 14 dakika boyunca yineleyin ve 150 watt'a ayarlayın. Mikrodalgayı çalıştır.
Numuneyi daha önce olduğu gibi dört kez aseton içinde yıkayın. Pipet reaksiyon tüpü içine% 2 osmiyum tetroksit çözeltisi bir mililitre. Mikrodalga ya da tiyotocarbohydrazide ile aynı mikrodalga ayarlarını kullanın.
Numuneyi daha önce olduğu gibi dört kez aseton içinde yıkayın. Pipet reaksiyon tüpü içine aseton% 25 rezorin bir mililitre ve mikrodalga koydu. Vakum fonksiyonunu üç dakika açın ve 250 watt'a ayarlayın.
Mikrodalgayı çalıştır. Reaksiyon tüpü nden nervus tibialis kaldırmak ve plastik film bir parça üzerine yerleştirmek için bir kürdan kullanın. Rekariyi ısıtmak için numunelerin yakınına bir halojen lamba yerleştirin.
Kürdan kullanarak, kalan rezorin tespit edilene kadar numuneyi plastik film üzerinde hafifçe itin. Fırında üst örnek ile plastik film koyun ve en az 48 saat boyunca numunepolimerize etmek için 60 santigrat derece sıcaklık ayarlayın. SEM saplama uygun bir boyutta plastik film ile birlikte polimerize örnekleri kesmek için bir jilet kullanın.
SEM saplamalar üzerinde iletken gümüş rezorin eklemek ve kesme örnekleri eklemek için bir kürdan kullanın. Ve sonra örneklerin etrafına reşin ekleyin. En az 4 saat veya bir gecede 60 santigrat derecede polimerize için fırına SEM saplamalar koyun.
Polimerizasyondan sonra SEM koçanları bir sputter kaplamaya yerleştirin. Sputter coater'ı 35 miliamperes olarak ayarlayın ve 10 nanometre kalınlığında altın kaplama veya paltoyu bir dakika uygulayın. Kaplamadan sonra SEM saplamalarını elektron mikroskobu taramalı iyon ışınının içine yerleştirin.
Bu çalışmada, farenin nervus tibialis'i ve C.elegans için, odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu ile 3Boyutlu hacim görüntülemesi yapmak için optimum koruma ve kontrastı göstermek için geliştirilmiş bir protokol yapılmıştır. Standart protokoller genellikle gelişmiş protokol güçlü bir membran kontrastı sağlar ken membran kontrast eksikliği muzdarip. Gelişmiş protokol ve standart protokol ile C.elegans kesit görüntüleri belirgin bir fark göstermektedir.
Nervus tibialis'in kesit görüntülerinin yanı sıra, geliştirilmiş protokol standart protokole göre daha güçlü bir membran kontrastı göstermeye yardımcı olur. İşlem sonrası, elektron mikroskobu verileri bir görüntü işleme ve modelleme programı olan IMOD kullanılarak görselleştirilmiştir. Mavi vurgulu alan parçalı aksongösterir.
Kırmızı vurgulu alan Remak demetlerini gösterir. Sarı ve turuncu vurgulu alanlar miyelin kılıflarını gösterir. Ve turkuaz vurgulanan alan mitokondri gösterir.
Sanal emanet ve üç boyutlu model ince doku mimarisini gösterir ve işlevini anlamaya yardımcı olur. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu ve dizi tomografisi gibi diğer hacim taramalı elektron mikroskobu yöntemleri de kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda iletim elektron mikroskobu ve merkezi sinir sisteminden örnekler gibi diğer örnek türleri için de kullanılabilir.
Osmiyum tetroksit, tiyokarbohidrozide ve uranyal asetat toksik kimyasallardır ve dikkatli kullanılmalıdır. Reşin de zararlıdır ve özenle kullanılmalıdır. Tam protokol için eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.
Genel Bakış
Bu çalışma, yüksek ultrayapı korunumu ve görüntülemede kontrast iyileştirilmesi için yüksek basınçlı dondurma ve mikrodalga destekli işlemeyi birleştiren gelişmiş bir numune hazırlama protokolü sunar. Fare tibia siniri ve Caenorhabditis elegans model sistemleri kullanılarak, teknik membran kontrastı ve 3D görüntüleme yeteneğinde standart protokollere göre önemli avantajlar gösterir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Mikroskopi
- Görüntüleme teknikleri
- Numune hazırlama
Arka Plan
- Etkili görüntüleme için ultrayapı korunumu kritiktir.
- Standart protokoller genellikle belirli dokular için yeterli kontrast sağlamakta başarısız olur.
- Birden fazla tekniğin birleştirilmesi, görüntüleme sonuçlarını iyileştirebilir.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek basınçlı dondurma ve mikrodalga destekli numune işleme
- Fare tibia siniri ve Caenorhabditis elegans
- Odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM)
Ana Sonuçlar
- Gelişmiş protokol, standart yöntemlere kıyasla daha iyi membran kontrastı sağlar.
- Kesitler, yapısal görselleştirmede belirgin farklılıkları göstermektedir.
- Bulgular, protokolün detaylı 3D hacim görüntüleme için etkinliğini destekler.
Sonuçlar
- Bu çalışma, belirli işleme tekniklerinin birleştirilmesinin görüntüleme kalitesini önemli ölçüde iyileştirdiğini gösterir.
- Protokol, çeşitli biyolojik örnekler için geçerlidir ve doku mimarilerinin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical gap in ultrastructural imaging where standard high-pressure freezing fails to deliver sufficient contrast for volume imaging in FIB-SEM. By enhancing membrane contrast through microwave-assisted staining and minimal resin embedding, it enables reliable 3D reconstruction of neural tissues. This supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience discovery pipelines by providing predictive, high-fidelity structural data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through preserved ultrastructure and enhanced membrane contrast in neural tissues.
- Operational Value: Reduces ambiguity in target engagement studies by providing clear visualization of axonal and myelin architectures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantitative ultrastructural outputs for downstream compound screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through consistent contrast enhancement and minimal resin embedding.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by preserving fine-tissue architecture in central nervous system samples.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation via reproducible 3D volume data generation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical evaluation, particularly for neuroscience-focused programs requiring structural validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving subcellular structures critical to neural function.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, high-contrast samples suitable for automated FIB-SEM imaging workflows.
- Analytics: Generates quantitative morphometric readouts (e.g., axon diameter, myelin thickness) that enable comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling tissue architecture relevant to disease mechanisms in neuropathies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ultrastructural validation across multiple neural target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in neural ultrastructure.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sample preparation for high-volume imaging campaigns.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable structural biomarkers, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of neural targets based on validated ultrastructural phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in high-pressure freezing, microwave-assisted processing, and electron microscopy is required.
- Access to high-pressure freezers, microwave processors, FIB-SEM, and sputter coaters is essential.
- Cross-team standardization between histology, imaging, and data analysis units is necessary for consistent results.
- Adaptation across model systems (e.g., mouse, C. elegans, human tissue) requires optimization of staining and embedding times.
- Practical limitations include handling of toxic reagents (osmium tetroxide, uranyl acetate) and extended processing times for freeze substitution and polymerization.
