Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Bu yöntem hücresel ve tissular düzeyde miyelinasyon ve remiyelinasyon temel mekanizması çalışma sağlar. Bu teknik, birincil kültürler ve in vivo yaklaşımlar arasındaki kavşakta yer almaktadır. Doku mimarisini korumanın ana avantajıile hızlı ve erişilebilir bir modeldir.

Prosedürü gösteren Melina Thetiot, bir doktora sonrası araştırmacı ve Remi Ronzano, benim laboratuvar bir doktora öğrencisi olacaktır. Başlamak için, foramen magnum içine yavaşça küçük bir makas yerleştirin ve yan doğru bir yanal kesi yaparak kafatası kesti, ve sonra baş kafatası etrafında tüm kesti. Kafatasının dorsal kısmını almak için, kafatasının dorsal kısmını dikkatlice kaldırmak için ince, düz forseps kullanın.

Sonra dikkatlice ventral kafatası ve beyin arasındaki pikiyeler tanıtmak. Yavaşça beyin dışarı çevirmek ve küçük makas ile optik ve trigeminal sinirler kesti. Daha sonra, beynin yerçekimitarafından düşmesine yardımcı olmak için buz gibi diseksiyon ortamı içeren 60 milimetrelik hücre kültür çanağının hemen üzerinde baş veya kafatasının sırt kısmını ters çevirin.

İnce forceps kullanarak, sırt tarafı yukarı bakan ve ventral tarafı yatarken beyin yönlendirmek. Dürbün mikroskobu altında, ön beyin tarafında beyin hareketsizleştirmek için ince, düz forseps kullanın. Sonra arka beyni beynin geri kalanından ayırın.

Serebellumun altındaki serebellar peduncles kes arka beynin geri kalanından beyincik ayırmak için. Beyincik izole olduktan sonra, dikkatle menenjler yırtmak için ince, düz forceps kullanın. Serebellum hafifçe ince, kavisli forceps ile tutun ve plastik platform üzerine dorsal tarafı ile yerleştirin, helikopter jilet dik.

Sonra, bir mililitrelik pipete bağlı steril, ince uç pipet ucu ile, beyincik etrafında diseksiyon ortamı herhangi bir erişim aspire. Sonra, bir doku doğrama ile, serebellumun 300 mikrometre kalınlığında saggital kesitleri dilim. Daha sonra, yavaşça dilimlenmiş beyincik üzerine diseksiyon ortamı bir damla ekleyin.

Daha sonra, bir mililitrelik pipete bağlı geniş bir domuz pipet ucu ile, yavaş yavaş dilimlenmiş beyincik aspire ve buz soğuk diseksiyon ortamı içeren 60 milimetrehücre kültür çanak geri aktarın. Ardından, tek tek dilimleri ayırmak için iki ince, düz forceps kullanın. Daha sonra, bir mililitrelik pipete bağlı geniş bir domuz pipet ucu ile, vermis dört seçilen dilimler kadar aktarın, altı iyi plaka bir kültür eklemek üzerine bazı diseksiyon ortamı ile birlikte.

İnce bir uç pipet ucu kullanarak dilimlerin etrafındaki diseksiyon ortamına erişimi kaldırın. Demiyelinasyon için, altı gün in vitro sonra kültür ekler altında tüm kültür ortamı kaldırmak ve mililitre LPC başına 0,5 miligram içeren önceden ısıtılmış, taze kültür ortamı kuyu başına bir mililitre ile değiştirin. %5 karbondioksit ortamında 37 santigrat derecede 15 ila 17 saat kuluçkaya yat.

Kuluçkadan sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren 25 mililitrelik Petri kabına yerleştirerek kesici uçları yıkayın. Sonra, hemen taze, önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren yeni, altı iyi plaka, kültür ekler aktarın. İmmünohistokimyaya başlamak için, ilk olarak kültür kesici uçlarını kaldırmak ve altlarındaki kültür ortamını kaldırmak için forseps kullanın.

Daha sonra, serebellar dilimleri düzeltmek için membran ekler üzerine 1x PBS, ph 7.4, % 4 PFA iki mililitre ekleyin. 30 dakika sonra, 10 dakika her yıkama için 1x PBS iki mililitre ile dilimleri üç kez yıkayın. Daha sonra, dürbün mikroskobu altında, 25x için 30x büyütme kullanarak, hafifçe membran ekler dilimleri ayırmak için bir neşter veya fırça kullanın.

Ardından, yüzen dilimleri antikor tüketimini sınırlamak için 1x PBS içeren dört kuyu plakasının kuyularına aktarmak için bir fırça kullanın. Daha sonra, her kuyudan PBS aspire ve eksi 20 derece santigrat derecede önceden soğutulmuş% 100 etanol dilimleri inkübe 15-20 dakika. Kuluçkadan sonra% 100 etanol aspire ve 1x PBS ile kısa bir süre dilimleri yıkayın.

Daha sonra, 10 dakika her yıkama için 1x PBS ile oda sıcaklığında iki kez yıkayın. Spesifik olmayan antikor fiksasyon bölgelerini engellemek için PBS'yi aspire edin ve dilimleri oda sıcaklığında %0,3'ü iyonik olmayan deterjan içeren bir çözeltide 30 ila 45 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bloke çözeltisi seyreltilmiş birincil antikorlar ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat dilimleri inkübün.

Bir gece kuluçka sonra, 10 dakika her yıkama için 1x PBS ile dilimleri üç kez yıkayın. Daha sonra bloklama çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorları 1 ila 500 seyreltme oranında ekleyin ve dilimleri üç saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sekonder antikor ile kuluçkadan sonra, dilimleri her yıkamada 10 dakika karanlıkta 1x PBS'de üç kez yıkayın.

Daha sonra, dürbün mikroskobu altında, slayt üzerine 1x PBS 100 mikrolet yerleştirin ve bir fırça ile, PBS içine dilimleri aktarın ve slayt üzerinde düzleştirmek. PBS'nin tüm erişimini kaldırın. Son olarak, doğrudan cam kapak üzerine montaj ortamı bir damla yerleştirin ve yavaşça dilimleri kapağı.

Doğum sonrası 9 ila 10 C57 siyah altı yabani tip fareden elde edilen organotipik serebellar dilimlerde miyelin immünboyamalar, paranodal aksoglial kavşak etki alanı ile çevrili voltaj lı sodyum kanallarında zenginleştirilmiş ronvia düğümleri ile 11 gün in vitro olarak gözlendi. PLP-GFP transgenik farelerde de aynı sonuçlar gözlendi. Parkenji hücrelerinin miyelinasyonu çoğunlukla kültürde bir hafta sonra elde edilir.

LPC tedavisi tamamen spontan remyelinate ve tam miyelinated altı gün sonra demiyelinasyon dilimleri demyelinates. Bu yordam en fazla 25 dakika sürer. Gerçekten en kritik nokta.

Organotipik dilim kültürü miyelonik dinamiğinin canlı görüntüleme çalışması için uygundur. Ayrıca uyuşturucu tarama deneylerini hedeflemek için de kullanılabilir. Bu teknik, miyelinasyon ve remiyelinasyon süreçlerini incelemek için kolay ve nicel bir yaklaşım sağlar.

Deneyciler, hayvan refahı, aşırı ve keskin miyelinasyon için uygulanan temel güvenlik prosedürlerini takip etmek için vardır.