Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır
15 Mart 2019
Bu iletişim kuralı retrogradely taşınabilir bir viral vektör enjeksiyon sıçan spinal kord doku içine gösterir. Vektör sinaps kapladığı ve hedef nöron hücre gövdesi nakletti. Bu model önemli spinal yolları veya gen terapisi uygulamaları için hedefleme hücrelerin retrograd izleme için uygundur.
Viral vektörler, kusurlu genleri telafi etmek, önemli büyüme proteinlerini düzenlemek veya nöral devreleri izleyen işaretler üretmek için hücrelere genetik materyal imal edebilir. Sinir sistemine viral vektörler getirilmesi doğuştan gelen biyolojik engeller nedeniyle zordur. Omurilik dokusuna doğrudan enjeksiyon bu engelleri atlar, hücre organları veya sinapserişim için izin.
L1 ile L4 spinal düzeylerini doğru bir şekilde hedeflemek zor olabilir. Hedefi doğrulamak ve bu segmentlerin T11'den T13 omurlarına doğru iletiyi hatırlamak için yer işaretlerini kullanmak önemlidir. İşlem günü, enjektörü mikro pompaya takın ve mikro pompayı vernier ölçeğine sahip bir mikromanipülatöre yerleştirin.
Renkli bir boyayı cam iğnelerden birine dikkatlice yüklemek ve cam iğneyi enjektöre yerleştirmek için esnek bir iğneyle şırınga kullanın. Daha sonra iğnenin yıkıtakanların içine doğru şekilde tohumlandığını ve enjektör kapağının sıkıca vidalandığını ve çelik enjektör iğnesinin cam iğnenin uzunluğunun yaklaşık dörtte üçü kadar uzatıldığını doğrulayın. İşleme başlamadan önce, en az bir mikrolitre, artı dondurucu depolama enjeksiyon başına ekstra virüs küçük bir hacim çözülme, ve anestezili sıçanda parmak çimdik yanıt eksikliği onaylamak.
Kalçalardan hayvanın skapulae inferior açısına dorsal orta hat boyunca tıraş, daha kolay ve daha hassas bir tıraş için cilt gergin çekerek, ve sıralı 5% iyot ve% 70 etanol scrubs ile maruz kalan cilt dezenfekte. Her iki göze de oftalmik merhem uygulayın. Sonra steril bir bez üzerine hayvan yerleştirin ve herhangi bir idrar toplamak için mesane altına gazlı bez yerleştirin.
Deri kesiğinin yerini belirlemek için, L1 omurunu bulmak için son kaburgada parmakları hafifçe bastırın. Bir dönüm noktası olarak bu omur kullanarak ve neşter ile sıkıca bastırırken nazik yayılarak cilt gergin tutarak, kas ortaya çıkarmak için L1 sadece aşağı biten üç ila dört santimetre derili kesi yapmak için bir numara 10 cerrahi bıçak kullanın. Spinous süreçleri hissetmek için forseps ve makas kullanın.
Oda fare diş forceps ile bir üst süreç üzerine güvenli bir şekilde kapmak için izin vermek için küçük rostral kesim olun. Ve süreçlere mümkün olduğunca yakın iki uzun, derin kesik yapın. Yerinde lateral kasları güvence altına aldıktan sonra, kafalarının şeklini belirlemek için süreçleri etrafında kas temizleyin.
Daha sonra laminektomi bölgesini belirlemek için spinous süreçlerin başlarının şekillerini görselleştirin. T11 ve birebir T12 ve T13 süreçleri laminektomi nin yapıldığı yer olacaktır. Hedef alan doğru bir şekilde tespit edildikten sonra, intervertebral ligamentleri ortaya çıkarmak için omurları yavaşça yayın ve spinöz proseslerin küçük ısırıklarını ve omurların sırt yönüne sahip rongeurs kullanın.
Orta hat kan damarı görülebilir böylece orta hat kemik uzak kemik temizleyin, açıkça omurilik dokusu ortaya koyan bir pencere bırakarak ve enkaz ücretsizdir. Daha sonra stabilize forceps spinous süreçleri rostral ve kaudektomi penceresine bir omurilik tutucu hayvan güvenli tutmak için sabitlemek. Ve nefes alma hareketlerinin etkisini inkar etmek için hayvanın karnını kaldırın.
Virüsü enjektöre yüklemek için, pipet çözülmüş stokun yaklaşık beş mikrolitresini Parafilm parçasına yerleştirin ve cam iğneleri ucun içinde olacak şekilde yerleştirin. Saniyede 20 ila 100 nanolitre hızla en fazla dört mikrolitre virüs çekmek için mikro pompakullanın ve bloke olmadığından emin olmak için iğne ucundan virüs küçük bir miktar bırakmadan önce enjekte etmek için denetleyici ayarlayın. Herhangi bir fazla virüsü laboratuvar mendille silin ve mikromanipülatörleri yerleştirin, böylece vernier ölçeği görünür.
İğneyi omuriliğin orta çizgisine yerleştirin ve iğneyi yanal olarak 0,8 milimetre yönlendirmek için mikromanipülatördeki veronis ölçeğini kullanın. Sonra girintisi kadar omurilik akor için iğne indirin, ama delinme değil, dura, ve iğne ucu 1,5 milimetre derinliğe battı kadar iğne ile dura delmek için hızlı bir büküm hareketi kullanın. İğne yerleştirildikten sonra, enjektörü dakikada 400 nanolitre hızla virüsü teslim etmesi için programlayın ve virüsün boya nın ön kısmındaki ilerlemeyi gözlemleyerek omurilik akoruna girdiğini doğrulayın.
Enjeksiyon bittikten sonra, iğnenin virüsün yayılmasını kolaylaştırmak için iki ila beş dakika omurilikte dinlenmesine izin verin, bir sonraki enjeksiyon yerinde konumlandırma için iğneyi yavaşça geri çekmeden önce. Son enjeksiyondan sonra, lateral kas yaymak için kullanılan herhangi bir cihazların kaldırılmasına izin vermek için omurilik tutucu hayvan çıkarın. Sonra bir 4.0 kromik katgut sütür ile kas kapatın ve dokuz milimetrelik yara klipleri ile cilt zımba.
Başarılı bir enjeksiyondan dört hafta sonra, yan taraftaki torasik omuriliğin gri maddesi içindeki nöronlarda, enjeksiyona ipsilateral olarak anlamlı GFP ekspresyonu gözlenir. Beyaz maddede, GFP ekspresyonu ipsilateral kordondaki aksonlarda, özellikle propriospinal aksona özgü alanlarda gözlenir. Gri madde nöronların daha yüksek büyütme nöronal hücre organları ve dendritler tipik bir sinyal ekspresyonu bir örnek ortaya koymaktadır.
Nöronlarda GFP ekspresyonu da beyin sapı çekirdeklerinde görülebilir, pontin retiküler formasyon gibi. Başarılı bir omurilik enjeksiyonu prosedürü için önemli faktörler doğru vertebral hedefleme ve virüs doku ya giriyor sağlanması eğer bir rostral omurilik yaralanması bu işlemden önce yapılırsa, doğrudan enjeksiyon yaralanma etrafında bağlantıları yeniden nöronlar izlemek için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, sıçan omurilik dokusuna retrograd olarak taşınabilen viral bir vektorun enjeksiyonu gösterir ve sinir devrelerinin izlenmesini ve potansiyel gen terapi uygulamalarını mümkün kılar. Prosedür, vektorun sinapsta alınıp hedef nöronların hücre gövdesine taşınmasını sağlayarak omurilik yollarına dair bilgiler sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gen terapisi
- Nöroanatomi
Arka Plan
- Viral vektorler, kusurlu genleri telafi edebilir ve hücrelere genetik materyal taşıyabilir.
- Omuriliğe doğrudan enjeksiyon, etkili hedefleme için biyolojik bariyerleri atlar.
- Omurilik seviyelerinin doğru hedeflenmesi, başarılı sonuçlar için kritik öneme sahiptir.
- Omurga gibi döner noktalar, cerrahi yaklaşımda yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Omurilik içine viral vektorlar enjekte etmek için detaylı bir protokol sunmak.
- Omurilik yollarının retrograd izlenmesini sağlamak.
- Gen terapi uygulamalarında araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, sıçan omuriliğe doğrudan cerrahi enjeksiyon içerir.
- Hedef alan, L1'den L4'e kadar vertebral seviyeleri kapsar ve doğru hedefleme için döner noktalar kullanılır.
- Viraj vektorlerinin enjeksiyonu ve izleme için belirli zaman dilimleriyle dikkatli uygulanması ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Enjeksiyon sonrası gözlemler, nöronlarda GFP ekspresyonuna odaklanır.
Ana Sonuçlar
- Başarılı enjeksiyon, komşu nöronlar ve aksonlarda önemli GFP ekspresyonuna yol açar.
- Ortaya çıkan nöronal yollar, viral vektorun retrograd taşıma etkinliğini gösterir.
- GFP ekspresyon paternleri, torasik omurilikte başarılı hedefleme ve taşımayı gösterir.
- Sonuçlar, başarılı uygulamalar için doğru vertebral hedeflemenin önemini vurgular.
Sonuçlar
- Bu çalışma, viral vektorların omuriliğe enjeksiyonu için güvenilir bir metodoloji sunar.
- Prosedür, nöronal bağlantı ve potansiyel gen terapi stratejileri hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
- Nöral devrelerin izlenmesi ve belirli nöronal popülasyonların hedeflenmesi için önemli sonuçlar taşır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Direct spinal cord injection of lentiviral vectors enables targeted delivery of genetic material to specific neuronal populations, bypassing biological barriers that limit systemic approaches. This method supports mechanistic de-risking in target validation by allowing precise tracing of motor pathways such as rubrospinal and reticulospinal tracts. The approach provides predictive confidence in preclinical models by revealing neuronal connectivity patterns relevant to motor circuit function and repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing specific spinal motor pathways and their interconnections.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation through retrograde transport of viral vectors to neuronal cell bodies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying pathway engagement and neuronal uptake efficiency in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining neuronal targets with high anatomical fidelity.
- Operational Value: Ensures assay standardization through consistent viral delivery to propriospinal interneurons and brainstem nuclei.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across spinal cord segments and injury models for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates continuity from discovery to preclinical validation by mapping GFP expression in thoracic spinal cord and pontine reticular formation.
- Mechanistic De-risking: Highlights age-dependent integration patterns that inform risk-adjusted advancement decisions in neurodegenerative models.
- Predictive Confidence: Supports biomarker alignment by identifying neuronal populations that reestablish connections post-injury.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation, particularly for motor circuit disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling retrograde tracing of spinal pathways to clarify motor circuit architecture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized viral injection and quantitative GFP expression readouts in defined neuronal populations.
- Analytics: Provides quantitative measurements of transduction efficiency and axonal transport that help compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by tracing neurons that reestablish connections around injury sites, informing repair mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for spinal cord targeting across multiple disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spinal motor pathway engagement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through landmark-based targeting and controlled viral delivery parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biological de-risking of targets involved in motor circuit function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on neuronal uptake patterns and pathway-specific transduction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent spinal surgery and microsurgical techniques for accurate vertebral targeting.
- Depends on microsyringe pumps, micromanipulators with vernier scales, and sterile surgical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of viral titer, injection volume, and post-operative monitoring protocols.
- Involves adaptation considerations across rodent ages and injury models due to observed age-dependent integration into corticospinal tracts.
- Limited by the need for precise dorsal laminectomy and spinal stabilization to avoid tissue damage during needle insertion.
